鰤?mèng)~諾卡氏菌疫苗對(duì)石斑魚(yú)免疫效果研究

高浩峰 邵蓬 武尊 吳雅婷 汪笑宇

摘要：為探究鰤?mèng)~諾卡氏菌滅活疫苗對(duì)石斑魚(yú)的免疫效果，通過(guò)免疫基因表達(dá)量分析疫苗對(duì)石斑魚(yú)的免疫保護(hù)。利用鰤?mèng)~諾卡氏菌制備福爾馬林滅活全菌疫苗，通過(guò)腹腔注射法對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)進(jìn)行免疫，利用熒光定量法檢測(cè)免疫后該魚(yú)的腎臟、肝臟和脾3個(gè)器官中TLR2、MyD88、TNF-α、IL-1β 免疫基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，注射滅活疫苗后，TNF-α、IL-1β 基因表達(dá)量在腎臟組織中較高，MyD88 基因表達(dá)量在脾組織中較高，TLR2 基因表達(dá)量在肝臟組織中較高；除脾組織中的TNF-α 基因相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)下降趨勢(shì)外，其余基因的表達(dá)量在所有器官中都呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì)。研究結(jié)果為探索珍珠龍膽石斑魚(yú)與諾卡氏菌的相互作用提供理論基礎(chǔ)，為漁業(yè)疫苗開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鰤?mèng)~諾卡氏菌；石斑魚(yú)；滅活疫苗；TLR2；MyD88；TNF-α；IL-1β

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0653

中圖分類(lèi)號(hào)：S941.51+6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）02014508

鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nocardia seriolae）引起的“結(jié)節(jié)病”是影響我國(guó)淡海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的重要疾病，近年來(lái)由于全球氣候變暖，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，因此研究魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)的特性對(duì)抗病魚(yú)類(lèi)、疫苗和免疫刺激劑的開(kāi)發(fā)非常重要[1]。鰤諾卡氏菌是一種革蘭氏陽(yáng)性好氧菌，在初期通常是隱性的，不易被發(fā)現(xiàn)，感染和發(fā)病過(guò)程漫長(zhǎng)，通常在成魚(yú)期才出現(xiàn)典型癥狀和顯著性危害[2]，從發(fā)病到死亡需要2 周左右，明顯發(fā)病時(shí)已較難治療。病魚(yú)肝、脾、腎等出現(xiàn)大量肉眼可見(jiàn)的白色結(jié)節(jié)，自然發(fā)病率為35%～60%，由于缺乏有效的治療方案，死亡率較高[3]，本研究制備鰤?mèng)~諾卡氏菌疫苗，通過(guò)免疫基因相對(duì)表達(dá)量的變化探討其免疫效果。

滅活疫苗是通過(guò)物理加熱、化學(xué)試劑等方法將微生物滅活后制成的疫苗?；瘜W(xué)滅活劑主要有甲醛、苯酚、氯仿等，其中，甲醛溶液（福爾馬林）在同等條件下滅活效果更具優(yōu)勢(shì)[4]。福爾馬林全菌滅活疫苗作為抵御傳染性疾病的生物制品，其 病原體失去致病能力而免疫原性未失效，可使接種對(duì)象獲得良好的免疫保護(hù)效果，刺激免疫系統(tǒng)以增強(qiáng)其非特異性和特異性免疫，有效避免病原體對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的危害，且不會(huì)在產(chǎn)品或環(huán)境中留下殘留物，還會(huì)降低動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生耐藥菌株[5]。

