宰后貯藏期間灘羊肉線粒體氧化磷酸化與色澤穩(wěn)定性的關(guān)系

王金霞，楊 波，羅瑞明，李 榮，陳雪妍，張 倩，胡麗筠

（寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750000）

灘羊是廣泛分布于寧夏、甘肅、陜西等地的區(qū)域性優(yōu)質(zhì)家畜品種，其肉質(zhì)細(xì)嫩、無膻味、營養(yǎng)豐富、脂肪分布均勻，備受消費(fèi)者喜愛，具有重要的經(jīng)濟(jì)及食用價值。消費(fèi)者往往通過肉表面的顏色來判斷肉的健康與新鮮程度，長期以來，因肉色的褐變已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，僅美國年均損失就高達(dá)數(shù)十億美元[1]，因此探究動物宰后貯藏期間影響肉色的因素提高肉色穩(wěn)定性避免造成經(jīng)濟(jì)損失是當(dāng)前的首要任務(wù)。

肉的色澤穩(wěn)定性通常由肌紅蛋白（myoglobin，M b）、血紅蛋白和一些微量有色代謝物維持。在充分放血的肌肉中，Mb含量占總色素含量的75%左右[2]，是影響宰后肉色澤穩(wěn)定性的主要因素[3]。脫氧肌紅蛋白（deoxymyoglobin，DeoMb）、氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）以及高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）是Mb主要存在的3 種形式，肉的色澤穩(wěn)定性是由3 種Mb的含量以及存在比例所決定。

氧化磷酸化系統(tǒng)由線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）和復(fù)合物V（ATP合酶）組成。氧化磷酸化是一個生物化學(xué)過程，是物質(zhì)在線粒體內(nèi)氧化釋放的能量通過呼吸鏈供給ADP與無機(jī)磷酸合成ATP的偶聯(lián)反應(yīng)，即ETC和ATP形成的偶聯(lián)機(jī)制稱為氧化磷酸化。氧化磷酸化可產(chǎn)生ATP，還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體（flavine adenine dinucleotide，F(xiàn)ADH2）的還原物從復(fù)合物I（NADH-輔酶Q氧化還原酶）或II（琥珀酸-Q氧化還原酶）通過復(fù)合體III（Q-細(xì)胞色素c氧化還原酶）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素c，其中O2在反應(yīng)中被還原為水，而被氧化的自由能均在復(fù)合物I、III和IV（細(xì)胞色素c氧化酶）中釋放，作為電化學(xué)勢通過質(zhì)子從基質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜間空間，電化學(xué)勢的能量被ATP合酶利用驅(qū)動催化反應(yīng)ADP+磷酸→ATP以滿足細(xì)胞行使功能所需能量[4]，同時氧化磷酸化參與調(diào)節(jié)各種關(guān)鍵細(xì)胞活動，例如ROS的產(chǎn)生和封存[5]、鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞衰老等[6]。

近年來國內(nèi)外學(xué)者在肉品貯藏加工過程中對影響肉色及其穩(wěn)定性的內(nèi)外部因素穩(wěn)定性方面做了大量研究。張玉斌等[7]研究表明，作為線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)中間代謝物，乳酸鹽的氧化過程是導(dǎo)致MetMb還原的原因，線粒體的還原能力可以影響氧消耗、MetMb還原以及Mb氧化還原狀態(tài)，進(jìn)而影響牛肉色澤的穩(wěn)定性。Tang Jiali等[8]選用在三羧酸循環(huán)過程中不會產(chǎn)生NADH的琥珀酸鹽作為反應(yīng)底物，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線粒體調(diào)節(jié)的MetMb還原是在低氧壓或電子在電子傳遞鏈上積累的條件下，通過細(xì)胞色素將可用電子傳遞給MetMb實(shí)現(xiàn)。Mancini等[9]研究表明，相較于OxyMb，DeoMb性質(zhì)不穩(wěn)定，更易被氧化成OxyMb和MetMb。劉維[10]以蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)，對貯藏期間牛肉的變色機(jī)理進(jìn)行了初步探討，其研究結(jié)果表明，在貯藏期間，參與線粒體能量代謝的多種相關(guān)酶類與線粒體的活性及其MetMb的還原力有直接關(guān)系，其變化會直接影響肉色。以上研究結(jié)果表明線粒體內(nèi)相關(guān)酶活性的變化對肉色及其穩(wěn)定性有顯著影響，但鮮見從宰后成熟期間氧化磷酸化變化的角度解析灘羊肉的色澤穩(wěn)定性變化機(jī)制的報道。

