山茶油干預(yù)的阿爾茨海默病小鼠尿液代謝組學(xué)分析

王瑞鋒，周 寧，陳 龍，劉 通，郭彭莉，張冰賢，張振凱，曾夢楠，熊維政，鄭曉珂,3，馮衛(wèi)生,3,*

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南綠達(dá)山茶油股份有限公司，河南 信陽 465550；3.河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，起病隱匿，多發(fā)于老年前期和老年中期，臨床上主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、行為改變和心理癥狀[1]。到2050年，預(yù)計(jì)將會(huì)有1.52億 人受到癡呆癥的影響，嚴(yán)重干擾了人們的日常生活，帶來了巨大的公共健康隱患[2]。AD的病理學(xué)特征主要為β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）細(xì)胞外沉積形成淀粉樣斑塊以及淀粉樣斑塊誘導(dǎo)的下游Tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)[3]。此外，Aβ沉積還會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活引起促炎癥細(xì)胞因子分泌，趨化因子、活性氧、興奮性氨基酸等神經(jīng)毒素增多，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和神經(jīng)退行性病變。AD的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前被批準(zhǔn)用于治療AD的藥物僅能控制癥狀，而不能改變疾病進(jìn)程，且具有頭暈、頭痛、便秘、高血壓等副作用[4]。研究表明，與癡呆相關(guān)的病理變化在臨床癥狀出現(xiàn)之前很長一段時(shí)間就已經(jīng)開始發(fā)生，因此尋找新的藥物，在神經(jīng)退行性過程發(fā)生之前進(jìn)行預(yù)防和干預(yù)，將成為未來研究的重點(diǎn)[5]。

山茶油是從山茶科（Theaceae）油茶（Camellia oleiferaAbel.）樹種子壓榨獲得，是藥用價(jià)值較高的食品保健油，在中國有很長的生產(chǎn)和發(fā)展歷史。先秦古書《山海經(jīng)》中記載“員木，南方油食也”；《本草綱目拾遺》中記載“茶油可潤腸、清胃、解毒、殺菌”；研究表明，山茶油含有豐富的不飽和脂肪酸、酚類、黃酮類、兒茶素、角鯊烯等活性成分，有“東方橄欖油”和“長壽油”之稱[6]。山茶油中所含的油酸等不飽和脂肪酸可以減少AD小鼠腦組織中Aβ產(chǎn)生，抑制Aβ異常積累引起的淀粉樣斑塊沉積[7]；多酚和黃酮類化合物可以增強(qiáng)學(xué)習(xí)、記憶和神經(jīng)認(rèn)知功能，起到改善AD癥狀的作用[8]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)[9]，山茶油可作為營養(yǎng)食品調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，影響微生物-腸道-大腦軸，促進(jìn)腸道菌群相互作用，調(diào)節(jié)Aβ25-35小鼠腸道菌群失衡，減輕小鼠大腦中的神經(jīng)元損傷，減少淀粉樣蛋白和Tau蛋白的數(shù)量，增強(qiáng)小鼠記憶和認(rèn)知能力。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，可通過研究生物體在受到外界干預(yù)后，細(xì)胞、組織、器官中低分子質(zhì)量內(nèi)源性代謝物的差異變化，富集和構(gòu)建代謝通路，從而探討外界干預(yù)與內(nèi)在代謝物變化的聯(lián)系[10]。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，系統(tǒng)性的分析方法更適合于全面整體地評(píng)價(jià)山茶油對(duì)AD患者的干預(yù)作用。已有研究表明，在AD患者尿液中檢測出一些生物標(biāo)志物如氧化損傷相關(guān)代謝物、單胺類代謝物等可能與AD早期病理變化相關(guān)。且尿液代謝物檢測作為一種簡單、無創(chuàng)的研究手段，方便被用于AD早期疾病診斷[11-12]。因此，本研究基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS）技術(shù)，對(duì)山茶油干預(yù)后的AD小鼠進(jìn)行尿液代謝組學(xué)分析，鑒定山茶油治療后小鼠體內(nèi)代謝物變化情況，并基于差異標(biāo)志物構(gòu)建相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)而探討山茶油對(duì)AD的營養(yǎng)保健作用和治療潛力，以期為日常食用山茶油干預(yù)AD發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性昆明小鼠（KM；49 d）購自北京維塔星生物科技有限公司，共50 只。實(shí)驗(yàn)環(huán)境保證恒溫（（25±2）℃）、相對(duì)濕度（60±10）%，光照、黑暗循環(huán)12 h，實(shí)驗(yàn)期間小鼠可自由獲得食物和水。所有程序均按照《河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)代碼為DWLL2018080003，于2018年8月15日授予，有效期5 a。

