平臥菊三七提取物降尿酸活性的物質(zhì)基礎(chǔ)分析

馬文婧，付桂明,2，趙富強，林素欽，萬 茵,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與資源挖掘全國重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)國際食品創(chuàng)新研究院，江西 南昌 330020）

平臥菊三七（Gynura procumbens）又稱蔓三七、蛇接骨、神仙草，是菊科菊三七屬攀援草本植物，廣泛分布于亞洲熱帶國家。《云南中草藥》及《云南思茅中草藥選》介紹其通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛、消炎止咳、散瘀消腫、活血生肌，可用于治療軟組織挫傷、骨折和風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛。衛(wèi)生部2012年第8號公告宣布允許將平臥菊三七列為普通食品。Rosidah等[1]通過急性和亞慢性毒性研究，證明平臥菊三七不具有毒理學(xué)問題。諸多研究圍繞平臥菊三七的成分分析和藥理分析方面進行展開。Liu Mi等[2]基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜結(jié)合特征離子過濾策略，快速篩選出具有抗氧化和抗炎特性的平臥菊三七活性成分，包括多酚如環(huán)氨酸、異綠原酸A和異綠原酸C等物質(zhì)。Hew等[3]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析從平臥菊三七葉中鑒定出92 種蛋白質(zhì)，其中變味蛋白作為一種天然掩味劑或可為其帶來巨大商業(yè)價值。Murugesu等[4]使用樹脂分離技術(shù)富集平臥菊三七乙醇提取物中咖啡?？鼘幩?，比較其降血脂和抗氧化潛力。平臥菊三七及其活性成分具有廣泛的藥理特性，包括抗心血管疾病[5]、降血糖[6-8]、降血脂[9]、抗氧化[10]、抗菌[11]、抗腫瘤[12-13]、抗炎[13]等。植物的藥理作用歸因于其豐富的植物成分，目前已從平臥菊三七中分離出來不同的化學(xué)類別，包括生物堿、黃酮類、酚類、甾體類、蛋白質(zhì)類和多糖類。

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是一種代謝性疾病。尿酸是人和靈長類動物嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，它是通過黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）催化次黃嘌呤或黃嘌呤合成的[14]。當(dāng)尿酸在人體內(nèi)代謝失衡造成蓄積時，會導(dǎo)致HUA的產(chǎn)生?，F(xiàn)對HUA的藥物治療主要針對抑制尿酸的生成和促進尿酸的排泄，如別嘌呤醇（allopurinol，ALP）和苯溴馬隆等，但藥物副作用大，利用天然產(chǎn)物的降尿酸活性對HUA進行預(yù)防和治療成為研究熱點。Rosidah等[15]通過各種已建立的體外抗氧化系統(tǒng)驗證平臥菊三七甲醇提取物及各萃取組分的抗氧化活性，其中總酚含量與抗氧化特性表現(xiàn)出高度相關(guān)。許溪等[16]發(fā)現(xiàn)平臥菊三七的干預(yù)能有效降低急性痛風(fēng)小鼠的血尿酸值、扭體次數(shù)以及耳腫脹程度。胡居吾[17]以不同劑量平臥菊三七有提取物治療酵母膏和氧嗪酸鉀誘導(dǎo)聯(lián)合誘導(dǎo)的HUA小鼠，有顯著降尿酸效果。以上文獻說明平臥菊三七有作為降尿酸功能食品原料的潛力，但其降尿酸物質(zhì)基礎(chǔ)仍值得探討。

本研究對不同提取物進行體外降尿酸及抗氧化活性分析，評估不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取對平臥菊三七提取物中成分組成以及XOD抑制活性、抗氧化能力的綜合影響，基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析平臥菊三七乙醇提取物成分差異，探討平臥菊三七提取物對HUA小鼠的保護作用，以期進一步研究平臥菊三七降尿酸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為平臥菊三七降尿酸活性物質(zhì)的制備和功能食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性SPF級昆明小鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，小鼠體質(zhì)量為18～22 g。

平臥菊三七干品原料購自江西省豐城市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院喻理德副教授鑒定為菊科菊三七屬植物平臥菊三七（G.procumbens）。