本實(shí)驗(yàn)以灘羊背最長肌為研究對象，通過測定其在4 ℃貯藏8 d過程中氧化磷酸化變化對色澤穩(wěn)定性的影響，并對其進(jìn)行相關(guān)性分析，以此闡明灘羊肉貯藏期間氧化磷酸化與色澤穩(wěn)定性的關(guān)系，為后續(xù)揭示氧化磷酸化調(diào)控色澤穩(wěn)定性的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用灘羊背最長肌來自寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司，選取胴體質(zhì)量相近的6 月齡公灘羊12 只，宰前遵循《寧夏回族自治區(qū)家禽屠宰管理?xiàng)l例》，屠宰后立即用滅菌刀取下右側(cè)背最長肌，剔除可見脂肪與結(jié)締組織后，置于聚乙稀薄膜內(nèi)，用錫紙包裝后置于帶有編號的保鮮袋中，貯存在4 ℃條件下，在成熟0、1、2、3、4、6、8 d時分別檢測相應(yīng)指標(biāo)。

磷酸鹽緩沖液 上海麥克林生化科技有限公司；生理鹽水（0.8%）、Tris-HCl（1 mol/L，pH 7.0）、蔗糖（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）探針 上海懋康生物科技有限公司；線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I、II、III、IV、V活性檢測試劑盒、核苷酸檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）試劑盒、NADH檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒、詹納斯綠B染色液（0.2%）北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（J C-1）上海碧云天生物科技有限公司；羊高鐵肌紅蛋白還原酶（metmyoglobin reductase，MetMbase）檢測試劑盒北京清析技術(shù)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Minolta CM-600d色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)傳感股份有限公司；UV-1200紫外分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；JXFSTPRP-CL全自動樣品冷凍研磨儀上海凈信有限公司；352型酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；TGL-24M高速冷凍離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；NanoElute超高效液相色譜儀 德國Bruker公司；EnSpire熒光酶標(biāo)儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集0、1、2、3、4、6、8 d的樣品各50 g，用于測定色澤指標(biāo)L*、a*、b*值及各Mb衍生態(tài)相對含量；采集不同成熟期間的樣品各20 g，迅速置于液氮中放置2 h后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于其他指標(biāo)測定。

1.3.2 肉色指標(biāo)的測定

使用色差儀測定不同貯藏期間樣品的L*、a*、b*值，測量前用白盤校準(zhǔn)儀器，每個樣本分別在3 個不同位置測定，結(jié)果取其平均值。并在測定時讀取樣品在630 nm及580 nm處的反射率，計算630 nm與580 nm的比值，記為R630/R580。

1.3.3 3 種Mb相對含量的測定

參考鄔威[11]的方法，并略作修改。稱取不同貯藏時間的樣本各5 g，加入25 mL磷酸鹽緩沖液后置于冷凍勻漿機(jī)中4 ℃勻漿180 s。將勻漿后的混合液置于4 ℃冰箱中保存1 h后取出置于離心機(jī)中4 ℃、4 500×g離心30 min，棄沉淀并加入磷酸鹽緩沖液補(bǔ)充上清液至25 mL，分別在503、525、557、582 nm處測定其吸光度，DeoMb、OxyMb及MetMb相對含量的計算公式如下：

1.3.4 MetMbase活性的測定

實(shí)驗(yàn)操作按照羊MetMbase檢測試劑盒的要求進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度。

1.3.5 線粒體氧化磷酸化各項(xiàng)指標(biāo)測定

1.3.5.1 線粒體膜通透性與線粒體膜電位的測定

線粒體的提取參照Sun Lijuan等[12]方法。參考Halestrap[13]的方法測定線粒體膜通透性，測定線粒體懸浮液在520 nm波長下的吸光度（A520nm），依據(jù)A520nm的變化判定線粒體膜通透性的改變。如果溶液吸光度降低，表明線粒體膜通透性增加，反之則表明線粒體膜通透性降低。

