褪黑素對(duì)冷藏后芒果果實(shí)冷害和后熟的影響及生理機(jī)制

徐 萍，黃 婷，劉士琦，胡美姣，高兆銀，劉家糧，張正科,*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南省食品營(yíng)養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101）

芒果（Mangifera indicaL.）為漆樹(shù)科常綠喬木芒果樹(shù)的果實(shí)，是世界五大熱帶水果之一[1]。芒果果實(shí)以其獨(dú)特的香氣、甘甜多汁的口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)而深受人們喜愛(ài)。然而，采后芒果果實(shí)在常溫貯藏運(yùn)輸過(guò)程中可快速成熟衰老、易腐爛，造成品質(zhì)劣變，極大影響產(chǎn)品的市場(chǎng)銷(xiāo)售[2]。冷藏是常用的果蔬采后保鮮方法，但芒果對(duì)低溫敏感，冷藏期間易發(fā)生冷害（chilling injury，CI），且冷藏芒果果實(shí)轉(zhuǎn)移到常溫環(huán)境貯藏時(shí)，CI癥狀（果皮褐變、黑斑及凹陷等）迅速加重。此外，芒果發(fā)生CI時(shí)，后熟能力部分或完全喪失，常表現(xiàn)為色澤不能轉(zhuǎn)黃、果肉硬化、香味不佳、可溶性糖積累量不足等，這極大限制了芒果冷鏈物流發(fā)展[3]。低溫誘導(dǎo)的果實(shí)成熟異常與乙烯合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁物質(zhì)和淀粉降解受阻等因素有關(guān)，故對(duì)受冷果實(shí)成熟相關(guān)生理代謝進(jìn)行調(diào)控則有助于解決芒果CI問(wèn)題。已有研究發(fā)現(xiàn)，熱水浸泡、間歇升溫、低溫預(yù)貯、外源乙烯等處理可有效促進(jìn)芒果果實(shí)在冷藏過(guò)程中或冷藏后貨架期中的成熟，使果實(shí)CI減輕，果實(shí)品質(zhì)得到改善[4-6]。

褪黑素（melatonin，MT）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的天然吲哚胺類(lèi)化合物。對(duì)植物而言，MT的生物合成前體為色氨酸，合成場(chǎng)所為葉綠體和線(xiàn)粒體，盡管含量微少，但在多個(gè)組織和器官中分布，是具有重要生物活性的抗氧化分子和信號(hào)分子，其不僅能夠調(diào)節(jié)植物的種子萌發(fā)、組織分化、氣孔開(kāi)閉、生根、光合效率、生物節(jié)律和成熟衰老，還能激發(fā)植物對(duì)多種生物及非生物脅迫的抗性[7-9]。

近年來(lái)的研究證據(jù)表明，MT處理可緩解多種采后果實(shí)CI[10]。例如在芒果果實(shí)中，MT處理可通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)、促進(jìn)多胺代謝和γ-氨基丁酸代謝、增加脯氨酸積累、維持能量供應(yīng)和抑制膜脂過(guò)氧化及降解等機(jī)制減輕芒果果實(shí)在冷藏期間的CI[11-14]。然而，目前尚不清楚MT處理對(duì)芒果果實(shí)由冷藏轉(zhuǎn)入常溫貨架后的CI及后熟的影響。為此，本研究以‘貴妃’芒果果實(shí)為研究對(duì)象，通過(guò)分析細(xì)胞壁代謝、乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)，明確MT處理對(duì)冷藏后芒果果實(shí)成熟軟化及對(duì)溫度變化適應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果可為MT提高芒果抗冷性并改善果實(shí)品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘貴妃’芒果果實(shí)于2022年4月5日上午在海南三亞郊一商業(yè)果園采收，采摘時(shí)選取果肩飽滿(mǎn)且已經(jīng)達(dá)到商業(yè)成熟度的綠熟期果實(shí)（單果質(zhì)量（218.6±16.7）g，n＝10），于采摘當(dāng)日運(yùn)至海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后生物保鮮實(shí)驗(yàn)室。

MT、磷酸吡哆醛 上海源葉生物科技有限公司；β-巰基乙醇 美國(guó)Bio-Basic公司；植物多糖多酚總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑盒 北京天根生化科技有限公司；GreenTaqMix 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FT327手持硬度計(jì) 意大利Effegi公司；CR-400色差儀 日本美能達(dá)柯尼卡公司；Master-M手持折光儀日本東京Atago公司；FP110手持葉綠素?zé)晒鈨x 易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司；FE30電導(dǎo)率儀 瑞士梅特勒-托利多公司；Synergy LX酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；UVmini1240紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CFX ConnectTMOptics Module熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Bio-Rad公司；ChampGel 5000全自動(dòng)凝膠成像儀浙江柏奧生物科技有限公司；6890N型氣相色譜儀（配氫離子火焰檢測(cè)器）美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)采后處理