根據(jù)免疫相關(guān)基因在免疫過(guò)程中發(fā)揮的不同作用，免疫基因的表達(dá)情況被作為疫苗效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究通過(guò)對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)（♀ Epinephelus fuscoguttatus× ♂ Epinephelus lanceolatus）注射鰤?mèng)~諾卡氏菌全菌滅活疫苗，根據(jù)Ⅰ型跨膜蛋白（toll-like receptors，TLR）信號(hào)通路及細(xì)胞因子中部分免疫基因變化來(lái)觀察免疫效果。TLR2能夠識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌的磷壁酸、脂蛋白等并介導(dǎo)細(xì)胞活化和宿主炎癥反應(yīng)，TLR存在2種信號(hào)途徑，分別為MyD88依賴(lài)途徑和非MyD88依賴(lài)途徑，分別參與炎癥反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)，同時(shí)TLR也可以向參與適應(yīng)性免疫的T 細(xì)胞呈遞抗原[6]。由免疫細(xì)胞分泌的IL-1β和TNF-α是抵御外部病原攻擊引發(fā)炎癥反應(yīng)的第一介質(zhì)，其主要生理作用是誘導(dǎo)分化各種免疫細(xì)胞及產(chǎn)生各種趨化因子，并移至感染部位發(fā)揮免疫作用[7]。本研究使用滅活的鰤?mèng)~諾卡氏菌疫苗注射珍珠龍膽石斑魚(yú)，并分析免疫后的珍珠龍膽石斑魚(yú)組織中TLR2、MyD88、IL-1β、TNF-α 共4個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量，探究珍珠龍膽石斑魚(yú)對(duì)鰤?mèng)~諾卡氏菌的免疫應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 鰤?mèng)~諾卡氏菌202011201菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 試驗(yàn)用魚(yú) 在天津市濱海新區(qū)某漁場(chǎng)中捕撈，體長(zhǎng)7 cm左右，體質(zhì)量30 g左右。

1.1.3 試劑 福爾馬林購(gòu)自天津渤化化學(xué)試劑有限公司；液氮購(gòu)自天津泰亞氣體銷(xiāo)售有限公司；BHI浸液肉湯和BHI浸液瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;96孔V型血凝板購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 電子天平，型號(hào)AS 220.X2，購(gòu)自RADWAG；超低溫冰箱，型號(hào)HYCD-205，購(gòu)自青島海爾特種電器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)DHP 9272，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱，型號(hào)IS-RSV1，購(gòu)自CRYSTAL；高壓滅菌鍋，型號(hào)GI-54TW，購(gòu)自ZEALWAY；低溫離心機(jī)，型號(hào)3K15，購(gòu)自Sigma；PCR 儀，型號(hào)T100，購(gòu)自Bio-Rad；熒光定量PCR 儀，型號(hào)IQ5，購(gòu)自Bio-Rad；微量核酸測(cè)定儀，型號(hào)NanoPhotometerPClass，購(gòu)自德國(guó)Implen；麥?zhǔn)媳葷醿x，型號(hào)17025，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滅活疫苗的安全性試驗(yàn) 活化鰤?mèng)~諾卡氏菌，于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，吸取1 mL鰤?mèng)~諾卡氏菌菌液加至1.5 mL 無(wú)菌無(wú)酶離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，去除上清液，加入生理鹽水振蕩形成菌液，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷醿x將鰤?mèng)~諾卡氏菌滅活疫苗配置為1.0×108 CFU· mL-1，將配制好的菌液分成5 份，按照菌液體積的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5% 加入福爾馬林，滅活時(shí)間設(shè)置30 min和1、2、4、8、12、24 h共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸取100 μL涂布在BHI固體培養(yǎng)基中，觀察每個(gè)時(shí)間點(diǎn)福爾馬林對(duì)鰤?mèng)~諾卡氏菌的滅活效果。

1.2.2 鰤?mèng)~諾卡氏菌滅活疫苗的制備 根據(jù)1.2.1的方法制備鰤?mèng)~諾卡氏菌滅活疫苗，將滅活疫苗3 000 r·min-1 離心5 min，用生理鹽水沖洗3次，洗去福爾馬林，然后加入生理鹽水與滅活的鰤?mèng)~諾卡氏菌震蕩混勻，將配置好的滅活疫苗放置冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 疫苗的注射，組織的取樣及保存 將健康的珍珠龍膽石斑魚(yú)在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)選擇80條用于試驗(yàn)。每條魚(yú)腹腔注射200 μL滅活疫苗，對(duì)照組注射生理鹽水；在注射后的12 h和1、3、7、14、21、28 d的7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別取10條珍珠龍膽石斑魚(yú)的肝臟、腎臟和脾3種組織樣品，將取好的樣品在生理鹽水中涮掉雜質(zhì)殘留，放置保菌管中于液氮中凍存48 h；然后將樣品置于冰箱-80 ℃保存。