實(shí)驗(yàn)操作按照線JC-1檢測試劑盒的要求進(jìn)行，采用熒光酶標(biāo)儀分別測定熒光強(qiáng)度。JC-1單體產(chǎn)生綠色熒光，激發(fā)波長設(shè)置為490 nm，發(fā)射波長設(shè)置為530 nm；JC-1聚合物產(chǎn)生紅色熒光，激發(fā)波長設(shè)置為525 nm，發(fā)射波長設(shè)置為590 nm，線粒體膜電位按下式計算：

1.3.5.2 核苷酸含量的測定

按照核苷酸含量檢測試劑盒的要求進(jìn)行。

1.3.5.3 線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I、II、III、IV、V活性測定

實(shí)驗(yàn)操作按照線粒體復(fù)合物檢測試劑盒的要求進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

1.3.5.4 內(nèi)源抗氧化酶活力的測定

實(shí)驗(yàn)操作按照CAT、SOD、GSH-Px檢測試劑盒的要求進(jìn)行，使用紫外分光光度計或酶標(biāo)儀測定。

1.3.5.5 ROS水平測定

參考張玉林[14]的方法，并略作修改。取已經(jīng)剔除脂肪與結(jié)締組織的肉樣0.1 g，置于Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、0.8 g/100 mL NaCl、0.1 mmol/L EDTA-2Na、10 mmol/L蔗糖，pH 7.4）中混合，在4 ℃、60 Hz條件下勻漿30 s，3 000×g冷凍離心15 min，收集上清液，采用雙縮脲法測定上清液的蛋白質(zhì)量濃度。ROS相對含量的測定方法如下：取100 μL的上清液與100 μL反應(yīng)緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、0.8 g/100 mL NaCl、0.1 mmol/L EDTA-2Na、10 mmol/L蔗糖，10 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4）在酶標(biāo)板內(nèi)迅速混合，采用熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長480 nm、發(fā)射波長525 nm處立即測定孵育前的熒光強(qiáng)度，再置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后再次測定孵育后熒光強(qiáng)度，ROS水平按下式計算：

1.3.5.6 NADH含量的測定

實(shí)驗(yàn)操作按照NADH檢測試劑盒的要求進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間色澤指標(biāo)的變化

色澤是評價肉品質(zhì)最直觀的指標(biāo)之一，決定了肉品的經(jīng)濟(jì)價值與食用價值。如表1所示，L*、a*、b*值在0～8 d均呈先升高后降低趨勢（P＜0.05），L*值在3 d時達(dá)到最大值，而a*、b*值在2 d時達(dá)到最大值。如圖1所示，宰后0～8 d，R630/R580呈先升高后下降趨勢（P＜0.05）。

圖1 貯藏期間R630/R580的變化Fig.1 Changes of R630/R580 during storage

表1 灘羊宰后貯藏期間肉色的變化Table 1 Changes in colour parameters during storage

2.2 貯藏期間3 種Mb相對含量的變化

MetMb、OxyMb、DeoMb是Mb的3 種衍生態(tài)。肉色主要由這3 種Mb相對含量[15]。如圖2所示，貯藏期間灘羊背最長肌中的MetMb相對含量呈顯著下降后上升趨勢（P＜0.05），OxyMb 相對含量先上升后下降（P＜0.05），而DeoMb相對含量變化整體呈下降趨勢（P＜0.05），結(jié)果表明MetMb和OxyMb是貯藏期間Mb的主要存在形式。

圖2 貯藏期間3 種Mb相對含量的變化Fig.2 Changes in relative contents of MetMb,OxyMb and DeoMb during storage

2.3 貯藏期間MetMbase活力的變化

MetMbase是MetMb還原系統(tǒng)的關(guān)鍵酶類，可以通過NAD+的作用將MetMb還原成OxyMb，從而提升肉色穩(wěn)定性[16]。灘羊宰后貯藏期間背最長肌的MetMbase活性變化如圖3所示，貯藏0～8 d內(nèi)，MetMbase活性呈顯著下降趨勢（P＜0.05），本研究結(jié)果可與2.2節(jié)中MetMb相對含量顯著上升結(jié)果相互印證。