將實(shí)驗(yàn)用果用0.05%次氯酸鈉溶液消毒5 min，用自來(lái)水沖洗、晾干后，將其隨機(jī)分成兩組，每組312 個(gè)果實(shí)。在室溫和暗環(huán)境條件下，將兩組果實(shí)分別置于蒸餾水（對(duì)照組）和0.5 mmol/L（通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選得到）的MT溶液中浸泡1 h。所有果實(shí)自然晾干后放置于打孔塑料保鮮盒（尺寸：320 mm×220 mm×100 mm；6 個(gè)/盒）中。將處理后果實(shí)置于（4±1）℃、相對(duì)濕度（85±5）%冷庫(kù)中貯藏28 d，隨后轉(zhuǎn)移至室溫（25 ℃）貯藏4 d，在貨架期內(nèi)每天測(cè)定果實(shí)CI指數(shù)、果肉色度、硬度、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（soluble solid content，SSC）、呼吸速率及乙烯釋放量。同時(shí)，每天取果肉組織冷凍于液氮中，在-80 ℃冰箱中凍存，待測(cè)。每處理在每測(cè)定點(diǎn)設(shè)3 次重復(fù)，每次重復(fù)30 個(gè)果用于CI指數(shù)測(cè)定，2 個(gè)用于呼吸速率和乙烯釋放量測(cè)定，6 個(gè)用于其他指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 果實(shí)CI指數(shù)和果皮色相（h值）測(cè)定

CI指數(shù)：根據(jù)果實(shí)果皮CI癥狀（褐變、黑斑、凹陷及皺縮）的嚴(yán)重程度分為5 級(jí)（0～4）[5]，其中0級(jí)為無(wú)CI，1級(jí)為輕微CI；2級(jí)為中度CI；3級(jí)為嚴(yán)重CI；4級(jí)為極嚴(yán)重CI。CI指數(shù)按下式計(jì)算：

色度：使用CR-400色差儀測(cè)定芒果果皮（綠面）的色度值，記錄L*、a*和b*值，根據(jù)公式h＝arctan（b*/a*）將獲得的值轉(zhuǎn)換為h值，單位以度（°）表示。

1.3.3 果實(shí)硬度和SSC測(cè)定

硬度：使用FT-327 手持式硬度計(jì)（探頭直徑6 mm）測(cè)定果實(shí)正反兩面中心處的硬度，單位以牛頓（N）表示。

SSC：使用Master-M手持式折光儀經(jīng)蒸餾水調(diào)零后測(cè)定果實(shí)的SSC。SSC以%表示。

1.3.4 果實(shí)呼吸速率和乙烯釋放量測(cè)定

呼吸速率：將6 個(gè)芒果果實(shí)兩兩放進(jìn)2.25 L帶有橡膠塞的塑料容器中，密封20 min后將探針插入容器，記錄CO2濃度，根據(jù)容器容積、果實(shí)質(zhì)量和CO2濃度差計(jì)算呼吸速率[15]，單位表示為nmol/（kg·s）。

乙烯釋放量：參考Hu Meijiao等[15]的方法，在室溫條件下，將6 個(gè)芒果果實(shí)兩兩裝在帶有橡膠隔墊的2.25 L塑料容器中密封60 min，然后抽取1 mL頂部氣體樣品注入配備5%苯基-甲基聚硅氧烷色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）和氫離子火焰檢測(cè)器的氣相色譜儀中。進(jìn)樣溫度、柱溫和檢測(cè)器溫度分別設(shè)置為60、120 ℃和250 ℃。N2、H2和空氣流速分別為0.023、0.67 mL/s和6.67 mL/s。記錄乙烯濃度，根據(jù)容器容積、果實(shí)質(zhì)量計(jì)算乙烯釋放量，單位表示為nmol/（kg·s）。

1.3.5 果實(shí)水溶性果膠（water-soluble pectin，W S P）和共價(jià)結(jié)合型果膠（環(huán)己烷二胺四乙酸（1,2-cyclohexylenedinitrilotetr aacetic acid，CDTA）-soluble pectin，CSP）測(cè)定