XOD、乙腈、氧嗪酸鉀 默克化工技術(shù)（上海）有限公司；羧甲基纖維素鈉、黃嘌呤、ALP、次黃嘌呤、氯化硝基四氮唑藍(lán) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；焦磷酸鈉、福林-酚試劑、蘆丁、碳酸鈉、氯化鋁、亞硝酸鈉、沒食子酸 西隴科學(xué)股份有限公司；尿酸、尿素氮、肌酐、XOD、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；無水乙醇為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Vanquish超高效液相系統(tǒng)（配有Thermo Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜檢測器）美國Thermo Fisher Scientific公司；HH-6數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋 常州市金壇市友聯(lián)儀器研究所；FA1604精密電子天平、UV-7504紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SCI-VS可調(diào)式混勻儀 大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司；KQ-400KDE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；高速組織研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

平臥菊三七除雜、自然干燥后粉碎過60 目篩，得平臥菊三七粉，置于干燥器備用。實驗分成3 組，每組稱取5 g平臥菊三七粉，分別使用蒸餾水及體積分?jǐn)?shù)30%和70%的乙醇溶液在70 ℃條件下進行回流提取1 h，重復(fù)提取兩次，合并提取液后抽濾，濃縮后冷凍干燥得平臥菊三七水提取物（water extract fromG.procumbens，GW）、平臥菊三七30%醇提物（30% ethanol extract fromG.procumbens，GT）和平臥菊三七70%醇提物（70% ethanol extract fromG.procumbens，GS），密封保存?zhèn)溆谩z測前取一定量提取物復(fù)水成待測液。

1.3.2 總酚含量測定

參照孟醒[18]的實驗方法，并進行適當(dāng)修改。提取物以2 mg/mL復(fù)溶，取0.2 mL待測液于試管中，再加入0.5 mL福林-酚試劑搖勻，加入4 mL 4%碳酸鈉溶液振蕩。避光靜置30 min后765 nm波長處比色測定，以蒸餾水代替待測液作為空白。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液為對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚含量（以每克干質(zhì)量中的沒食子酸質(zhì)量計）。

1.3.3 總黃酮含量測定

參照趙艷[19]的實驗方法，提取物以2 mg/mL復(fù)溶，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定總黃酮含量。以蘆丁為對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量（以每克干質(zhì)量中的蘆丁質(zhì)量計）。

1.3.4 總?cè)坪繙y定

參照葉芝紅等[20]的實驗方法，提取物以2 mg/mL復(fù)溶，采用香草醛-高氯酸顯色反應(yīng)測定總?cè)啤Ｒ匀藚⒃碥誖g1標(biāo)準(zhǔn)液為對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總?cè)坪浚ㄒ悦靠烁少|(zhì)量中的人參皂苷Rg1質(zhì)量計）。

1.3.5 總有機酸含量測定

參照趙玉榮等[21]的實驗方法，提取物以2 mg/mL復(fù)溶，采用電位滴定法測定總有機酸（以每克干質(zhì)量中的蘋果酸質(zhì)量換算總有機酸含量）。

1.3.6 總糖測定

參照程敏等[22]的實驗方法，提取物以1 mg/mL復(fù)溶，采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量（以每克干質(zhì)量中的葡萄糖質(zhì)量換算總糖含量）。

1.3.7 抑制XOD的能力測定

參照沈月峰等[23]的實驗方法，提取物以10 mg/mL復(fù)溶，測定樣品溶液對XOD的抑制能力。

1.3.8 超氧陰離子自由基清除能力測定

參照Zhao Mouming等[24]的實驗方法，提取物以2 mg/mL復(fù)溶，測定樣品溶液對超氧陰離子自由基的清除能力。

1.3.9 代謝組學(xué)分析

1.3.9.1 樣品處理

精確稱量1 mg提取物于2 mL離心管中，加入600 μL甲醇（含2-氯-L-苯丙氨酸（4 mg/L）），渦旋振蕩30 s；加入100 mg玻璃珠，放入組織研磨器中，60 Hz研磨90 s；室溫超聲15 min；12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾，過濾液加入到檢測瓶中，用于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測。