圖3 貯藏期間MetMbase活性的變化Fig.3 Changes in MetMbase activity during storage

2.4 貯藏期間線粒體膜通透性和膜電位變化

由圖4A可知，隨著貯藏時間的延長線粒體膜通透性顯著上升（P＜0.05）；如圖4B所示，線粒體膜電位在貯藏0～8 d顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果表明灘羊宰后貯藏期間線粒體的完整性遭到破壞。

圖4 貯藏期間線粒體膜通透性（A）和膜電位（B）變化Fig.4 Changes in mitochondrial membrane permeability (A) and membrane potential (B) during storage

2.5 貯藏期間核苷酸含量變化

由圖5可知，ATP、ADP、AMP含量隨著貯藏時間的延長均顯著下降（P＜0.05）。這可能是因?yàn)闉┭蛟缀筚A藏期間為保證細(xì)胞各項(xiàng)生命活動正常進(jìn)行，ATP被快速消耗，雖然ATP、ADP和AMP時刻不停地發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，但這僅能緩解短期內(nèi)的能量缺乏[17]，因此，ATP、ADP、AMP水平在宰后貯藏期間呈持續(xù)降低趨勢。

圖5 貯藏期間核苷酸含量變化Fig.5 Changes in nucleotide content during storage

2.6 貯藏期間線粒體復(fù)合物I、II、III、IV、V活性變化

由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，線粒體復(fù)合物I、II、III、IV活性呈下降趨勢（P＜0.05）；線粒體復(fù)合物V呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。這可能是因?yàn)殡S著貯藏時間的延長，線粒體電子傳遞鏈各個復(fù)合物內(nèi)部的亞基發(fā)生了變化，這些變化可能會影響復(fù)合物的組裝，進(jìn)而導(dǎo)致各個復(fù)合物活性受到不同程度的影響[18]。

圖6 貯藏期間線粒體復(fù)合物I、II、III、IV、V活性Fig.6 Activities of mitochondrial complex I,II,III,IV and V during storage

2.7 貯藏期間內(nèi)源抗氧化酶活性的變化

由圖7A可知，貯藏0～6 d期間CAT活性顯著下降（P＜0.05）；貯藏6～8 d其活性上升（P＜0.05）；如圖7B、C所示，貯藏期間SOD、GSH-Px活性呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。

圖7 貯藏期間內(nèi)源抗氧化酶活性的變化Fig.7 Changes in endogenous antioxidant activity during storage

2.8 貯藏期間線粒體ROS水平的變化

由圖8可知，貯藏0～1 d灘羊背最長肌的ROS水平變化不顯著（P＞0.05），這可能是因?yàn)镽OS產(chǎn)生初期被體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)所清除；1 d后灘羊背最長肌的ROS水平顯著上升（P＜0.05），這是因?yàn)閮?nèi)源抗氧化酶的活力隨貯藏時間的延長而降低，導(dǎo)致ROS含量逐漸積累增加[19]。

圖8 貯藏期間ROS水平變化Fig.8 Changes in ROS levels during storage

2.9 貯藏期間NADH含量的變化

NADH是MetMb還原酶系統(tǒng)中最關(guān)鍵的輔酶，MRA活性受NADH濃度變化影響較為顯著。如圖9所示，隨著貯藏時間的延長，灘羊背最長肌中的NADH含量顯著下降（P＜0.05）。