醇不溶性固形物（alcohol insoluble solids，AIS）制備：AIS的提取和分離參考Figueroa等[16]方法并稍作修改。稱(chēng)取10 g冷凍果肉組織于40 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液中充分渦旋勻漿，煮沸30 min，冷卻后抽濾，收集濾渣，向殘?jiān)屑尤?0 mL 90%二甲基亞砜溶液，于4 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置12 h，用去離子水清洗，抽濾后收集殘?jiān)?，將殘?jiān)来斡?0%乙醇溶液、氯仿-乙醇（2∶1，V/V）、丙酮沖洗至顏色發(fā)白，抽濾，將殘?jiān)糜?0 ℃真空干燥箱中烘干，收集得到AIS。

取1 g AIS分散在50 mL去離子水中，置于25 ℃搖床振蕩6 h，12 000×g、4 ℃離心10 min，殘?jiān)貜?fù)提取2 次，合并上清液即得WSP；向沉淀中加入50 mL 50 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 6.5，含50 mmol/L CDTA），25 ℃振蕩6 h，12 000×g、4 ℃離心10 min，殘?jiān)貜?fù)提取2 次，合并上清液即得CSP。用半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)羥基聯(lián)苯測(cè)定法[17]進(jìn)行定量，結(jié)果以每千克AIS中的半乳糖醛酸質(zhì)量表示，單位表示為g/kg。

1.3.6 果實(shí)細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶活力測(cè)定

取5 g果肉組織加入30 mL含10 g/L聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）的8.8% NaCl溶液后勻漿，在4 ℃提取1 h后，溶液以12 000×g離心20 min。獲得上清液作為粗酶液并用于測(cè)量多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）活力[18]。

PG活力參照Yoshida等[19]的方法，取0.2 mL乙酸鈉緩沖液（40 mmol/L、pH 4.6）與0.2 mL聚半乳糖醛酸溶液（10 g/L）混勻，隨后加入100 μL粗酶液，將滅活的酶提取物作為對(duì)照組，于40 ℃孵育30 min，然后加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）終止反應(yīng)，沸水浴10 min，記錄反應(yīng)溶液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，酶活力定義為每千克果肉每秒產(chǎn)生的半乳糖醛酸的物質(zhì)的量，單位為μmol/（kg·s）。

PME活力測(cè)定參照Vicente等[20]的方法，反應(yīng)體系包含0.6 mL柑橘果膠溶液（5 g/L）、0.15 mL 0.05%溴百里酚藍(lán)、0.1 mL蒸餾水和0.1 mL粗酶液（pH 7.5），混合均勻后置于37 ℃條件下孵育30 min，記錄620 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化。定義1 個(gè)PME活力（1 U）表示為每秒每千克樣品在620 nm波長(zhǎng)處吸光度變化1，PME活力單位為U/kg。

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）活力測(cè)定參考Lin Yifen等[21]的方法，取5 g果肉組織加入30 mL含1 mol/L NaCl、β-巰基乙醇（體積分?jǐn)?shù)2%）和5% PVP的乙酸鈉緩沖液中勻漿，溶液以12 000×g離心20 min，獲得上清液即為粗酶液，反應(yīng)混合物由200 μL粗酶液和1 mLρ-NO2-β-D-吡喃半乳糖苷（溶于50 mmol/L乙酸鈉溶液，pH 4.7）組成，在37 ℃條件下孵育30 min，隨后加入2 mL 10 mmol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，β-Gal活力表示為每秒每千克鮮質(zhì)量樣品催化生成p-硝基苯酚的物質(zhì)的量，即為μmol/（kg·s）。

纖維素酶即內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶（endo-1,4-β-Dglucanase，EGase），活力測(cè)定參照Ali等[22]的方法，取5 g果肉加入20 mL含有1 mol/L NaCl、13 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10 mmol/Lβ-巰基乙醇以及1% PVP的檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L、pH 4.6）中進(jìn)行均質(zhì)處理，以12 000×g離心30 min，上清液即為粗酶液。將1.5 mL羧甲基纖維素鈉溶液（10 g/L）與300 μL粗酶液混合，在40 ℃孵育1 h，將煮沸5 min的粗酶液作為對(duì)照，隨后加入DNS并煮沸5 min終止反應(yīng)，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行還原糖含量計(jì)算。EGase活力表示為每秒每千克果蔬樣品催化羧甲基纖維素鈉水解生成還原糖的質(zhì)量，即μg/（kg·s）。

1.3.7 果實(shí)乙烯合成途徑相關(guān)酶活力測(cè)定

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACS）活力參考Zaharah等[23]的方法進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)結(jié)束后從頂部抽出1 mL氣體，注入氣相色譜儀中測(cè)定乙烯釋放量。ACS活力表示為每秒每千克果蔬組織（鮮質(zhì)量）中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）的生成量，即為nmol/（kg·s）。