1.3.9.2 UPLC-MS/MS條件

UPLC條件：色譜柱為ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流速為0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL；正離子模式，流動相為0.1%甲酸乙腈溶液（C）和0.1%甲酸水溶液（D），梯度洗脫程序：0～1 min，2% C、98% D；1～9 min，2%～50% C、98%～50% D；9～12 min，50%～98% C、50%～2% D；12～13.5 min，98% C、2% D；13.5～14 min，98%～2% C、2%～98% D；14～20 min，2% C、98% D。負(fù)離子模式，流動相為乙腈（A）和5 mmol/L甲酸銨水溶液（B），梯度洗脫程序：0～1 min，2% A、98% B；1～9 min，2%～50% A、98%～50% B；9～12 min，50%～98% A、50%～2% B；12～13.5 min，9 8% A、2% B；1 3.5～1 4 min，9 8%～2% A、2%～98% B；14～17 min，2% A、98% B。

MS條件：電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為-2.50 kV，鞘氣壓力30 arb，輔助氣壓力10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率60 000進行一級全掃描，一級離子掃描范圍m/z100～1 000，并采用高能碰撞解離進行二級裂解，碰撞電壓為30%，二級分辨率為15 000，采集信號前4的離子進行碎裂，同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

1.3.10 體內(nèi)降尿酸實驗

結(jié)合體外XOD抑制活性結(jié)果，選擇效果較好的兩種提取物進行體內(nèi)降尿酸效果評價。選用60 只雄性SPF級昆明小鼠，經(jīng)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機分為空白組（CON）、模型組（HUA）、陽性藥物組（ALP）、平臥菊三七30%醇提物組（GT）、平臥菊三七70%醇提物組（GS），共5 組，每組12 只。讓小鼠自由飲食喝水，環(huán)境溫度保持為23 ℃，分別保持12 h光明與黑暗循環(huán)。除CON組外，其余4 組在適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，于每天上午定時灌胃500 mg/kgmb次黃嘌呤和100 mg/kgmb氧嗪酸鉀進行HUA小鼠造模。造模同時給予相應(yīng)藥物進行干預(yù)，ALP組以每日3 mg/kgmb的ALP對小鼠灌胃，GT組和GS組以每日200 mg/kgmb的對應(yīng)提取物對小鼠灌胃。所有藥物均以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解。CON組給予相應(yīng)體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。實驗周期共14 d，記錄每天小鼠體質(zhì)量，于最后一天進行眼球取血，取血前禁食12 h，不禁水。在第14天灌胃1 h后取血，脫頸致死，解剖取完整腎臟、肝臟稱質(zhì)量，放置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存。

按試劑盒說明書測定血清尿酸、尿素氮、肌酐濃度，肝臟MDA含量及XOD、CAT、SOD活性（以蛋白質(zhì)量計）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)分析，使用SPSS Statistics 21中單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05時，具有統(tǒng)計學(xué)意義；采用R軟件包Ropls分別對樣本數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal components analysis，PCA）及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA），用置換檢驗方法對模型進行過擬合檢驗。根據(jù)統(tǒng)計檢驗計算P值、OPLSDA降維方法計算變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）、差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），衡量各代謝物組分含量對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，輔助標(biāo)志代謝物的篩選。從樣本一級物質(zhì)列表中尋找差異代謝物，當(dāng)P＜0.05和VIP值＞1時，認(rèn)為代謝物分子具有統(tǒng)計學(xué)意義。代謝物鑒定首先根據(jù)精確分子質(zhì)量進行確認(rèn)，后續(xù)根據(jù)MS/MS碎片模式對Human Metabolome Database（HMDB）（http://www.hmdb.ca）、massBank（http://www.massbank.jp/）、LipidMaps（http://www.lipidmaps.org）、mzCloud（https://www.mzcloud.org），以及諾米代謝自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫確認(rèn)注釋獲得代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取對平臥菊三七體外活性及總有效成分類含量的影響