圖9 貯藏期間NADH含量的變化Fig.9 Changes in NADH content during storage

2.10 氧化磷酸化與色澤穩(wěn)定性的相關(guān)性分析

如圖10所示，線粒體膜通透性、線粒體膜電位與復(fù)合物I、II、III、IV顯著正相關(guān)（P＜0.001），與復(fù)合物V顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這說明在宰后貯藏期間線粒體的完整性會顯著影響復(fù)合物活性。DeoMb、OxyMb與復(fù)合物I、II、III、IV顯著正相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），與復(fù)合物V顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；MetMb與復(fù)合物I、II、III、IV顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與復(fù)合物V顯著正相關(guān)（P＜0.05、P＜0.001）。肌細(xì)胞線粒體可以通過復(fù)合物III和IV之間電子傳輸介導(dǎo)的還原、電子流的逆轉(zhuǎn)以及存在于外膜內(nèi)的MetMbase增強(qiáng)Mb的還原，進(jìn)而對色澤穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。ATP與DeoMb、OxyMb顯著正相關(guān)（P＜0.05、P＜0.001），與MetMb顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），這可能是因?yàn)锳TP會抑制ETC的傳遞從而降低線粒體還原MetMb的能力，進(jìn)而對3 種Mb相對含量造成影響[20]。內(nèi)源抗氧化酶體系與DeoMb和OxyMb呈正相關(guān)，與MetMb呈負(fù)相關(guān)，這說明自由基清除能力的減弱，會使過氧化物攻擊線粒體造成MetMb的累積和線粒體的損傷。ROS與DeoMb、OxyMb顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與MetMb顯著正相關(guān)（P＜0.001），這是因?yàn)镽OS降低了線粒體抗氧化功能，造成線粒體損傷，致使MetMb不斷積累[21]。

圖10 貯藏期間氧化磷酸化與色澤穩(wěn)定性的相關(guān)性分析Fig.10 Analysis of correlation between oxidative phosphorylation and color stability during storage

3 討論

隨著貯藏時間的延長，灘羊背最長肌L*值先上升后下降趨勢，這可能因?yàn)橘A藏期間肌肉pH值的變化顯著影響機(jī)體內(nèi)代謝酶的活性，當(dāng)pH值降至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)發(fā)生變性導(dǎo)致肌原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，當(dāng)游離水滲出到肌肉表面時會增強(qiáng)光的反射率，從而使得肌肉L*值升高，此過程還調(diào)控肌肉中的a*、b*值[22]。隨著貯藏時間的延長，a*值呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），這可能是因?yàn)镸b與空氣中的O2長時間的接觸產(chǎn)生了較多的OxyMb，致使a*值呈升高趨勢[23]。但由于氧環(huán)境的存在，肌肉中時刻發(fā)生OxyMb與MetMb的不可逆轉(zhuǎn)換并積累，最終導(dǎo)致a*值開始不斷降低。b*值表示肉樣的黃度值，貯藏期間b*值呈先上升后下降趨勢，這可能是因?yàn)镺xyMb被不可逆的氧化為MetMb所導(dǎo)致。R630/R580通常與a*值呈正相關(guān)，可間接反映出新鮮肉類中MetMb的含量，其比值越大，MetMb在肌肉中的含量越小。宰后0～8 d，R630/R580呈先升高后下降趨勢（P＜0.05），這則是因?yàn)閯偙煌涝椎臑┭蛉庵蠱etMb并不是Mb的主要存在形式，貯藏0～1 d由于MRA不斷還原MetMb使得R630/R580呈升高趨勢，隨著貯藏時間的延長，由于OxyMb被不可逆的氧化為MetMb導(dǎo)致R630/R580呈下降趨勢，此結(jié)果可與2.2節(jié)的結(jié)果相互印證。

DeoMb、OxyMb與MetMb在鮮肉中的含量和比例直接影響肉的顏色[24]。剛被屠宰的肌肉中，Mb為還原態(tài)的紫紅色的DeoMb，由于貯藏期間環(huán)境中的氧氣充足，Mb被轉(zhuǎn)換成了鮮紅色的OxyMb，隨著貯藏時間的延長，Mb被進(jìn)一步氧化成了褐色的MetMb，為抑制肉色劣變，動物組織中存在的天然還原系統(tǒng)可將MetMb進(jìn)一步還原成DeoMb。隨著貯藏時間的延長，灘羊背最長肌中的MetMb相對含量呈顯著下降后上升趨勢（P＜0.05），OxyMb相對含量顯著上升后下降（P＜0.05），而DeoMb相對含量隨著MetMbase系統(tǒng)的破壞整體呈下降趨勢（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與張萌[25]的研究結(jié)果并不相同，這可能是因?yàn)槲锓N不同所導(dǎo)致的差異。

MetMbase可維持Mb血紅素輔基中鐵離子的還原狀態(tài)，以保持理想的OxyMb水平，維持肉色穩(wěn)定性[26]，宰后貯藏初期MetMbase活力相對較高，可迅速將被氧化的OxyMb還原，致使MetMb的積累速率相對較低。貯藏期間MetMbase活力顯著下降，可能是因?yàn)殡S著貯藏時間的延長線粒體完整性遭到破壞[15]以及脂肪氧化產(chǎn)生自由基導(dǎo)致Mb卟啉環(huán)上Fe3+的外層電子發(fā)生了能量躍變[27]。