山茶油購自河南綠達(dá)山茶油股份有限公司。

鹽酸多奈哌齊片 中國重慶植恩藥業(yè)有限公司；Aβ25-35肽 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為LC/MS級(jí)）美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

maXis HD Q/TOF四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國Dionex公司；Advantage A10超純水儀 德國Sartorius公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；SK-1快速混勻器 常州國宇儀器制造有限公司；BCD 206TAS低溫冰箱 青島海爾公司；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模與給藥

將50 只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽性藥組（10 mg/（kgmb·d））、山茶油組（0.5 mL/（kgmb·d））。Aβ25-35肽在37 ℃蒸餾水（1 mg/mL）中孵育7 d，在實(shí)驗(yàn)前立即用無菌生理鹽水稀釋至最終質(zhì)量濃度。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠海馬內(nèi)注射Aβ25-35，對(duì)照組小鼠海馬內(nèi)注射等量生理鹽水。陽性藥組和山茶油組的小鼠注射干預(yù)后第15天，分別開始給予鹽酸多奈哌齊片和山茶油灌胃，連續(xù)給藥28 d，正常對(duì)照組和模型組均給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.2 尿液樣本的采集與處理

最后一次給藥后，將小鼠置于代謝籠中，收集各組小鼠12 h尿液，置于-80 ℃保存。待UPLC-Q/TOFMS分析，將尿樣在室溫下解凍，3 800 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液300 μL與3 倍體積乙腈混合加入離心管中，沉淀蛋白質(zhì)。渦旋1 min后，在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL置于進(jìn)樣小瓶中，放于4 ℃冰箱中備用。質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本為分別從各樣本中吸取30 μL混合而成[13]。實(shí)驗(yàn)序列中每間隔10 個(gè)樣本運(yùn)行一次QC樣本，用于評(píng)估UPLC-MS系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.3.3 UPLC-Q/TOF-MS檢測條件

采用AcclaimTMRSLC 120 C18色譜柱（2.2 μm，2.1 mm×100 mm）進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相為溶劑A（甲酸水溶液，0.1%）和溶劑C（乙腈），梯度洗脫（0～5 min，95%～85% A，5%～15% C；5～8 min，85%～60% A，15%～40% C；8～18 min，60%～30% A，40%～70% C；18～20 min，30%～10% A，70%～90% C；2 0～2 5 min，10%～9 5% A，90%～5% C）。柱溫箱設(shè)置為40 ℃，流速為0.3 mL/min。質(zhì)譜分析采用四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜，在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描。掃描范圍：m/z50～1 500，掃描速率：1.0 Hz，霧化器氣體壓力：2.0 bar，干燥氣（N2）流量：8 L/min，去溶劑化溫度：230 ℃，毛細(xì)管電壓：3 500 V和3 200 V（正、負(fù)離子模式）。實(shí)時(shí)校正液（甲酸鈉）流速：52 μL/h。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

