金針菇多糖通過(guò)調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞生成緩解苯并[a]芘染毒小鼠血管炎癥

牛澤淼，李 鑫，陳 寧，梁振華，趙 娟，呂 品，張 巖，付程浩,*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050017；4.河北省食品檢驗(yàn)研究院 河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050227）

食用菌多糖是大型可食用真菌的主要活性物質(zhì)之一，有明確報(bào)道的食用菌多糖種類已超過(guò)百種，例如香菇多糖、靈芝多糖、秀珍菇多糖、金針菇多糖等[1-2]。研究表明，金針菇多糖（Flammulina velutipespolysaccharide，F(xiàn)VP）具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗衰老和改善腸道菌群等多種潛在的生物活性功能[1,3-4]。Ma Sheng等[5]的研究顯示，F(xiàn)VP可以增強(qiáng)小鼠抗氧化能力，減少血清中炎癥因子白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，緩解腸炎表型，并指出這一過(guò)程可能是通過(guò)抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3-與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白-Caspase-1軸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VP可以通過(guò)調(diào)節(jié)特定的腸道微生物來(lái)改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀，還可調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的組成增強(qiáng)免疫反應(yīng)[6-8]。此外，F(xiàn)VP可調(diào)節(jié)Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4-核因子（nuclear factor，NF）-κB信號(hào)通路改善炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，減輕葡聚糖硫酸鈉鹽引起的炎癥性腸病和肝損傷[9-10]。

食品在熏制、烘烤和煎炸過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的多環(huán)芳烴類致癌物，苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）是多環(huán)芳烴的典型代表，分子式為C20H12[11]。此外，BaP還存在于汽車尾氣、香煙煙霧、煤焦油中，主要經(jīng)由食物攝入、呼吸、皮膚暴露進(jìn)入人體[12]。早在1930年，BaP就因其致癌活性而廣為人知[13]。近年來(lái)，BaP引發(fā)的心血管損傷引起了人們的關(guān)注。研究表明，血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是BaP的重要靶細(xì)胞[14]，BaP進(jìn)入細(xì)胞后，能夠與芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）結(jié)合，在AhR核轉(zhuǎn)位器的協(xié)助下一起控制異物代謝酶的表達(dá)，如細(xì)胞色素（cytochrome，CYP）家族基因CYP1A1和CYP1B1[15]。同時(shí)，胞內(nèi)的BaP在CYP1A1介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中生成二羥環(huán)氧苯并芘（benzo[a]pyrene dihydrodiol epoxide，BPDE）進(jìn)而形成BPDE-DNA加合物，誘導(dǎo)細(xì)胞基因突變[16]。此外，BaP還可以通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、有絲分裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路、氨基末端激酶信號(hào)通路上調(diào)血管細(xì)胞黏附分子-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等炎癥因子的表達(dá)，引發(fā)血管炎癥損傷[12,17-18]。

炎癥因子對(duì)促炎細(xì)胞的調(diào)控和募集是血管炎癥損傷的核心事件，其中造血祖細(xì)胞的增殖和分化直接影響著炎癥細(xì)胞生成[19-21]。研究顯示，TNF-α和巨噬細(xì)胞集落刺激因子共同調(diào)控造血c-Kit+Sca-1+祖細(xì)胞的分化和粒細(xì)胞的生成，增加外周循環(huán)中性粒細(xì)胞的水平，加重心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[21]。最近有證據(jù)顯示，橙皮素能夠下調(diào)BaP引發(fā)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（EAhy 926）中AhR活化，減少IL-1β和TNF-α分子產(chǎn)生，延緩低密度脂蛋白積累，從而緩解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[22]。Gdula-Argasińska等[23]指出消退素D1處理會(huì)下調(diào)CYP1A1基因表達(dá)和蛋白活性，抑制環(huán)氧合酶2和前列腺素E合成酶蛋白生成，具有修復(fù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的潛力。

目前，尚不清楚FVP是否具有調(diào)節(jié)BaP引發(fā)的血管炎癥損傷的潛能。因此，本研究在動(dòng)物水平檢測(cè)了FVP灌胃前后BaP處理組小鼠血管炎癥分子的表達(dá)水平，以及體內(nèi)造血祖細(xì)胞和循環(huán)促炎細(xì)胞的水平，并在細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 周齡SPF級(jí)雄性C57/BL6小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK（遼）2018-0003；Raw264.7細(xì)胞 中國(guó)武漢普諾賽生命科技有限公司。