肌細(xì)胞中線粒體是儲存和供應(yīng)能量的重要細(xì)胞器，線粒體內(nèi)膜構(gòu)型變化、線粒體內(nèi)膜的結(jié)合和重組以及各種代謝物通過線粒體內(nèi)膜的傳送等反應(yīng)都與線粒體氧化磷酸化作用有著密切的關(guān)系[28]。Mancini等[29]認(rèn)為線粒體功能結(jié)構(gòu)以及線粒體完整性的改變會對肉色穩(wěn)定性造成影響。通常以線粒體膜通透性、線粒體膜電位變化作為線粒體膜損傷的標(biāo)志[30]。本研究中，線粒體膜通透性與線粒體膜電位隨著貯藏時間的延長均顯著下降，原因可能是隨著貯藏時間的延長，氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)功能及完整性受到破壞[31]。這與師希雄等[32]對冰溫貯藏過程中甘南藏羊后腿線粒體膜電位及線粒體膜通透性變化規(guī)律的研究結(jié)果類似。

線粒體的核心功能是泵送質(zhì)子穿過內(nèi)膜以產(chǎn)生具有高勢能的梯度（即線粒體膜電位）的能力，這種勢能隨后被用于驅(qū)動多亞基單位ATP合酶復(fù)合物合成ATP[33]。宰后成貯藏期間，灘羊肌細(xì)胞線粒體ATP、ADP、AMP含量整體呈顯著下降趨勢，一方面這可能是因?yàn)樵缀蠛粑袛嘁鸬奶墙徒夥磻?yīng)快速消耗ATP；另一方面則可能是因?yàn)樵缀蠊┭醴绞降母淖儗?dǎo)致線粒體中氧化還原電位下降，氧化磷酸化功能受到障礙，不能正常合成ATP，導(dǎo)致了肌細(xì)胞內(nèi)ATP的生成量迅速降低。而灘羊宰后肌肉組織中不斷發(fā)生ATP→ADP→AMP不可逆的降解[34]，因此隨著ATP含量的降低，致使ADP、AMP的含量也逐漸降低。

Griffith[35]認(rèn)為線粒體膜結(jié)構(gòu)功能的損傷會對線粒體膜中氧化磷酸化生化反應(yīng)功能造成衰退。氧化磷酸化系統(tǒng)包括復(fù)合物I、復(fù)合物II、復(fù)合物III、復(fù)合物IV、復(fù)合物V等[36]。復(fù)合物I負(fù)責(zé)催化NADH脫氫生成NAD+[37]。復(fù)合物II主要負(fù)責(zé)將琥珀酸催化生成延胡索酸，并將產(chǎn)生的電子最終傳遞給泛醌[38]。復(fù)合物III主要負(fù)責(zé)將電子從輔酶Q的傳遞給細(xì)胞色素c。復(fù)合物IV是ETC的終端電子受體，主要通過將電子從細(xì)胞色素c轉(zhuǎn)移到O2，將O2轉(zhuǎn)化為水[39]。復(fù)合物V是氧化磷酸化途徑中的終點(diǎn)酶，當(dāng)電子通過ETC移動時，質(zhì)子被抽出線粒體內(nèi)膜，返回線粒體基質(zhì)參與復(fù)合物V催化的ATP合成反應(yīng)中[26]。

ROS是具有活性化學(xué)性質(zhì)的信號分子，能降低線粒體抗氧化能力，造成線粒體損傷[21]。當(dāng)機(jī)體受損或處于缺血缺氧狀態(tài)會產(chǎn)生過量的ROS，線粒體產(chǎn)生ROS的速率受線粒體內(nèi)膜跨膜電位的調(diào)節(jié)。隨著貯藏時間的延長，內(nèi)源抗氧化酶逐漸失活，不能夠及時清除機(jī)體內(nèi)過量的ROS，導(dǎo)致ROS含量逐漸積累增加，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生[40]，使線粒體完整性遭到破壞。