1.2.4 組織RNA的提取 采用RNA試劑盒提取組織總RNA，使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量濃度及純度。A260/A280 值在2.0～2.6 之間，RNA純度達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT Reagent Kit（TaKaRa）合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5× PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dTPrimer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，RNA模板2 μL，加無(wú)菌無(wú)酶水至20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15min，85 ℃ 5 s。轉(zhuǎn)錄完成后，將cDNA 模板置于-80℃冰箱保存。

1.2.6 免疫基因的選擇及引物設(shè)計(jì) 從NCBI網(wǎng)站獲得珍珠龍膽石斑魚(yú)管家基因β-actin 及免疫基因TLR2、MyD88、TNF- α、IL-1β 的序列，利用Premier 6.0 設(shè)計(jì)RT-qPCR 所用引物（表1），以肝臟、腎臟和脾的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。

1.2.7 熒光定量 PCR β-actin 作為內(nèi)部參考基因，利用TBGreen?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：TB?Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，PCR forwardPremix 和PCR Reverse Premix 各1 μL，ROXReference Dye 0.5 μL，cDNA 2 μL，無(wú)菌無(wú)酶水8μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸1 min，95 ℃。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 以對(duì)照基因β-actin 歸一化處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法分析4種免疫基因在腎臟、肝臟和脾中相對(duì)表達(dá)量的變化，運(yùn)用SPSS 23和GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖。

1.2.9 血清抗體效價(jià)的測(cè)定 對(duì)免疫12 h和1、3、7、14、21、28 d的珍珠龍膽石斑魚(yú)進(jìn)行取血，將抽出的血加入離心管中，于4 ℃冰箱傾斜靜置30 min，將自然析出的血清加入離心管在4 ℃冰箱暫存。使用96孔V型血凝板測(cè)定免疫血清抗體效價(jià)，每孔加入100 μL PBS，將血清加入第1個(gè)孔與PBS吹打混勻，再吸出100 μL與下個(gè)孔的PBS混勻，以此類(lèi)推達(dá)到2倍稀釋的效果，最后加入1×108 CFU·mL-1的鰤?mèng)~諾卡氏菌菌液與血清充分混勻，用血凝板專(zhuān)用膜密封，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 d后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 安全性試驗(yàn)結(jié)果分析

不同含量的福爾馬林在各個(gè)時(shí)間的滅活情況如表2所示，福爾馬林含量為0.1%～0.2%，24 h依舊未能達(dá)到滅活效果；福爾馬林含量為0.5%，30 min就可以達(dá)到滅活。采用滅活時(shí)間較短、福爾馬林占菌液體積較少的作為試驗(yàn)滅活疫苗，最終選用福爾馬林含量0.4%、滅活4 h的作為試驗(yàn)用疫苗。

2.2 血清抗體凝集效價(jià)的測(cè)定結(jié)果分析

由圖1可知，免疫組的抗體效價(jià)明顯升高，且免疫組比對(duì)照組變化顯著（P<0.05），免疫3 d后可以檢測(cè)到抗體，抗體效價(jià)為1∶16，在免疫21 d時(shí)達(dá)到高峰，抗體效價(jià)最高可達(dá)到1∶256，抗體水平在21 d內(nèi)呈上升趨勢(shì)，21 d后開(kāi)始下降。