BaP（純度＞96%）美國(guó)Sigma公司；2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）探針 美國(guó)Cayman Chemical公司；IL-6、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、MCP-1單克隆抗體 沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；c-Kit、Sca-1、Ly6G、Ly6C、CD11b、CD45、F4/80、CD16/32單克隆抗體 美國(guó)Biolegend公司；微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒 南京建成公司；胎牛血清 德國(guó)Biotech公司；胰酶、DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；Cell Counting Kit-8試劑盒 上海圣爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-50B低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Avanti J-30I高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；Guava easyCyte系列微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀、Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；DEL-100酶聯(lián)免疫分析儀杭州米歐儀器有限公司；BD FACSVerse流式細(xì)胞儀美國(guó)BD公司；DM2000 LED微細(xì)胞顯微鏡 德國(guó)Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 FVP提取

參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[4,24]從金針菇子實(shí)體中提取FVP。取干燥的金針菇粉，經(jīng)石油醚常溫浸提3 次，陰干溶劑；加入2 倍體積70%乙醇溶液常溫浸提24 h，重復(fù)3 次，陰干溶劑；金針菇粉按照料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，90 ℃提取3 h，重復(fù)提取3 次，合并濾液后進(jìn)行減壓濃縮，加入95%乙醇溶液調(diào)整終體積分?jǐn)?shù)為75%，靜置醇沉24 h后過(guò)濾收集多糖沉淀。沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚淋洗2 次，陰干溶劑后復(fù)溶于蒸餾水，得粗多糖溶液。使用Sevag試劑法（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V/V）除蛋白，重復(fù)除蛋白10 次[4,24]。溶液旋蒸除去氯仿，進(jìn)行二次醇沉，加入95%乙醇至終體積分?jǐn)?shù)75%，靜置24 h，收集沉淀溶于蒸餾水后使用透析袋（8 000～14 000 Da）于4 ℃透析4 d，每隔5 h換一次蒸餾水，冷凍干燥后得FVP。

1.3.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與處理

40 只體質(zhì)量為18～20 g的雄性C57/BL6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為5 組，每組8 只。分別為對(duì)照組，BaP（200 mg/（kgmb·d））處理組，F(xiàn)VP灌胃低劑量組（50 mg/（kgmb·d））、中劑量組（100 mg/（kgmb·d））及高劑量組（200 mg/（kgmb·d））（分別記為FVP 50+BaP組、FVP 100+BaP組、FVP 200+BaP組，F(xiàn)VP后面的數(shù)據(jù)表示FVP灌胃的劑量，下同）。FVP劑量按小鼠體質(zhì)量計(jì)算，溶于120 μL三蒸水后灌胃FVP組小鼠，同時(shí)對(duì)照組和BaP組給予同等體積的三蒸水，連續(xù)飼養(yǎng)12 d；第12天，F(xiàn)VP組預(yù)先BaP灌胃12 h后再進(jìn)行FVP灌胃，BaP組灌胃200 mg/kg的BaP，對(duì)照組灌胃等體積三蒸水，持續(xù)3 d。

1.3.3 病理切片、染色及炎癥因子表達(dá)水平的測(cè)定

使用4%多聚甲醛固定小鼠胸腹主動(dòng)脈30 min，隨后使用OTC包埋劑包埋動(dòng)脈組織，-80 ℃冷凍2 h后通過(guò)冰凍切片機(jī)制成5 μm的切片；預(yù)冷丙酮固定切片，使用蘇木精染色，鹽酸乙醇分化液分化，促藍(lán)液反藍(lán)，伊紅染色，每染色一次使用流水清洗一次，通過(guò)分級(jí)乙醇脫水，并在二甲苯中清洗，最后樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察。使用切片進(jìn)行免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色前置于室溫1 h修復(fù)抗原，預(yù)冷丙酮固定30 min，使用內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，山羊血清封閉，一抗（IL-6、MCP-1和ICAM-1）4 ℃孵育過(guò)夜，生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體，辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素，DAB顯色液顯色，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化液分化，通過(guò)分級(jí)乙醇脫水，并在二甲苯中清洗，最后樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察。使用Image Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)抗體染色區(qū)并計(jì)算平均光密度值（mean fluorescence intensity，MFI），并計(jì)算各組抗體的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)促炎細(xì)胞及骨髓造血細(xì)胞亞群比例變化