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）活性測(cè)定參照Z(yǔ)aharah等[24]的方法。取5 g 果肉組織用以粗酶液的提取，在相同的參數(shù)條件下測(cè)定乙烯釋放量。ACO活力表示為每秒每千克果蔬樣品（鮮質(zhì)量）的乙烯釋放量，即為nmol/（kg·s）。

1.3.8 乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)分析

使用RNAprep Pure多糖多酚總RNA提取試劑盒提取芒果果皮總RNA，使用cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA，具體操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。產(chǎn)物用RNA free H2O稀釋20 倍作為實(shí)時(shí)PCR（realtime PCR）模板并置于-20 ℃保存，使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)cDNA質(zhì)量。real-time PCR反應(yīng)體系如表1所示。

表1 real-time PCR反應(yīng)體系Table 1 Composition of real-time PCR reaction system

MiACS（XM_044645674.1）、MiACO（XM_044609568.1）、MiETR1（乙烯受體1，ethylene receptor 1，XM_044647038.1）、MiERS1（乙烯響應(yīng)傳感器1，ethylene responsive sensor 1，XM_044637754.1）、MiCTR1（組成型三重響應(yīng)1，constitutive triple response 1，XM_044636533.1）、MiERF1（乙烯響應(yīng)因子1，ethylene responsive factor 1，XM_044613564.1）、MiEIN2（乙烯不敏感因子2，ethylene insensitive 2，XM_044638375.1）、MiCBF1（C-重復(fù)基序結(jié)合因子1，C-repeat-binding factor 1，XM_044612296.1）和MiICE1（CBF表達(dá)誘導(dǎo)因子1，inducer of CBF expression 1，XM_044610366.1）序列信息從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）搜索獲得，使用oligo 7軟件設(shè)計(jì)real-time PCR引物（表2），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以MiActin1（JF737036.1）基因作為內(nèi)參基因，采用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證引物特異性。

表2 real-time PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for real-time PCR

使用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行real-time PCR操作，并通過(guò)Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行real-time PCR分析。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃持續(xù)15 min，隨后95 ℃持續(xù)10 s；退火溫度（60 ℃）持續(xù)30 s，進(jìn)行40 次循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt方法[25]計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法分析處理組與對(duì)照組在相同時(shí)間點(diǎn)的顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 MT處理對(duì)芒果果實(shí)CI指數(shù)和果皮色度的影響

如圖1A所示，冷藏（28 d）結(jié)束時(shí)，對(duì)照組和MT處理組果實(shí)的CI癥狀均較輕，在常溫貨架期間，對(duì)照組果實(shí)CI癥狀不斷加重，且不能正常轉(zhuǎn)色，而MT處理組果實(shí)CI發(fā)展較慢，且果實(shí)可由綠轉(zhuǎn)黃。CI測(cè)定結(jié)果顯示，MT處理組果實(shí)CI指數(shù)在常溫貨架期間平均低于對(duì)照32.9%（圖1B）。h值大小可反映從物體反射或透過(guò)物體傳播的顏色，紅色為0°、黃色為60°、綠色為120°。如圖1C所示，MT處理組果實(shí)h值下降速度顯著快于對(duì)照果實(shí)，表明MT處理可加速芒果色澤由綠轉(zhuǎn)黃，這與表型觀(guān)察結(jié)果（圖1A）相吻合。

圖1 MT處理對(duì)冷藏‘貴妃’芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫貨架后外觀(guān)（A）、CI指數(shù)（B）和h值（C）的影響Fig.1 Effect of MT treatment on appearance (A),CI index (B) and h value (C) in ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.2 MT處理對(duì)芒果果實(shí)硬度和SSC的影響

由圖2A可知，室溫貯藏4 d后，對(duì)照組果實(shí)硬度從初始值（86.02±3.37）N迅速下降至（7.12±0.75）N；MT 處理加速了芒果果實(shí)硬度下降，其中對(duì)照果實(shí)在貯藏1～3 d的平均硬度比處理組果實(shí)高36.3%。由圖2B可知，對(duì)照和MT處理果實(shí)SSC在貯藏過(guò)程中從（10.63±0.37）%和（11.06±0.14）%分別升高至（15.46±0.41）%和（16.39±0.37）%；MT處理果實(shí)的SSC在第1、2、3天均顯著高于對(duì)照果實(shí)。

圖2 MT處理對(duì)冷藏‘貴妃’芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫貨架后硬度（A）和SSC（B）的影響Fig.2 Effect of MT treatment on firmness (A) and SSC (B) in ‘Guifei’mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.3 MT處理對(duì)芒果果實(shí)呼吸速率和乙烯釋放量的影響