2.3 免疫基因在組織中的表達(dá)分析

2.3.1 TLR2 免疫基因在腎臟、肝臟和脾中的表達(dá) 由圖2可知，免疫期間，TLR2 基因的表達(dá)量在脾、腎臟和肝臟中均上升。肝臟中，TLR2 基因的表達(dá)量從12 h開(kāi)始出現(xiàn)較大幅度的上調(diào)，到1 d時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的19.64倍，在7 d達(dá)到第2個(gè)峰值，是對(duì)照組的3.64倍，在21～28 d出現(xiàn)較大幅度的上調(diào)，在28 d時(shí)達(dá)到第3個(gè)峰值，是對(duì)照組的15.53 倍。在脾中，TLR2 基因的表達(dá)量在12 h至21 d之間變化不明顯，在21 d時(shí)達(dá)到峰值，是對(duì)照組的3.32倍，21 d后表達(dá)量下降，但28 d時(shí)的表達(dá)量仍高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.8倍，基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)上升-下降的趨勢(shì)。腎臟中，TLR2 基因的表達(dá)量在12 h時(shí)達(dá)到第1個(gè)峰值，是對(duì)照組的2.45倍，在14 d時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的7.39倍，隨后表達(dá)量下降，28 d時(shí)的表達(dá)量是對(duì)照組的2.07倍。以上結(jié)果表明，通過(guò)注射的方式進(jìn)行免疫，在不同的組織中TLR2 基因都有明顯的升高，并且肝組織中的TLR2 基因上調(diào)量要高于其他組織。

2.3.2 MyD88 免疫基因在腎臟、肝臟和脾中的表達(dá) 由圖3可知，免疫期間，脾中MyD88 基因的表達(dá)量在1 d時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的5.69倍，在21 d時(shí)達(dá)到第2個(gè)峰值，是對(duì)照組的2.16倍， 在其他時(shí)間段基因上調(diào)、下調(diào)趨勢(shì)不明顯。腎臟中，MyD88 基因的表達(dá)量在1 d時(shí)達(dá)到第1個(gè)峰值，是對(duì)照組的2.79倍，從1 d開(kāi)始基因表達(dá)量都比較高，在21 d時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的3.60倍。肝臟中，MyD88 基因的表達(dá)量在12 h時(shí)達(dá)到第1個(gè)峰值，是對(duì)照組的1.89倍，在7 d時(shí)達(dá)到第2個(gè)峰值，是對(duì)照組的2.77倍，在21 d時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的5.91倍，在其他時(shí)間點(diǎn)的MyD88 表達(dá)量均出現(xiàn)增長(zhǎng)。以上結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)注射的方式進(jìn)行免疫，在脾、腎臟和肝臟組織中MyD88 基因的表達(dá)量都有明顯的升高，并且脾和肝臟組織的基因表達(dá)量上調(diào)的比較高。

2.3.3 IL-1β 免疫基因在腎臟、肝臟和脾中的表達(dá) 由圖4可知，免疫期間，脾中IL-1β 基因表達(dá)量從1 d開(kāi)始出現(xiàn)上調(diào)，到3 d時(shí)達(dá)到第1個(gè)峰值，是對(duì)照組的2.42倍，到21 d時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的5.69倍，在28 d時(shí)基因表達(dá)量對(duì)比對(duì)照組無(wú)明顯上調(diào)。腎臟中，IL-1β 基因的表達(dá)量在7 d之前未出現(xiàn)明顯上調(diào)或下調(diào)，在7 d時(shí)達(dá)到峰值，是對(duì)照組的6.34倍，隨后基因表達(dá)量減少，在21 d時(shí)出現(xiàn)第2 個(gè)峰值，是對(duì)照組的1.85 倍。肝臟中，IL-1β 基因的表達(dá)量在1 d時(shí)出現(xiàn)第1個(gè)峰值，是對(duì)照組的2.06倍，基因表達(dá)量呈上調(diào)的趨勢(shì)，到7 d時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的4.90倍，21、28 d基因的相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始出現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，分別是對(duì)照組的0.24、0.15倍。以上結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)注射的方式免疫，IL-1β 基因表達(dá)量在各個(gè)組織都出現(xiàn)上調(diào)，腎臟和肝臟的IL-1β 基因表達(dá)量均高于脾。

