林下人參不同部位黃酮類成分分析

周曉敏　何霞紅　施蕊　李順美　張靖儀

摘 要 為明確林下人參不同部位黃酮類成分含量，提高人參的綜合利用水平。運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)分析了林下栽培4年人參的根、莖、葉的黃酮類成分，并通過(guò)代謝組學(xué)的方法篩選出不同部位的差異代謝物。結(jié)果表明：林下人參根、莖、葉中共檢測(cè)出92種黃酮類代謝物，包括41種黃酮醇、13種黃酮化合物、11種二氫黃酮、7種花青素、5種黃酮碳糖苷、5種異黃酮、5種查耳酮、4種二氫黃酮醇、1種其他類黃酮；并通過(guò)主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析法（Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA）篩選出27種差異代謝物，其中15種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞葉＞根，5種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為根＞莖＞葉，4種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞根＞莖，2種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞莖＞根，1種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞根＞葉?？偟膩?lái)說(shuō)，人參不同部位黃酮類成分存在差異，可為人參的進(jìn)一步研究與合理應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 人參；黃酮類成分；不同部位；代謝組學(xué)

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.04.029

人參是五加科人參屬多年生草本植物，是植物界的活化石，自古便有“百草之王”的美稱，被列為我國(guó)重點(diǎn)一級(jí)保護(hù)野生植物。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人參在治療心血管疾病、抗癌、抗腫瘤等方面均有明顯作用[1]。人參的各部位都含有很多的化學(xué)成分，并且有很好的藥性，因此當(dāng)前對(duì)人參各部位的研究也越來(lái)越多。徐艷陽(yáng)等研究表明，多酚含量最高的部位是人參葉，其次為莖和花，在根中的含量最低[2]。顧健等研究表明，人參皂苷20（R）-Rg2在人參花中的含量較高[3]。WU等研究表明，人參花蕾中總皂苷含量高，用來(lái)泡水喝有提神抗疲勞和增強(qiáng)免疫力的作用[4]。姚麗娜等用人參根和人參莖葉皂苷溶液給單獨(dú)飼養(yǎng)的小鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)人參根皂苷具有中樞鎮(zhèn)靜的功效，而莖葉皂苷則有相反的功效，會(huì)使小鼠興奮[5]。

黃酮類成分是天然藥用植物中常見(jiàn)的化學(xué)成分之一，在治療心血管疾病、抗病毒、抗腫瘤等方面有積極作用，尤其是在抗癌、防癌方面功效顯著，因此黃酮類成分在臨床醫(yī)療、食品、工業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[6-8]。人參中含有的黃酮類成分具有很高的藥效。張儒等研究發(fā)現(xiàn)，人參根中總黃酮能夠通過(guò)提高腦組織超氧化物歧化酶的活性來(lái)增強(qiáng)腦組織的抗氧化能力[9]。目前，人參化學(xué)成分的研究與應(yīng)用更多的集中于根部，對(duì)地上部分的研究較少，而且對(duì)人參化學(xué)成分的研究主要集中于皂苷類，對(duì)人參不同部位黃酮類成分的研究相對(duì)較少。因此，筆者運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)對(duì)林下人參不同部位黃酮類成分進(jìn)行測(cè)定和分析，篩選出不同部位的差異代謝物，為人參各部位藥用價(jià)值的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用林下4年生人參樣品采自遼寧省本溪縣東營(yíng)坊鄉(xiāng)南營(yíng)坊村林下人參種植基地（東經(jīng)41°29′8″、北緯124°7′25″，海拔310 m），選取人參根（L4-R）、莖（L4-S）、葉（L4-L）共3組樣品，每組樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)儀器和試劑

試驗(yàn)儀器：UPLC-MS/MS儀，來(lái)源于賽默飛世爾科技公司；Scientz-100F凍干機(jī)，來(lái)源于北京四環(huán)起航科技有限公司；Retsch MM400研磨儀，來(lái)源于上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；0.22 μm pore size微孔濾膜，來(lái)源于上海摩速科學(xué)器材有限公司；離心機(jī)；渦旋儀；三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP）。

試驗(yàn)試劑有甲醇（色譜純，Merck）、乙腈（色譜純，Merck）、標(biāo)準(zhǔn)品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）、超純水、0.1%甲酸、聚丙二醇。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備與提取

將人參根、莖、葉樣品分別放到凍干機(jī)中真空冷凍干燥后用研磨儀研磨成粉末狀，稱取100 mg粉末用

1.2 mL70%甲醇提取液溶解，用渦旋儀每30 min 渦旋

1次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，充分混勻后，將混合液用離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為12 000 r·min-1，吸取上清液，用微孔濾膜過(guò)濾樣品，放到進(jìn)樣瓶中保存，用儀器UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS檢測(cè)條件