機(jī)體內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)能夠清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS[41]。SOD是抗氧化系統(tǒng)中最重要的酶，主要負(fù)責(zé)催化超氧陰離子歧化成H2O2[43]，CAT進(jìn)一步將H2O2催化分解為水和氧氣。馬森[43]認(rèn)為GSH-Px能夠促進(jìn)GSH參與過氧化，代謝細(xì)胞呼吸過程中的過氧化物和羥自由基，從而保護(hù)線粒體完整性不受到破壞。本研究發(fā)現(xiàn)CAT活性在貯藏0～6 d顯著下降，但在6 d后卻顯著上升，這可能是因?yàn)橥赟OD活力的持續(xù)下降，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，致使CAT活力開始升高。

MetMbase是NADH依賴型還原酶，因此NADH含量是Mb還原系統(tǒng)的主要影響因素之一[16]。貯藏期間NADH含量呈顯著降低趨勢，這可能是由于隨著貯藏時間的延長，線粒體呼吸功能受到影響，導(dǎo)致氧化磷酸化進(jìn)程受到阻礙，從而引起NADH含量顯著下降。

比較不同貯藏期間氧化磷酸化各指標(biāo)與肉色之間的關(guān)系可以看出，線粒體結(jié)構(gòu)及功能的變化與肉色之間有顯著相關(guān)性。在特定的肌肉中，Mb濃度與復(fù)合物IV活性相關(guān)[44]。崔樹娜等[45]向復(fù)合體III抑制劑預(yù)處理的線粒體中加入琥珀酸和NAD，增加了NADH濃度，增強(qiáng)了MetMb的還原，即線粒體可以通過復(fù)合物III和IV之間電子傳輸介導(dǎo)的還原、電子流的逆轉(zhuǎn)以及存在于外膜內(nèi)的MetMbase增強(qiáng)Mb的還原，進(jìn)而對色澤穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。此外，線粒體接觸肉中本身的氧化劑，如脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛[46]和無機(jī)鐵離子[47]也會損害Mb和色澤穩(wěn)定性。宰后貯藏期間，ROS會攻擊Mb卟啉環(huán)上鐵離子外層電子的躍變，從而破壞MetMbase，使血紅素Fe2+被氧化為Fe3+產(chǎn)生褐色[48]。

綜上所述，宰后貯藏期間灘羊肉中抗氧化體系的失效導(dǎo)致ROS含量的積累等因素最終引起線粒體膜通透性隨貯藏時間的延長而增大，線粒體膜電位隨貯藏時間的延長而減小，即線粒體完整性遭到破壞，導(dǎo)致位于線粒體內(nèi)膜的氧化磷酸化相關(guān)酶活性隨貯藏時間延長而發(fā)生改變，影響肌肉中MetMbase系統(tǒng)的活性，致使MetMbase活力不斷降低，造成了MetMb的累積，進(jìn)而對肉品的L*、a*、b*值產(chǎn)生影響，最終引起灘羊肉色發(fā)生劣變。

4 結(jié)論

灘羊肉4 ℃貯藏期間，隨貯藏時間的延長，L*、a*、b*值均呈先上升后下降趨勢；R630/R580先升高后顯著下降；MetMb相對含量呈先下降后上升趨勢，OxyMb相對含量先上升后下降；DeoMb相對含量變化整體呈下降趨勢；線粒體膜通透性、膜電位持續(xù)下降；線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I、II、III、IV活性顯著下降，復(fù)合物V活性顯著升高；ROS水平顯著上升；內(nèi)源抗氧化酶體系整體呈下降趨勢；核苷酸含量顯著下降；Mb衍生態(tài)相對含量、肉色指標(biāo)與線粒體膜通透性、線粒體膜電位、復(fù)合物（I、II、III、IV、V）活性以及ATP、SOD、GSH-Px、CAT活性和ROS呈顯著相關(guān)性。以上結(jié)果表明，宰后貯藏期間灘羊肉中內(nèi)源抗氧化酶系的失效導(dǎo)致肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS，致使線粒體完整性受到破壞，對線粒體氧化磷酸化相關(guān)酶活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響肌細(xì)胞中MetMbase系統(tǒng)的活力，致使MetMb無法被還原，最終導(dǎo)致灘羊肉色澤穩(wěn)定性變差。