由圖3A可知，芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫后，呼吸速率在前期持續(xù)上升，對(duì)照果實(shí)在貯藏第2天時(shí)達(dá)到峰值（49.95±2.20）nmol/（kg·s），隨后逐漸下降。MT處理提高了芒果果實(shí)的呼吸速率，在貯藏第2天時(shí)達(dá)到（69.57±1.89）nmol/（kg·s），較對(duì)照果實(shí)高39.2%。結(jié)果表明，MT處理果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫后呼吸速率提高，加快了果實(shí)正常后熟軟化。由圖3B可知，在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照果實(shí)的乙烯釋放量在貯藏的前2 d持續(xù)上升，峰值為（12.02±0.58）nmol/（kg·s），隨后下降。MT處理增加了乙烯的釋放量，使其峰值較對(duì)照果實(shí)高39.2%。

圖3 MT處理對(duì)冷藏‘貴妃’芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫貨架后呼吸速率（A）和乙烯釋放量（B）的影響Fig.3 Effect of MT treatment on respiration rate (A) and ethylene production (B) in ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.4 MT處理對(duì)芒果果實(shí)WSP和CSP含量的影響

由圖4可知，對(duì)照果實(shí)在常溫貯藏0 d時(shí)WSP和CSP含量分別為（8.61±1.83）g/kg和（9.62±1.31）g/kg，第4天時(shí)，二者值分別達(dá)到（72.88±4.91）g/kg和（41.30±3.29）g/kg。與對(duì)照相比，MT處理明顯提高了WSP和CSP含量，在貯藏第1～4天，MT處理果實(shí)的WSP含量平均值較對(duì)照高87.1%；貯藏2～4 d，MT處理果實(shí)的CSP含量平均值較對(duì)照高55.5%。

圖4 MT處理對(duì)冷藏‘貴妃’芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫貨架后WSP（A）和CSP（B）含量的影響Fig.4 Effect of MT treatment on WSP (A) and CSP (B) contents in‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.5 MT處理對(duì)芒果果實(shí)細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶活性的影響

由圖5 A 可知，對(duì)照組果實(shí)P G 活力初始值為（5.34±0.19）μmol/（kg·s），常溫放置2 d后，PG活力增加到（13.09±0.80）μmol/（kg·s），隨后逐漸下降。MT處理顯著提高了貯藏期間果實(shí)PG活性，其處理果實(shí)的PG活性在貯藏1～3 d顯著高于對(duì)照組。如圖5B所示，對(duì)照和處理組果實(shí)PME活性在整個(gè)貯藏過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組果實(shí)在第4天較第0天下降了66.4%。MT處理加速了PME活性下降，其處理果實(shí)的PME活性在貯藏第1天和第2天顯著低于對(duì)照果實(shí)。如圖5C所示，對(duì)照果實(shí)β-Gal活性在貯藏過(guò)程中呈線(xiàn)性升高趨勢(shì)。MT處理促進(jìn)了果實(shí)β-Gal活性升高，其在2、3 d和4 d時(shí)顯著高于對(duì)照。如圖5D所示，對(duì)照組與MT處理組果實(shí)EGase活性總體呈上升趨勢(shì)，且MT處理果實(shí)的活性高于對(duì)照組，其在貯藏第2天和第4天分別高于對(duì)照42.7%和20.8%。

圖5 MT處理對(duì)冷藏‘貴妃’芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫貨架后PG（A）、PME（B）、β-Gal（C）和EGase（D）活性的影響Fig.5 Effect of MT treatment on PG (A),PME (B),β-Gal (C) and EGase (D) activities of ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.6 MT處理對(duì)芒果果實(shí)乙烯合成相關(guān)酶活性及其基因表達(dá)的影響

冷藏芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫后，ACS和ACO活性呈峰型變化趨勢(shì)，第2天達(dá)到峰值且MT處理組ACS和ACO活性變化較對(duì)照組更為明顯，其峰值分別較對(duì)照果實(shí)高30.1%和20.8%（圖6A、B）。MiACO和MiACS相對(duì)表達(dá)量與ACO和ACS變化趨勢(shì)相似，MT處理提高了果實(shí)MiACO和MiACS相對(duì)表達(dá)量，在貯藏1～3 d中達(dá)到顯著水平（圖6C、D）。