將UPLC-Q/TOF-MS 采集到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Profile Analysis軟件中進(jìn)行峰匹配、降噪、歸一化、修正缺失數(shù)據(jù)等預(yù)處理后，得到Bucket表格。將表格數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件中進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA），得出相應(yīng)的得分圖。通過得分圖比較模型組和給藥組之間的差異，篩選差異代謝物（變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）＞3、P＜0.05）。利用HMDB（https://hmdb.ca）、MassBank（https://massbank.eu）、MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca）在線數(shù)據(jù)庫鑒定、篩選潛在生物標(biāo)志物。通過Compass Quant Analysis軟件（4.8.0版本）對(duì)潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行半定量分析，Mev軟件（4.9.0版本）進(jìn)行熱圖聚類分析。最后，使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/）對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路富集并構(gòu)建代謝通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AD小鼠尿液代謝物譜圖分析

將小鼠尿液樣本進(jìn)行UPLC-Q/TOF-MS分析后，得到在樣品正、負(fù)離子模式下的基峰離子流色譜圖，如圖1所示，分離度良好。其中，正離子模式下檢測到199 個(gè)化合物，負(fù)離子模式下檢測到181 個(gè)化合物（正離子模式下33 個(gè)獲得命名，負(fù)離子模式下15 個(gè)獲得命名）。

圖1 小鼠尿液樣品正（A）、負(fù)（B）離子模式下的基峰強(qiáng)度色譜圖Fig.1 Base peak intensity chromatograms of mouse urine samples in the positive (A) and negative (B) modes

2.2 AD小鼠尿液樣本PCA

將UPLC-Q/TOF-MS獲得的小鼠各組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和PCA，得到PCA得分圖。如圖2A、B所示，正常對(duì)照組、模型組小鼠尿液樣本點(diǎn)各自聚為一類，彼此顯著分離，說明小鼠在注射Aβ25-35肽后體內(nèi)代謝輪廓顯著變化；如圖2C、D所示，與模型組相比，陽性藥組樣本點(diǎn)明顯接近正常對(duì)照組樣本點(diǎn)，說明AD模型建立成功。如圖2E、F所示，在給予山茶油后，小鼠尿液樣本點(diǎn)更接近正常對(duì)照組樣本點(diǎn)區(qū)域，說明山茶油對(duì)AD小鼠體內(nèi)代謝紊亂有明顯的回調(diào)作用。

圖2 小鼠尿液樣本PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of mouse urine samples

2.3 AD小鼠尿樣本潛在生物標(biāo)志物鑒定

對(duì)模型組和給藥組進(jìn)行OPLS-DA，結(jié)果顯示模型組和山茶油組樣本點(diǎn)顯著分離。得到相應(yīng)的OPLS-DA得分圖、置換檢驗(yàn)結(jié)果圖以及S-plot載荷圖（圖3），置換檢驗(yàn)結(jié)果中橫坐標(biāo)表示與模型的相似度，縱坐標(biāo)表示和越接近于1，表明模型擬合程度越高，區(qū)分能力越好。該模型，說明模型區(qū)分能力較好，模型組和山茶油組之間的組間差異信息較多。較接近于1，表明模型具有良好的預(yù)測能力。小于0，說明模型沒有出現(xiàn)過擬合。在S-plot載荷圖中標(biāo)記為紅色且明顯遠(yuǎn)離原點(diǎn)的點(diǎn)，代表潛在代謝物，基于設(shè)定的參數(shù)VIP＞3、P＜0.05，使用HMBD、MassBank和KEGG數(shù)據(jù)庫，結(jié)合標(biāo)志物的保留時(shí)間、質(zhì)荷比、二級(jí)碎片等鑒定得到內(nèi)源性生物標(biāo)志物，模型組與給藥組得到48 個(gè)生物標(biāo)志物（正離子模式下33 個(gè)，負(fù)離子模式下15 個(gè)），如表1所示。

表1 模型組和山茶油組潛在生物標(biāo)志物及其相關(guān)信息Table 1 Information of potential biomarkers from the model and camellia oil groups

圖3 模型組和山茶油給藥組樣本的OPLS-DA得分圖、置換檢驗(yàn)圖和S-plot載荷圖Fig.3 OPLS-DA score plots,permutation test plots and S-plot loading plots for the model and camellia oil groups