液相條件：使用色譜柱Agilent SB-C18（1.8 ?m，2.1 mm×100.0 mm）進(jìn)行色譜分離；以加0.1%甲酸的超純水為流動(dòng)相A相，加0.1%甲酸的乙腈為B相進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：采用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀

（Q TRAP）進(jìn)行質(zhì)譜分析，系統(tǒng)配備ESI Turbo離子噴霧接口，操作參數(shù)設(shè)置如表1所示；在QQQ和LIT模式下分別用10 μmol·L-1和100 μmol·L-1聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)；碰撞氣體（氮?dú)猓橹械取?/p>

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

基于自建數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB（Metware Database），根據(jù)二級(jí)譜信息對(duì)樣品中黃酮類成分進(jìn)行定性分析，運(yùn)用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）對(duì)樣品中黃酮類成分進(jìn)行定量分析。用軟件Analyst 1.6.3進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，用MultiaQuant軟件打開(kāi)樣本下機(jī)質(zhì)譜文件，進(jìn)行色譜峰的積分和校正。對(duì)不同質(zhì)控（Quality Control，QC）樣本，即混合樣本質(zhì)譜檢測(cè)分析的總離子流圖（Total Ions Current，TIC）進(jìn)行重疊展示分析，根據(jù)TIC圖判斷代謝物提取和檢測(cè)的技術(shù)重復(fù)及可靠性。處理后的數(shù)據(jù)采用主成分分析法（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA）相結(jié)合的多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選差異變量，運(yùn)用R軟件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 林下人參黃酮類成分的定性定量分析

用UPLC-MS/MS法檢測(cè)得到多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式代謝物檢測(cè)多峰圖（見(jiàn)圖1），并基于自建數(shù)據(jù)庫(kù)從人參根、莖、葉中共檢測(cè)到92種黃酮類代謝產(chǎn)物，包括黃酮醇41種，黃酮化合物13種，二氫黃酮11種，花青素7種，黃酮碳糖苷、異黃酮和查耳酮各5種，二氫黃酮醇4種，其他類黃酮1種。

2.2 主成分分析

對(duì)樣本進(jìn)行主成分分析，初步了解人參根（L4-R）、莖（L4-S）、葉（L4-L）各樣本組間的總體代謝差異和組內(nèi)的變異度大小。PCA得分圖如圖2所示，圖中每一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離越遠(yuǎn)則表示差異性越大。由圖2可知，第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為45.39%，第二主成分的貢獻(xiàn)率（PC2）為41.18%，組內(nèi)呈現(xiàn)相互聚集的情況，組間有區(qū)分，說(shuō)明林下人參不同部位含有的黃酮類成分有所差異。OPLS-DA模型驗(yàn)證如圖3所示，R2X=0.914，R2Y=0.982和Q2=0.968，模型驗(yàn)證穩(wěn)定可靠。

2.3 具體差異代謝物篩選

基于OPLS-DA得到的結(jié)果，由表2可知，從92種黃酮類代謝物中共篩選出27種差異代謝物，其中黃酮醇12種，黃酮化合物6種，黃酮碳糖苷2種，異黃酮2種，二氫黃酮、二氫黃酮醇、查耳酮、花青素和其他類黃酮各1種。

對(duì)比27種差異代謝物，進(jìn)行進(jìn)一步分析可知，（3R）-5，7-二羥基-6，8-二甲基'-3-（4'-羥基芐基）-色烷-4-酮、卷柏石松素、2，4，2'，4'-四羥基-3'-異戊烯基查爾酮、檉柳苷、異檉柳苷、苜蓿素-4'-甲基醚-3'-O-葡萄糖苷、苜蓿素-7-O-葡萄糖二酸苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-7-O-葡萄糖苷（蔓菁苷）、澤蘭黃酮-7-O-葡萄糖苷、6-甲氧基山奈酚-3-O-葡萄糖苷、萬(wàn)壽菊素-3-O-蕓香糖苷、2'-羥基-5-甲氧基染料木素-4'，7-O-二葡萄糖、牽牛花素-3-O-（6"-O-咖啡酰）葡萄糖苷共15種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞葉＞根；5，7，8，3'，4'-五羥基-6-甲氧基氧雜蒽酮、異鼠李素-3-O-（6"-丙二酰）葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-（6"-沒(méi)食子酰）半乳糖苷、madreselvin A共5種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為根＞莖＞葉；4'-羥基-5，7-二甲氧基黃酮、金圣草黃素-8-C-葡萄糖苷-7-O-（6"-阿魏酰）葡萄糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷共4種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞根＞莖；芹菜素-7，4'-二甲醚和香橙素-7-O-葡萄糖苷2種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞莖＞根；檉柳黃素-3-O-（6"-丙二酰）葡萄糖苷在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞根＞葉。