圖6 MT處理對(duì)冷藏‘貴妃’芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫貨架后ACS（A）和ACO（B）活性、MiACS（C）和MiACO（D）表達(dá)的影響Fig.6 Effect of MT treatment on activities of ACS (A) and ACO (B)and relative expression of MiACS (C) and MiACO (D) in ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.7 MT處理對(duì)芒果果實(shí)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖7A所示，對(duì)照果實(shí)MiETR1表達(dá)量在常溫貨架期第1天時(shí)略有下降，隨后升高并保持穩(wěn)定。MT處理促進(jìn)了MiETR1表達(dá)水平提高，在第2天時(shí)出現(xiàn)高峰，較對(duì)照高40%，隨后下降。如圖7B所示，對(duì)照果實(shí)MiERS1表達(dá)量在常溫貯藏期間的變化相對(duì)平穩(wěn)。MT處理組果實(shí)MiERS1表達(dá)量在貯藏第2、3、4天分別較對(duì)照提高50%、30%和50%。如圖7C所示，對(duì)照果實(shí)MiCTR1表達(dá)量在貯藏前3 d中逐漸上升，隨后下降。MT處理顯著抑制了MiCTR1的表達(dá)，其表達(dá)量在貯藏1～4 d的平均值較對(duì)照組低35.1%。如圖7D所示，對(duì)照果實(shí)MiERF1表達(dá)量逐漸升高，第2天達(dá)到最大，較第0天增加了1.1 倍，隨后逐漸下降。MT處理組果實(shí)MiERF1表達(dá)水平在貯藏1～3 d顯著高于對(duì)照。如圖7E所示，對(duì)照果實(shí)MiEIN2表達(dá)量在貯藏中變化較小。MT處理誘導(dǎo)了MiEIN2表達(dá)量升高，在貯藏第1、2、3天時(shí)的表達(dá)量顯著高于對(duì)照果實(shí)79.4%、52.9%和42.1%。

圖7 MT處理對(duì)冷藏‘貴妃’芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫貨架后MiETR1（A）、MiERS1（B）、MiCTR1（C）、MiERF1（D）和MiEIN2（E）表達(dá)的影響Fig.7 Effect of MT treatment on relative expression levels of MiETR1 (A),MiERS1 (B),MiCTR1 (C),MiERF1 (D) and MiEIN2 (E) in ‘Guifei’mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.8 MT處理對(duì)芒果果實(shí)冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的影響

如圖8A所示，對(duì)照果實(shí)轉(zhuǎn)常溫后MiICE1表達(dá)量迅速升高，第2天出現(xiàn)高峰，峰值較第0天增長(zhǎng)8.3 倍，隨后迅速下降。MT處理果實(shí)的MiICE1表達(dá)量在貯藏第1、2、3天顯著高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.5、1.5 倍和1.6 倍。

圖8 MT處理對(duì)冷藏‘貴妃’芒果果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫貨架后MiICE1（A）和MiCBF1（B）表達(dá)的影響Fig.8 Effect of MT treatment on relative expression levels of MiICE1 (A) and MiCBF1 (B) in ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

如圖8B所示，對(duì)照果實(shí)的MiCBF1相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。MT處理顯著促進(jìn)了MiCBF1相對(duì)表達(dá)量升高，在貨架期0～3 d顯著高于對(duì)照果實(shí)，其中在第1、2天分別較對(duì)照高71.6%和97.4%。

3 討論

CI是導(dǎo)致冷藏期間或冷藏后芒果果實(shí)品質(zhì)劣變的主要因素[5]。Zhao Zhilei等[26]研究發(fā)現(xiàn)，綠熟期、轉(zhuǎn)色期、黃熟期3 組芒果果實(shí)在2 ℃冷藏10 d后轉(zhuǎn)入室溫貯藏期間，后兩組的果實(shí)CI癥狀顯著輕于第一組果實(shí)，表明成熟度較高的芒果果實(shí)因其代謝旺盛而具有較高的抗冷能力。本研究中，在4 ℃條件下冷藏28 d后，對(duì)照芒果果實(shí)出現(xiàn)輕微褐變、黑斑等CI癥狀，隨后轉(zhuǎn)移至室溫貯藏4 d期間，CI癥狀不斷加重。MT處理降低了果實(shí)CI指數(shù)，并加速了h值下降，表明MT處理可以抑制芒果果實(shí)CI發(fā)生，同時(shí)加速了芒果果實(shí)色澤由綠轉(zhuǎn)黃。

硬度和SSC是反映采后果實(shí)成熟狀態(tài)及貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)[27]。此外，可溶性固形物也是植物細(xì)胞滲透壓的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，較高水平的SSC可維持細(xì)胞內(nèi)的溶解度并降低冰點(diǎn)，故能改善植物抗冷能力[5]。芒果、香蕉和番木瓜等熱帶果實(shí)在CI發(fā)生過(guò)程中常伴有軟化滯緩及可溶性固形物積累受阻等后熟障礙。在本研究中，MT處理加速了冷藏后貨架期間芒果果實(shí)硬度下降并提高了SSC，表明MT可通過(guò)促進(jìn)軟化和可溶性固形物積累來(lái)緩解芒果果實(shí)CI。本結(jié)果與低溫預(yù)貯處理和間歇變溫處理加速芒果果實(shí)成熟并減輕果實(shí)CI的結(jié)果[5-6]相一致。