2.4 AD小鼠尿液樣本潛在生物標(biāo)志物聚類分析

對(duì)篩選得出的生物標(biāo)志物進(jìn)行相對(duì)定量和熱圖聚類分析，如圖4所示，與模型組相比，山茶油組中多數(shù)標(biāo)志物表現(xiàn)出一定程度上的回調(diào)，說明山茶油對(duì)AD小鼠體內(nèi)代謝紊亂有一定的回調(diào)作用。聚類結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和給藥組聚為一類，再次驗(yàn)證PCA的結(jié)果，即山茶油對(duì)AD大鼠體內(nèi)代謝的紊亂具有改善作用。

圖4 潛在生物標(biāo)志物在模型組和山茶油組樣本中的熱圖Fig.4 Heatmap of potential biomarkers in the model and camellia oil groups

2.5 AD小鼠尿液樣本代謝通路富集分析與代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

對(duì)表1中的所有生物標(biāo)志物進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，得到了5 條顯著受干擾的代謝途徑：?；撬岷痛闻；撬岽x，三羧酸循環(huán)，精氨酸和脯氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。構(gòu)建了與山茶油干預(yù)作用相關(guān)的代謝通路網(wǎng)絡(luò)圖，如圖5所示。

圖5 AD小鼠體內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Metabolic network in AD mice

3 討論

山茶油是一種通過壓榨提取的中國傳統(tǒng)食用油，含有豐富的不飽和脂肪酸，已被證實(shí)對(duì)AD患者神經(jīng)系統(tǒng)有良好的保護(hù)作用[14]。本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)山茶油干預(yù)后的AD小鼠尿液樣本進(jìn)行分析，綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn)山茶油主要是通過干預(yù)牛磺酸和次?；撬岽x，三羧酸循環(huán)，精氨酸和脯氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等代謝通路，改善AD小鼠體內(nèi)代謝的紊亂狀態(tài)。谷氨酸是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，AD患者皮層神經(jīng)元外存在過量的谷氨酸會(huì)引起興奮毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[15]。?；撬崾侵袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的內(nèi)源性氨基酸，被認(rèn)為是大腦發(fā)育的重要營養(yǎng)因子[16]。牛磺酸可通過激活γ-氨基丁酸和甘氨酸受體，抑制Aβ誘導(dǎo)的谷氨酸水平升高所引起的興奮性毒性[17]。在本研究中，與正常對(duì)照組相比，?；撬嵩谀Ｐ徒M下調(diào)，給予山茶油干預(yù)后，小鼠尿液中牛磺酸及其代謝物含量顯著升高，說明山茶油可通過調(diào)節(jié)?；撬岷痛闻；撬岽x，降低興奮性毒性，從而緩解Aβ引起的神經(jīng)損傷，改善AD癥狀。

檸檬酸是線粒體三羧酸循環(huán)中的重要中間產(chǎn)物。線粒體功能障礙和腦葡萄糖代謝減退被認(rèn)為是引發(fā)AD的重要影響因素之一，淀粉樣前體蛋白及其裂解產(chǎn)物的異常積累會(huì)抑制各種線粒體酶活性，破壞線粒體電子傳遞鏈功能，影響能量供應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)異常[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，AD小鼠體內(nèi)檸檬酸含量減少，提示AD小鼠體內(nèi)三羧酸循環(huán)過程紊亂，體內(nèi)能量代謝受到抑制。本實(shí)驗(yàn)中，給予山茶油后，檸檬酸含量明顯增加，說明山茶油可通過調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝，減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷。