2.3.4 TNF-α 免疫基因在腎臟、肝臟和脾中的表達(dá) 由圖5可知，免疫期間，脾中TNF-α 的基因表達(dá)量在12 h出現(xiàn)第1個(gè)峰值，是對(duì)照組的0.45倍，在3 d時(shí)基因表達(dá)量下降到最低峰，是對(duì)照組的0.2倍，28 d時(shí)基因表達(dá)回歸正常水平。腎臟中，TNF-α 基因的表達(dá)量在1 d時(shí)達(dá)到第1個(gè)峰值，是對(duì)照組的12.39倍，在28 d時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的12.41倍，其余時(shí)間段基因表達(dá)均上調(diào)，并且都是對(duì)照組基因表達(dá)量的2 倍以上。肝臟中，TNF-α 基因的表達(dá)量在12 h時(shí)出現(xiàn)下調(diào)，是對(duì)照組的0.29 倍，在3 d 時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照組的5 倍，在28 d 時(shí)達(dá)到第2 個(gè)峰值，是對(duì)照組的2.45倍。以上結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)注射的方式進(jìn)行免疫，TNF-α 基因的表達(dá)量在腎臟中都出現(xiàn)上調(diào)，在脾中TNF-α 基因的表達(dá)量出現(xiàn)了下調(diào)，在肝臟中基因表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)。

3 討 論

3.1 疫苗的免疫效果分析

本研究制備了鰤?mèng)~諾卡氏菌福爾馬林滅活疫苗，為防止鰤?mèng)~諾卡氏菌抱團(tuán)生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)菌逃離滅活，對(duì)福爾馬林滅活時(shí)間、加入量進(jìn)行調(diào)整，最終確定0.4%的福爾馬林滅活4 h后的疫苗具有安全性；將鰤?mèng)~諾卡氏菌滅活疫苗使用腹腔注射的方式接種珍珠龍膽石斑魚(yú)，通過(guò)血清抗體效價(jià)發(fā)現(xiàn)，免疫3 d后魚(yú)體內(nèi)開(kāi)始生成抗體，免疫21 d時(shí)抗體達(dá)到高峰，隨后呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明本試驗(yàn)中的滅活疫苗可對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)提供較好的保護(hù)性，與解俊等[8]研究結(jié)果一致。

滅活疫苗由于制備工藝簡(jiǎn)單、廉價(jià)、效果明顯等特性，近年來(lái)得到廣泛的研究，腹腔注射是滅活疫苗接種的主要方式，并已得到證實(shí)接種效果優(yōu)于口服、浸泡等方式[9]。本研究通過(guò)注射福爾馬林滅活疫苗，分析腎、脾和肝臟3個(gè)組織中免疫基因的實(shí)時(shí)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)均有上調(diào)，說(shuō)明該疫苗對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)免疫系統(tǒng)增強(qiáng)及實(shí)現(xiàn)良好免疫保護(hù)具有重要作用，能提升珍珠龍膽石斑魚(yú)的免疫保護(hù)，有效抵御鰤?mèng)~諾卡氏菌感染。本研究中開(kāi)發(fā)的針對(duì)鰤?mèng)~諾卡氏菌的福爾馬林滅活疫苗可在珍珠龍膽石斑魚(yú)中誘發(fā)免疫應(yīng)答。