3 結(jié)論與討論

人參中不同的黃酮類化合物具有不同的藥理作用，在臨床治療方面都具備一定的功能價(jià)值。有關(guān)研究表明，異鼠李素在沙棘、銀杏葉的研究較為廣泛，是一種天然的小分子黃酮類化合物，也因其在抗癌、抗腫瘤以及心血管等方面有一定作用而用于臨床治療[11-14]。槲皮素可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、侵襲、遷移，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)降低耐藥性[15]。天然的二氫黃酮具有抗癌、抗病毒等多種功能，但其在植物中含量較少，且提取困難，因此二氫黃酮人工化學(xué)合成在近幾年備受關(guān)注[16]。查耳酮由于其促進(jìn)抑癌基因表達(dá)、抑制腫瘤血管生成、抑制酪氨酸蛋白激酶表達(dá)，從而抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)抗癌機(jī)制在抗腫瘤領(lǐng)域引起廣泛重視[17-18]。此外，將查耳酮與其他抗菌藥效團(tuán)結(jié)合形成的雜合體，具有耐藥性低、活性高等優(yōu)點(diǎn)，能成為新型抗菌藥開(kāi)發(fā)的潛在候選物[17-18]。苜蓿素安全性好，因此也廣泛用于癌癥治療[19]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人參花黃酮在與其他類化合物的共同作用下，具有重要的抗疲勞、心血管保護(hù)、抗休克、抗腫瘤等功效[20-21]。崔福順等以人參莖葉黃酮苷元為芯材，對(duì)人參莖葉微膠囊化進(jìn)行了研究，為人參莖葉黃酮類化合物的研究和人參莖葉的應(yīng)用提供了更多的可能性[22]。在前人研究中，西洋參根中發(fā)現(xiàn)有黃酮類化合物的存在，西洋參不同部位總黃酮含量測(cè)定結(jié)果顯示為花＞果＞莖葉＞根[23-24]。李珂珂等從人參花蕾中首次分離出5個(gè)苯丙?；；S酮醇苷類化合物，均為山柰酚的黃酮母核[25]。

近年來(lái)，人參的研究一直處于較高的水平，在臨床應(yīng)用方面也有著較高的研究?jī)r(jià)值[26-27]。2012年，我國(guó)將人工種植的人參批準(zhǔn)為新資源食品，自此之后人參也從單一的中藥材擴(kuò)展到食品加工以及保健產(chǎn)品等多個(gè)方面，為我國(guó)人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展創(chuàng)造了新的機(jī)會(huì)，提供了新的平臺(tái)，因此對(duì)于人參功效及作用機(jī)理還需要更加深入和全面的研究。

此次研究通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析了林下4年人參根、莖、葉的黃酮類成分。此外，通過(guò)主成分分析法及正交偏最小二乘判別分析法對(duì)人參根、莖、葉中的黃酮類代謝物進(jìn)行組間差異性和組內(nèi)穩(wěn)定性檢測(cè)分析，并篩選出根、莖、葉中共有的黃酮類代謝物及3者間有差異的代謝物。結(jié)果共檢測(cè)到92種黃酮類代謝物，包括41種黃酮醇、13種黃酮化合物、11種二氫黃酮、7種花青素、5種黃酮碳糖苷、5種異黃酮、5種查耳酮、4種二氫黃酮醇、1種其他類黃酮；共篩選出27種差異代謝物，其中15種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞葉＞根，5種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為根＞莖＞葉，4種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞根＞莖，2種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為葉＞莖＞根，1種代謝物在林下人參各部位的含量從高到低依次為莖＞根＞葉。此次研究可為人參的綜合利用提供更多的可能性，同時(shí)為推廣林下人參栽培模式提供一定的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張春雨）

收稿日期：2024-01-11

基金項(xiàng)目：云南省重大科技專項(xiàng)（202102AE090042）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32260720）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21）；國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位項(xiàng)目（CARS-21-05B）；昆明市科技揭榜制項(xiàng)目（2021JH002）。

作者簡(jiǎn)介：周曉敏（1999—），在讀碩士，研究方向?yàn)轱L(fēng)景園林植物。

*為通信作者，Email：jingyi@swfu.edu.cn。