肌酸和肌酸酐是精氨酸和脯氨酸代謝通路中的重要化合物。肌酸是肌酸酐的唯一前體，肌酸轉(zhuǎn)化為肌酸酐是一個(gè)不可逆的過程，在人體內(nèi)，肌酸酐一般不被代謝而直接由尿液排出體外[20]。肌酸與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能量供應(yīng)有關(guān)，二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）通過接受磷酸肌酸的磷酸基團(tuán)合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），維持大腦在快速周轉(zhuǎn)時(shí)ATP的穩(wěn)態(tài)以及較低的ADP濃度，進(jìn)而提高認(rèn)知功能[21]。肌酸還具有抗氧化作用，線粒體是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷的主要部位，Aβ的低聚物通過激活NADPH氧化酶誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)損傷[22]。肌酸在進(jìn)入線粒體與ATP結(jié)合提供能量過程中可以清除線粒體中的自由基，減少活性氧產(chǎn)生，產(chǎn)生抗氧化作用，減輕神經(jīng)損傷。本研究中，與正常對(duì)照組相比，AD小鼠尿液中肌酸含量下調(diào)，給予山茶油后，小鼠尿液中肌酸水平顯著升高，說明山茶油可以通過干預(yù)精氨酸和脯氨酸代謝，影響大腦能量供應(yīng)，減少線粒體中活性氧產(chǎn)生，減輕AD損傷。

S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）是半胱氨酸和蛋氨酸代謝中的重要代謝物。SAH在SAH水解酶的催化下分解為同型半胱氨酸和腺苷。研究表明，同型半胱氨酸含量升高抑制SAH水解酶活性，導(dǎo)致早期AD患者血漿和腦脊液中SAH含量顯著升高。SAH是大多數(shù)甲基轉(zhuǎn)移酶的有效抑制劑，可以通過抑制兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶和苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性影響認(rèn)知功能[23]。另有研究表明，二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）可以預(yù)防淀粉樣蛋白積累引起的氧化應(yīng)激和學(xué)習(xí)能力喪失，但DHA在腦組織中不能合成，需要通過血腦屏障從血液和外周組織向腦組織轉(zhuǎn)運(yùn)；SAH可以通過抑制肝臟中磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，減少紅細(xì)胞DHA從肝臟向外周組織和血漿轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低腦內(nèi)DHA濃度，造成認(rèn)知能力損傷[24-26]。本研究中，與正常對(duì)照組相比，AD小鼠尿液中SAH含量上調(diào)，在給予山茶油之后，小鼠尿液中SAH含量顯著降低，推測山茶油可以通過干預(yù)半胱氨酸和蛋氨酸代謝，改善AD引起的記憶認(rèn)知功能損傷。

N-乙酰基-L-天冬氨酸（N-acetyl-L-aspartic acid，NAA）在人體內(nèi)主要集中在神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，是人腦中含量第二豐富的氨基酸[27]。NAA被認(rèn)為是AD早期的潛在生物標(biāo)志物，NAA含量與神經(jīng)元密度以及完整性密切相關(guān)[28]。此外，腦內(nèi)NAA被天冬氨酸酯酶水解產(chǎn)生足夠高濃度的天冬氨酸和乙酸，乙酸進(jìn)一步合成乙酰輔酶A，產(chǎn)生的乙酰輔酶A可參與腦細(xì)胞線粒體中的能量供應(yīng)，滿足神經(jīng)元之間信息傳遞的需要[29-30]。本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，AD小鼠尿液中NAA含量下調(diào)，山茶油干預(yù)后的小鼠尿液NAA水平顯著提高，提示山茶油可以調(diào)節(jié)天冬氨酸代謝，增加小鼠體內(nèi)NAA含量，增強(qiáng)大腦中能量供應(yīng)，改善AD癥狀。

4 結(jié)論

本研究以尿液代謝組學(xué)為研究手段，探討了山茶油對(duì)AD的干預(yù)作用?；诓町惔x物的篩選及相關(guān)代謝通路的富集，發(fā)現(xiàn)山茶油可通過調(diào)節(jié)?；撬岷痛闻；撬岽x，三羧酸循環(huán)，精氨酸和脯氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等代謝通路，促進(jìn)能量代謝、減輕氧化損傷。本研究為日常食用山茶油防治AD提供了數(shù)據(jù)支撐。