3.2 TLR 通路中2 種免疫基因的表達(dá)分析

硬骨魚(yú)通過(guò)TLR2 識(shí)別人工合成的脂肽、微生物源的PGN和脂蛋白后，通過(guò)MyD88 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)NF-kB 活化并產(chǎn)生各種炎癥因子，如IL-1β、TNF-α等。在炎癥反應(yīng)中，最先產(chǎn)生TNF-α，隨后產(chǎn)生的是IL-1β，接著它們調(diào)節(jié)各種趨化因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移到感染的部位[6]。有學(xué)者使用愛(ài)德華氏菌感染牙鲆，發(fā)現(xiàn)TLR2 在腎臟、肝臟和脾的基因表達(dá)量都有提高，肝臟的TLR2 表達(dá)量在所有組織中最高[10]。本研究中，試驗(yàn)組的腎臟、肝臟和脾中基因在12 h時(shí)表達(dá)量都上調(diào)，肝臟中TLR2 基因在12 h至1 d時(shí)表達(dá)量上調(diào)較高，但在腎臟和脾上卻未出現(xiàn)顯著的變化，隨后才出現(xiàn)顯著上調(diào)，在珍珠龍膽石斑魚(yú)的肝臟、腎臟和脾的基因表達(dá)量顯著升高，表明當(dāng)魚(yú)體內(nèi)出現(xiàn)較高數(shù)量的革蘭氏陽(yáng)性菌時(shí)，會(huì)刺激魚(yú)體內(nèi)免疫基因TLR2 的上調(diào)，從而引發(fā)魚(yú)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的增加。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR2 基因表達(dá)量在肝臟組織的細(xì)胞密度明顯高于腎臟和脾，表達(dá)量的上調(diào)誘發(fā)巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，吞噬滅活的鰤?mèng)~諾卡氏菌，產(chǎn)生抗體。TLR2 免疫基因在肝臟12 h至1d時(shí)表達(dá)量上調(diào)較高，腎臟和脾分別是在3 和21 d表達(dá)量上調(diào)較高，可能是鰤?mèng)~諾卡細(xì)菌首先作用于魚(yú)的肝臟，再作用其他組織，由肝臟的巨噬細(xì)胞隨著血液轉(zhuǎn)移到了腎臟和脾，導(dǎo)致腎臟和脾的TLR2 免疫基因數(shù)量變化不明顯。

MyD88 基因的表達(dá)可能受所涉及的刺激物和物種的調(diào)控而有所不同，TLR引起的所有信號(hào)途徑大多都涉及到MyD88，MyD88在TLR引起的信號(hào)途徑中發(fā)揮著重要的作用。在配體結(jié)合到TLRs之后，TLRs二聚化后構(gòu)象發(fā)生變化有利于招募胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域的接頭分子，依賴(lài)MyD88的信號(hào)傳導(dǎo)通路或依賴(lài)TRIF 的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在MyD88的信號(hào)傳導(dǎo)通路，MyD88是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的接頭分子，導(dǎo)致下游信號(hào)級(jí)聯(lián)的觸發(fā)和促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[6]。薛潔等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆后其脾中MyD88 基因在1 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照組的5.52倍，而后逐漸下降；韋光本[12]用哈維氏弧菌滅活疫苗注射珍珠龍膽石斑魚(yú)發(fā)現(xiàn)，免疫基因MyD88 在肝臟組織中第21 d相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，在腎臟中第28 d相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。本研究中，MyD88基因在肝臟中12 h時(shí)表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)，上調(diào)量并沒(méi)有免疫基因TLR2 上調(diào)量高，可能是大量免疫TLR2通過(guò)TRIF的信號(hào)傳導(dǎo)通路與TLR6形成異源二聚體。在腎臟和脾中，MyD88 基因在1 d后開(kāi)始上調(diào)，與上述學(xué)者[1112]研究結(jié)果相似。脾中的MyD88 基因在1 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，腎臟的MyD88 基因在1～21 d時(shí)基因表達(dá)量都較高，在腎臟和脾中MyD88 基因表達(dá)量的增長(zhǎng)與TLR2 不同，可能是由于在MyD88通路中，接種鰤?mèng)~諾卡氏菌疫苗后相對(duì)應(yīng)的TLR1、TLR4、TLR5 等基因也出現(xiàn)上調(diào)，由于MyD88 基因也是TLR1、TLR4、TLR5 等基因的接頭基因，導(dǎo)致MyD88 基因上調(diào)。