呼吸在果實(shí)采后新陳代謝中起主導(dǎo)作用，對(duì)調(diào)控果實(shí)采后生理及品質(zhì)變化具有重要意義[28]。呼吸作用加強(qiáng)可促進(jìn)果實(shí)體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，如細(xì)胞壁物質(zhì)降解、淀粉水解、類(lèi)胡蘿卜素積累和香氣物質(zhì)合成等，導(dǎo)致果實(shí)成熟和軟化[29]。本研究中，MT處理顯著提高了受冷果實(shí)轉(zhuǎn)入常溫后的呼吸速率，因此能夠促進(jìn)果實(shí)成熟相關(guān)生理代謝及抗冷相關(guān)物質(zhì)積累，從而減輕CI癥狀。值得注意的是，先前研究結(jié)果顯示MT處理（0.5 mmol/L）1 h可抑制‘貴妃’芒果果實(shí)在25 ℃常溫貯藏期間的呼吸作用并推遲果實(shí)成熟[30]。不同的結(jié)果表明芒果果實(shí)在不同的環(huán)境中對(duì)MT的生理響應(yīng)機(jī)制存在差異。

纖維素、半纖維素和果膠等多糖物質(zhì)是細(xì)胞壁的主要組成成分，其在果實(shí)成熟過(guò)程中逐步降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松弛，導(dǎo)致果實(shí)軟化[31]。果膠是植物細(xì)胞壁中最主要的多糖之一，根據(jù)溶解性將其分為WSP和水不溶性果膠（螯合性果膠和堿溶性果膠）[32]。WSP以游離形式存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間隙中，不附著在細(xì)胞壁上[32]。CSP作為螯合性果膠，主要位于中膠層，通過(guò)鈣橋離子鍵或氫鍵結(jié)合在細(xì)胞壁上[32]。在本研究中，受冷芒果果實(shí)在轉(zhuǎn)入25 ℃貯藏期間WSP和CSP含量呈升高趨勢(shì)，表明芒果果膠不斷解聚，使細(xì)胞壁溶解；MT處理促進(jìn)了WSP和CSP含量升高，因此處理果實(shí)的軟化較快。果實(shí)軟化與PG、PME、β-Gal和EGase等細(xì)胞壁水解酶的催化作用密切相關(guān)[33]。在這些酶的作用下，果膠分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為果膠側(cè)鏈發(fā)生解離，果膠多聚物逐漸降解，從而導(dǎo)致果膠-纖維素-半纖維素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不斷被破壞[22]。其中，PG是參與果膠降解和增溶的關(guān)鍵酶，可催化果膠分子中多聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷鍵裂解，使細(xì)胞壁組分發(fā)生不同程度的降解，從而導(dǎo)致果實(shí)軟化[34]。PME的主要作用位點(diǎn)是聚半乳糖醛酸殘基中的C-6酯化基團(tuán)，使果膠去甲基酯化，進(jìn)而使PG水解去甲基化的聚半乳糖醛酸殘基，增加WSP含量，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，使果實(shí)軟化[35]。β-Gal作為一種糖苷酶，可裂解鼠李糖半乳糖酸I型果膠側(cè)鏈上的β-D-半乳糖殘基，與PG、PME協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞壁果膠基質(zhì)解聚，導(dǎo)致果實(shí)軟化[36]。EGase是纖維素水解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，能將細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)羧甲基纖維素水解成低聚糖或單糖[37]。低溫脅迫會(huì)使細(xì)胞壁代謝酶活性異常，造成細(xì)胞壁纖維素和果膠物質(zhì)降解受阻，出現(xiàn)后熟障礙，導(dǎo)致果實(shí)發(fā)生CI[38]。在本研究中，相較于對(duì)照，MT處理能夠促進(jìn)PG、β-Gal和EGase活性提高，且加速PME活性下降，表明MT在一定程度上維持了芒果果實(shí)細(xì)胞壁正常代謝，從而促進(jìn)了果實(shí)軟化并減輕了CI癥狀。這與間歇低溫脅迫和熱處理對(duì)桃[38]、柿[39]和芒果[4]等果實(shí)CI影響的結(jié)果相似。