不同體積分?jǐn)?shù)醇提可顯著改變提取物的XOD抑制活性、超氧陰離子自由基清除能力，總酚、總黃酮、總?cè)?、總有機酸和總糖的含量（表1）。隨著提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，GW、GT、GS提取物中總?cè)坪恳来紊?，總糖含量依次降低，而總酚、總黃酮和總有機酸則先升高后降低。其可能原因是平臥菊三七總?cè)频臉O性與70%的乙醇溶液極性更接近，根據(jù)相似相溶原理[25]，三萜類物質(zhì)在此時能相對更多地從固體載體中轉(zhuǎn)移到溶液中，而平臥菊三七總酚、總黃酮和總有機酸極性則更接近于30%的乙醇溶液極性，且高乙醇體積分?jǐn)?shù)會使平臥菊三七中的醇溶性和脂溶性雜質(zhì)競爭性溶出，導(dǎo)致提取的酚類、黃酮類和有機酸類物質(zhì)的總含量降低。多糖分子中有大量羥基，具有親水性，因而含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而降低。通過體外XOD抑制活性及超氧陰離子自由基清除實驗對不同提取物的XOD抑制能力和抗氧化能力進行表征。根據(jù)Spearman相關(guān)性分析，總酚、總黃酮和總有機酸含量與XOD抑制能力及超氧陰離子自由基清除能力呈正相關(guān)。其中總酚含量與超氧陰離子自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)性系數(shù)為0.814；總黃酮含量與XOD抑制活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)性系數(shù)為0.991；總有機酸含量與XOD抑制活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)性系數(shù)為0.709。實驗室前期結(jié)果表明平臥菊三七多糖無XOD抑制效果，GW組中多糖組分占比較高導(dǎo)致其他有效成分占比降低，可能是其XOD抑制活性低于其他兩組的原因之一。

表1 不同醇體積分?jǐn)?shù)提取對平臥菊三七XOD抑制酶活性、抗氧化能力及生物活性成分的影響Table 1 XOD inhibitory activity,antioxidant activity and bioactive constituents of G.procumbens extracted with different concentrations of ethanol

2.2 非靶向代謝組學(xué)分析

為進一步表征不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的提取物之間的差異物質(zhì)和共同物質(zhì)，采用UPLC-MS/MS方法對提取物進行非靶向代謝組學(xué)分析。平臥菊三七提取物在正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖結(jié)果見圖1。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇平臥菊三七提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of G.procumbens extracted with different concentrations of ethanol

從樣本一級物質(zhì)列表中尋找差異代謝物，以統(tǒng)計檢驗中預(yù)設(shè)的P＜0.05和VIP＞1進行篩選，平臥菊三七提取物樣品共鑒定出10 類705 種分子（圖2），其中包括有機酸94 種、脂質(zhì)類86 種、氨基酸及其衍生物74 種、酚及酚酸類73 種、糖及醇類71 種、生物堿38 種、核苷酸及其衍生物36 種、萜類30 種、黃酮及類黃酮28 種、苯丙素類18 種，及其他類157 種，其主要物質(zhì)類型見表2。

圖2 差異代謝物聚類熱圖Fig.2 Cluster heatmap of differential metabolites

表2 平臥菊三七提取物主要物質(zhì)類型及比例Table 2 Types and proportions of major substances in G.procumbens extracts

多元統(tǒng)計分析表明不同提取條件的平臥菊三七提取物成分差異性明顯，將不同組別間篩選出來的差異組分結(jié)果以火山圖的形式進行可視化，結(jié)果如圖3所示。火山圖各點代表差異組分，紅色為顯著上調(diào)組分，藍(lán)色為顯著下調(diào)組分，灰色為非顯著差異組分，點的大小代表組分的VIP值。GW vs GT一共有320 種差異組分，主要為有機酸、糖及醇類、酚及酚酸類、氨基酸及其衍生物，其中顯著上調(diào)有210 種，顯著下調(diào)有110 種。GW vs GS一共有435 種差異組分，主要為有機酸、脂質(zhì)類、酚及酚酸類、糖及醇類，其中顯著上調(diào)有334 種，顯著下調(diào)有101 種。GT vs GS一共有337 種差異組分，主要為脂質(zhì)類、酚及酚酸類、有機酸、氨基酸及其衍生物，其中顯著上調(diào)有290 種，顯著下調(diào)有47 種。

圖3 不同組別對比下差異代謝物的統(tǒng)計及火山圖Fig.3 Statistics and volcano plots of differential metabolites in GW vs GT,GW vs GS and GT vs GS