3.3 細(xì)胞因子基因的表達(dá)分析

IL-1β已經(jīng)在許多魚(yú)類(lèi)中被發(fā)現(xiàn)，但其功能主要集中在炎癥反應(yīng)中，IL-1β及其受體作為先天免疫和炎癥的中心媒介，在細(xì)菌感染中發(fā)揮重要作用。抗原攻擊會(huì)導(dǎo)致IL-1β 的轉(zhuǎn)錄水平快速上調(diào)，因此常被認(rèn)為是免疫激活的發(fā)生信號(hào)[13]。Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)滅鮭氣單胞菌感染斜帶石斑魚(yú)，通過(guò)ahr1a 和ahr1b 的表達(dá)，與巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因（IL-1β）被下調(diào)，表明滅鮭氣單胞菌利用其毒力機(jī)制控制和阻止巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生（說(shuō)明IL-1β是由ahr1a和ahr1b介導(dǎo)的）；Ho等[15]研究注射鰤?mèng)~諾卡氏菌的大口黑鱸發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌感染的3～5 d，脾臟和腎臟中IL-1β 的表達(dá)顯著升高；也有研究表明，IL-1β 基因在腎臟、肝臟和脾有較高的表達(dá)，用鰤?mèng)~諾卡氏菌對(duì)烏鱧進(jìn)行免疫試驗(yàn)，脾組織中的IL-1β 基因表達(dá)在1 d 時(shí)達(dá)到峰值[16]。本研究中，在免疫過(guò)程中IL-1β 基因在脾組織中上調(diào)，在3、21 d達(dá)到峰值，腎臟中在7 d時(shí)達(dá)到峰值，說(shuō)明接種疫苗后珍珠龍膽石斑魚(yú)出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，通過(guò)腹腔注射鰤?mèng)~諾卡氏菌，肝臟和脾中IL-1β 基因表達(dá)量在1 d時(shí)開(kāi)始上調(diào)，IL-1β通過(guò)激活多種反應(yīng)發(fā)揮其對(duì)感染的保護(hù)作用，使中性粒細(xì)胞快速募集到肝臟和脾的炎癥部位，內(nèi)皮粘附分子的激活，細(xì)胞因子和趨化因子的誘導(dǎo)，發(fā)熱反應(yīng)的誘導(dǎo)，以及刺激適應(yīng)性免疫，組織肝臟中在14 d過(guò)后出現(xiàn)下調(diào)，可能是由于在7～14 d的中性粒細(xì)胞高度募集，致使魚(yú)體內(nèi)出現(xiàn)抑制IL-1β 基因的表達(dá)，以此保護(hù)魚(yú)體組織，防止出現(xiàn)損傷，與Ho等[15]等研究結(jié)果一致。

TGF-β 在胸腺、頭腎和脾臟中高度表達(dá)，可以促進(jìn)魚(yú)類(lèi)淋巴細(xì)胞的增殖[17]。TNF-α是一種重要的細(xì)胞因子，調(diào)控細(xì)胞因子的合成及釋放，在魚(yú)的免疫過(guò)程中起的重要作用，TNF-α在免疫反應(yīng)中的作用具有雙面性，當(dāng)其表達(dá)適量時(shí)，能夠施展正向的免疫功能，抵御外部物質(zhì)的入侵，參與炎癥反應(yīng)，但當(dāng)其轉(zhuǎn)錄水平過(guò)高時(shí)，發(fā)揮的免疫功能會(huì)對(duì)機(jī)體形成損傷，從而致使發(fā)生病理反應(yīng)[18]。在本研究中，腎臟中TNF-α 基因的相對(duì)表達(dá)量在1、28 d時(shí)較高，與韋光本[12]的研究結(jié)果一致；在脾組織中7 d時(shí)TNF-α 基因出現(xiàn)明顯下調(diào)，可能該時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)降解，導(dǎo)致表達(dá)量的下降，通過(guò)整體分析，在注射疫苗后，宿主免疫系統(tǒng)可以維持在高水平狀態(tài)。

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（責(zé)任編輯：胡立霞）