乙烯作為重要的植物激素，在調(diào)節(jié)果實(shí)成熟衰老和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[40]。乙烯的生物合成途徑涉及兩步關(guān)鍵酶促反應(yīng)，第一步：通過(guò)ACS催化將S-腺苷-L-蛋氨酸轉(zhuǎn)化為ACC和5′-甲硫腺苷。第二步：在有氧條件下，ACO將ACC轉(zhuǎn)化為乙烯[41]。低溫脅迫可使芒果[42]、梨[43]、桃[44]、番茄[45]和香蕉[46]等果實(shí)體內(nèi)乙烯生物合成受阻，導(dǎo)致果實(shí)發(fā)生CI，而外源乙烯處理能有效緩解這些果實(shí)的CI癥狀。在本研究中，與對(duì)照果實(shí)相比，MT處理促進(jìn)了ACS和ACO活性及其編碼基因（MiACS和MiACO）的表達(dá)水平上調(diào)，因此增加了乙烯釋放量并有效恢復(fù)了果實(shí)成熟能力，導(dǎo)致果實(shí)CI減輕。

在植物中，乙烯通過(guò)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使植物細(xì)胞的生理代謝發(fā)生改變[47]。ETR1、ERS1、CTR1、ERF1和EIN2是乙烯信號(hào)途徑的重要組件。其中，CTR1是一種激酶蛋白，對(duì)乙烯反應(yīng)起負(fù)調(diào)節(jié)作用，乙烯受體ETR1和ERS1主要在CTR1的上游發(fā)揮作用，而EIN2作為CTR1的下游元件，被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子ERF1的表達(dá)，從而激活乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并最終實(shí)現(xiàn)乙烯生理效應(yīng)[48]。Wang Ke等[49]研究發(fā)現(xiàn)，乙烯響應(yīng)因子ERF介導(dǎo)了乙烯對(duì)冷藏桃果實(shí)細(xì)胞壁水解酶基因的調(diào)控，故對(duì)桃果實(shí)抗冷性起正調(diào)控作用。在本研究中，MT處理通過(guò)上調(diào)MiETR1、MiERS1、MiERF1和MiEIN2的表達(dá)并下調(diào)MiCTR1的表達(dá)而引發(fā)乙烯信號(hào)向下游傳遞，因此能夠激活下游成熟相關(guān)基因的表達(dá)，最終促進(jìn)了成熟并延緩果實(shí)CI發(fā)生。類(lèi)似的結(jié)論也在MT處理的番茄果實(shí)[50]中得到印證。

CBF信號(hào)途徑在調(diào)控植物耐冷性中發(fā)揮著重要作用[51]。CBF是APETALLA2（AP2）型轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠結(jié)合到冷響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活其轉(zhuǎn)錄[51]。ICE1是CBF信號(hào)途徑上游的關(guān)鍵組分。目前，CBF信號(hào)途徑在外源處理誘導(dǎo)果實(shí)抗冷性中的作用已被廣泛報(bào)道。例如，低溫預(yù)貯處理可提高芒果MiCBF1表達(dá)水平，從而提高果實(shí)抗冷能力[5]。Hu Shuqing等[52]報(bào)道，24-表油菜素內(nèi)酯處理可誘導(dǎo)冷藏桃果實(shí)體內(nèi)PpCBF5上調(diào)表達(dá)，其進(jìn)一步介導(dǎo)PpPLD和PpLipase的轉(zhuǎn)錄抑制，從而延緩膜磷脂降解和脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，減輕桃果實(shí)CI發(fā)生。另有報(bào)道，外源乙烯處理通過(guò)提高SlICE1和SlCBF1表達(dá)增強(qiáng)了番茄果實(shí)對(duì)低溫脅迫的耐受性，表明ICE/CBF與乙烯二者信號(hào)途徑之間可能存在交互作用[45]。在本研究中，對(duì)照果實(shí)MiCBF1和MiICE1基因相對(duì)表達(dá)量在貯藏前期有所增加，表明果實(shí)積極響應(yīng)低溫脅迫后的環(huán)境變化。與對(duì)照果實(shí)相比，外源MT處理促進(jìn)了MiCBF1和MiICE1表達(dá)水平提高，表明二者基因參與了MT誘導(dǎo)的芒果果實(shí)抗CI作用，同時(shí)推測(cè)其可能夠受上游乙烯信號(hào)途徑調(diào)控，相關(guān)推論需今后進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，外源MT處理能夠有效減輕芒果果實(shí)由低溫轉(zhuǎn)入常溫后的CI，并通過(guò)促進(jìn)呼吸作用、乙烯合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁代謝而加速果實(shí)成熟和軟化。此外，MT處理上調(diào)了芒果果實(shí)冷響應(yīng)基因的表達(dá)，故可提高果實(shí)對(duì)貯藏溫度變化的適應(yīng)性。研究結(jié)果為MT用于芒果冷藏保鮮提供了理論依據(jù)。