進一步通過K-Means算法聚類分析對不同極性提取溶劑條件下平臥菊三七提取物組成的動態(tài)變化進行概述。對所有705 個差異代謝物進行評估后識別出了9 種表達模式（圖4）。其中Cluster3隨提取溶劑極性降低呈上升趨勢，主要是有機酸類物質(zhì)、核苷酸及其衍生物和糖類。其中占比較高的Cluster6和Cluster8隨提取溶劑極性降低呈下降趨勢，主要是有機酸、氨基酸及其衍生物、糖及醇類和脂質(zhì)。此外，Cluster2、4和7在30%乙醇提取物中呈現(xiàn)最高含量，主要包含脂質(zhì)類、氨基酸及其衍生物、糖及醇類和酚及酚酸類。其中活性物質(zhì)包括α-亞麻酸、L-谷氨酸、棕櫚油酸、異鼠李素、反式阿魏酸、β-胡蘿卜素、煙酸、共軛亞油酸、D-氨基葡萄糖酸、柚皮素、蒲公英萜醇、芹菜素、(+)-沒食子兒茶素、綠原酸、香葉木素等物質(zhì)。顯著上調(diào)類物質(zhì)中，GW vs GT組以酚及酚酸類為主，GT vs GS組以酚及酚酸類和糖及醇類為主，顯著下調(diào)類物質(zhì)以有機酸為主，其中也有多個脂質(zhì)類和氨基酸及其衍生物發(fā)生變化。

圖4 K-Means算法聚類分析結(jié)果Fig.4 Results of K-Means algorithm clustering analysis

2.3 代謝物與體外實驗表征的相關(guān)性分析

通過Pearson相關(guān)性分析研究差異代謝物物質(zhì)含量與XOD抑制活性及抗氧化能力的相關(guān)性（圖5A）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，和超氧陰離子自由基清除能力呈顯著正相關(guān)的有39 種化合物（圖5B），其中包括蒲公英萜醇、共軛亞油酸、1,5-二咖啡?？鼘幩?、柚皮素、菠甾醇等物質(zhì)。和XOD抑制活性呈顯著正相關(guān)的差異代謝物質(zhì)有55 種（圖5C），其中包括異鼠李素、反式阿魏酸、4-羥基扁桃酸、α-亞麻酸、(+)-沒食子兒茶素、D-氨基葡萄糖酸、前酪氨酸、棕櫚油酸、穿心蓮內(nèi)酯等物質(zhì)。這些物質(zhì)的存在，很大程度上解釋了2.1節(jié)中總酚、總黃酮和總有機酸含量與XOD抑制活性及超氧陰離子自由基清除能力呈正相關(guān)的現(xiàn)象。

圖5 差異代謝物與抗氧化能力的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of differential metabolites with antioxidant properties

2.4 代謝通路富集分析

基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路對平臥菊三七差異代謝物進行通路富集分析，結(jié)果表明，代謝物被富集到252 條代謝途徑中，其中32 條代謝途徑在不同組別的代謝物組間有顯著的影響（P＜0.05），前20 種代謝途徑如代謝通路影響因子柱狀圖6A所示，縱坐標(biāo)代表代謝通路，橫坐標(biāo)代表富集到不同代謝通路中的Impact值，該值越高，代表該通路下檢測到的代謝物貢獻度越高，顏色與P值相關(guān)，越紅P值越小，越藍(lán)P值越大，P值越小，代表檢測到的差異代謝物對該通路影響越顯著。

圖6 代謝通路分析Fig.6 Metabolic pathway analysis

GW vs GT vs GS的KEGG富集分析結(jié)果以網(wǎng)絡(luò)圖展示（圖6B），可以更直觀看到代謝物在代謝通路的富集情況。圖中藍(lán)色點表示通路，其他點表示代謝物。通路點的大小表示與之相連的代謝物數(shù)目，數(shù)目越多，點越大。從圖中可以看出，植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、苯丙素類化合物的生物合成、酪氨酸代謝、植物激素的生物合成等代謝通路具有極顯著作用，可能是確定平臥菊三七不同提取物之間活性差異的關(guān)鍵。不同組別兩兩比較的網(wǎng)絡(luò)圖（圖6C～E）各有差異，圖中與代謝途徑相連的差異表達代謝物在關(guān)鍵途徑中可能起著至關(guān)重要的作用。

2.5 降尿酸效果評價

由于水提物XOD抑制活性較低，故選擇30%醇提物和70%醇提物，以次黃嘌呤和氧嗪酸鉀造模的HUA小鼠模型為基礎(chǔ)進行體內(nèi)降尿酸效果評價，結(jié)果如圖7所示。5 組小鼠均能正?；顒?，但給予實驗劑量的ALP可能具有較嚴(yán)重的機體副作用，ALP組小鼠體質(zhì)量相對其他小鼠明顯較輕（圖7A），且腎臟系數(shù)顯著高于HUA組（P＜0.01），肝臟系數(shù)也比其他組高（圖7B），可能與其肝臟抗氧化狀態(tài)相關(guān)。由圖7C、D可知，ALP組小鼠血清肌酐和尿素氮水平顯著高于HUA組（P＜0.01），體現(xiàn)出ALP對腎臟產(chǎn)生傷害。GT、GS組小鼠體質(zhì)量趨勢正常，腎臟系數(shù)及血清肌酐和尿素氮水平的影響與CON組不存在統(tǒng)計學(xué)差異，說明平臥菊三七提取物并未引起小鼠臟器質(zhì)量明顯變化，安全可靠。

圖7 平臥菊三七提取物對HUA小鼠生理生化指標(biāo)的影響Fig.7 Effect of G.procumbens extracts on physiological and biochemical indexes in hyperuricemic mice

血清尿酸的濃度變化如圖7E所示。與CON組相比，HUA組小鼠血清尿酸顯著升高（P＜0.01），表明HUA造模成功，給予30%和70%醇提物后，能不同程度控制HUA小鼠血清尿酸水平的升高，GT組和GS組均顯著降低（P＜0.01）。XOD作為尿酸生成過程中的關(guān)鍵酶，本研究也測定了小鼠肝臟中XOD活力（圖7F），其中HUA組XOD活性較CON組顯著升高（P＜0.01），醇提物組較HUA組均顯著降低（P＜0.01），這與血清尿酸結(jié)果趨勢一致。此外，還測定了小鼠肝臟的CAT、SOD活性以及MDA含量以表征小鼠肝臟的抗氧化狀態(tài)（圖7G～I），結(jié)果顯示，和CON組相比較，HUA小鼠的肝臟CAT活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01），表明HUA小鼠的肝臟受到了氧化損傷。而提取物的使用可以一定程度減緩肝臟中CAT和SOD活性下降，減少MDA的生成，這可能與提取物的抗氧化作用有關(guān)。

3 討論

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取對平臥菊三七提取物中總酚、總黃酮、總?cè)?、總有機酸及總糖含量有影響，其中總酚含量與超氧陰離子自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），總黃酮含量與XOD抑制活性能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），總有機酸含量與XOD抑制活性能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)檢測出705 種差異代謝物，涉及252 條代謝途徑。在動物實驗中，30%醇提物和70%醇提物均可通過降低血清尿酸和抑制肝臟XOD緩解造模小鼠的HUA（P＜0.01），同時一定程度上緩解HUA帶來的肝臟氧化損傷。

尿酸生成過多是HUA發(fā)生的一大重要原因，XOD是尿酸生成過程的關(guān)鍵酶。在黃嘌呤氧化次黃嘌呤和黃嘌呤從而生成尿酸的過程中，會產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基，對機體造成氧化損傷[26]。因此，XOD抑制活性和超氧陰離子自由基清除能力常常作為評價體外降尿酸活性的考察指標(biāo)。通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)本研究中與超氧陰離子自由基清除能力和XOD抑制活性呈正相關(guān)的物質(zhì)具有諸多生理功能。蒲公英萜醇能顯著抑制活性氧產(chǎn)生和MDA生成，具有抗氧化、抗關(guān)節(jié)炎的功效[27]。1,5-二咖啡酰奎寧酸具有抗氧化活性，在氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中通過刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞中的核因子E2相關(guān)因子2途徑上調(diào)谷胱甘肽合成抑制細(xì)胞死亡[28]。柚皮素具有顯著的XOD和α-葡萄糖苷酶的抑制活性[29]。菠甾醇通過抑制環(huán)氧合酶、拮抗辣椒素受體和減弱促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)等抗炎機制發(fā)揮抗炎作用[30]。異鼠李素具有抗氧化、抗炎及腎臟保護作用[31]，α-亞麻酸不僅為生長、細(xì)胞代謝及肌肉運動供能，還通過競爭抑制作用抑制ω-6系不飽和脂肪酸的代謝，增加對應(yīng)的ω-3系不飽和脂肪酸的代謝產(chǎn)物，從而發(fā)揮抗炎等生物調(diào)控作用[32]。阿魏酸通過調(diào)節(jié)尿酸合成、糖脂代謝和肝損傷改善大鼠代謝綜合征相關(guān)的HUA[33]。(+)-沒食子兒茶素在抗氧化活性測試中被證明具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、羥自由基和過氧亞硝酸根等自由基清除能力[34]。棕櫚油酸被證明在人內(nèi)皮細(xì)胞下調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白-1、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和環(huán)氧合酶2基因表達，降低核因子κB的表達，并上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體-α基因表達從而發(fā)揮抗炎作用[35]。這些物質(zhì)具有豐富生理活性，且在本研究中證實與XOD抑制活性及抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系，由此推測這些物質(zhì)可能是平臥菊三七提取物所具備降尿酸活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

K-Means結(jié)果分析顯示相較其他提取物，在GT中呈現(xiàn)最高含量的活性物質(zhì)包括α-亞麻酸、L-谷氨酸、棕櫚油酸、異鼠李素、反式阿魏酸、β-胡蘿卜素、D-氨基葡萄糖酸、柚皮素、蒲公英萜醇、芹菜素、(+)-沒食子兒茶素、綠原酸、香葉木素等。香葉木素具有超氧陰離子自由基清除能力且呈量效關(guān)系，在抗氧化細(xì)胞模型中可顯著恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT等抗氧化酶的活性至正常水平，同時抑制MDA的生成[36]。β-胡蘿卜素是常見類胡蘿卜素，具有抗氧化功效。α-亞麻酸、棕櫚油酸、柚皮素、蒲公英萜醇等物質(zhì)活性前文均有提及，結(jié)合動物實驗結(jié)果可以看出，GT相較于GS具有更好的肝臟和腎臟保護效果，這一現(xiàn)象可能與前述活性物質(zhì)的存在相關(guān)。

GT vs GS的KEGG富集分析結(jié)果中，植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、苯丙素類化合物的生物合成、組氨酸和嘌呤衍生的生物堿的生物合成、咖啡因代謝、cAMP信號通路、苯丙氨酸代謝、氨基酸的生物合成、亞油酸代謝、莽草酸途徑來源的生物堿的生物合成、酪氨酸代謝呈現(xiàn)顯著影響。在代謝途徑中，植物次生代謝物包括多酚、黃酮、生物堿、有機酸等活性物質(zhì)，物質(zhì)組成與含量不同對提取物生理活性均有影響。苯丙素類化合物的合成途徑中，包括原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、柚皮素、芹菜素、東莨菪內(nèi)酯等物質(zhì)的合成，文獻表明這些物質(zhì)具有良好的抑制XOD活性和抗氧化活性[29,33,37-39]。組氨酸和嘌呤衍生的生物堿的生物合成和咖啡因代謝途徑涉及多種嘌呤的代謝，同時ABC轉(zhuǎn)運途徑與尿酸在體內(nèi)的代謝息息相關(guān)。cAMP信號在線粒體呼吸鏈的復(fù)合體I活性的調(diào)節(jié)和活性氧產(chǎn)生的減少中起作用，從而影響細(xì)胞氧化應(yīng)激[40]。蛋白質(zhì)消化吸收途徑涉及賴氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸等物質(zhì)，其中谷氨酰胺和纈氨酸與抗氧化劑谷胱甘肽的合成相關(guān)，賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等及其代謝物常在尿液代謝組學(xué)中被認(rèn)為是HUA和腎臟損傷的潛在生物標(biāo)記物[41]。在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型中，尿酸鈉能激活酪氨酸磷酸化，從而激活中性粒細(xì)胞和酪氨酸激酶，導(dǎo)致IL-1β、IL-8和IL-1加速釋放，引發(fā)機體炎癥和損傷[41]，因而調(diào)控酪氨酸代謝途徑可緩解高尿酸所致炎癥。本研究平臥菊三七提取物涉及KEGG代謝途徑中，對上述代謝途徑的影響呈極顯著，可推測平臥菊三七通過調(diào)控上述途徑對HUA小鼠的癥狀緩解發(fā)揮積極作用，而GT與GS的活性差異也與上述途徑的調(diào)控相關(guān)。

本研究對平臥菊三七提取物物質(zhì)組成進行鑒定，通過相關(guān)性分析結(jié)合降尿酸效果，對平臥菊三七降尿酸活性的物質(zhì)基礎(chǔ)進行探究，為平臥菊三七降尿酸活性物質(zhì)制備提供參考，后續(xù)可以針對性地進行經(jīng)體內(nèi)代謝后的代謝物分析等進一步研究，從而對其降尿酸活性物質(zhì)基礎(chǔ)進行驗證。