按文獻(xiàn)[25-26]方法收集脾臟、骨髓和血液中的免疫細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106cell/100 μL。孵育抗體，使用BD FACSVerse流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，數(shù)據(jù)通過(guò)FlowJo V10軟件進(jìn)行分析。通過(guò)CD11b+Ly6ChighLy6G-識(shí)別單核細(xì)胞，C D 11 b+F 4/8 0+識(shí)別巨噬細(xì)胞，CD11b+Ly6ClowLy6G+識(shí)別中性粒細(xì)胞，c-Kit+Sca-1+識(shí)別造血祖細(xì)胞，c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32high識(shí)別粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞（granulocyte macrophage progenitor，GMP），c-Kit+Sca-1-識(shí)別造血干細(xì)胞，c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32mid識(shí)別普通髓系祖細(xì)胞（common myeloid progenitor，CMP）。

1.3.5 細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平測(cè)定

將Raw264.7細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個(gè)/mL，在6 孔板中按照每孔2 mL接種細(xì)胞懸液。置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。吸去上清液，分別加入含不同質(zhì)量濃度（0、30、60、125、250 μg/mL）FVP的DMEM培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，除對(duì)照孔其余5 孔使用1 μg/mL BaP處理繼續(xù)培養(yǎng)2 h或10 h，然后每孔加入1 μL DCFH-DA熒光染色劑，孵育30 min使用Guava easyCyte系列微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀上機(jī)測(cè)定異硫氰酸酯（fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC）熒光強(qiáng)度。通過(guò)FlowJo V10軟件計(jì)算出每組的MFI。

1.3.6 MDA含量檢測(cè)

根據(jù)MDA測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)使用各組（對(duì)照組、BaP組、FVP 30+BaP組、FVP 60+BaP組、FVP 125+BaP組、FVP 250+BaP組）100 μL細(xì)胞上清液與其余試劑按比例混勻，并設(shè)立空白管。將各組試管渦旋混勻，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻，按每孔100 μL將各組混合液加入96 孔板，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組532 nm波長(zhǎng)處吸光度。按照說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算MDA濃度。

1.3.7 SOD活力檢測(cè)

根據(jù)SOD測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)使用各組（對(duì)照組、BaP組、FVP 30+BaP組、FVP 60+BaP組、FVP 125+BaP組、FVP 250+BaP組）20 μL細(xì)胞勻漿上清液與其余試劑按比例混勻加入96 孔板，并設(shè)立空白孔。將各孔混勻，37 ℃烘箱孵育20 min，450 nm波長(zhǎng)處酶標(biāo)儀讀數(shù)，測(cè)定各組吸光度。按照說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算SOD活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中每種處理至少7 只動(dòng)物。所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用表示，采用GraphPad Prism 8和Microsoft Excel 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并采用ordinary One-way ANOVA檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FVP灌胃對(duì)BaP誘發(fā)的血管炎癥因子表達(dá)水平的影響

研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，BaP染毒小鼠的血管組織IL-6、MCP-1和ICAM-1分子的相對(duì)表達(dá)水平至少增加1 倍（圖1）。使用50、100、200 mg/kg的FVP預(yù)先灌胃之后BaP染毒小鼠的血管組織表達(dá)IL-6、MCP-1和ICAM-1分子的表達(dá)水平顯著降低，且具有劑量依賴性（圖1）。上述結(jié)果提示，F(xiàn)VP灌胃能夠顯著下調(diào)BaP染毒小鼠血管組織炎癥分子的表達(dá)。

圖1 FVP灌胃對(duì)BaP誘發(fā)的血管炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig.1 Effect of FVP gavage on the expression of vascular inflammatory cytokinesin BaP-induced mice

2.2 FVP灌胃對(duì)BaP誘發(fā)的外周促炎細(xì)胞積累的影響

研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BaP染毒小鼠外周血中單核細(xì)胞（CD11b+Ly6ChighLy6G-）、巨噬細(xì)胞（CD11b+F4/80+）和中性粒細(xì)胞（CD11b+Ly6ClowLy6G+）比例以及脾臟中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例顯著增加（圖2）。與炎癥分子表達(dá)下降相一致的是，50、100 mg/kg FVP灌胃后外周血中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以及脾臟中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例大幅下降。同時(shí)200 mg/kg FVP灌胃后脾臟中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比例也大幅下降。然而，200 mg/kg FVP灌胃后外周血中3 種促炎細(xì)胞比例和脾臟中單核細(xì)胞比例與BaP染毒組無(wú)顯著差異。此外，上述3 種類型促炎細(xì)胞比例上調(diào)與FVP灌胃劑量增加正相關(guān)。上述結(jié)果提示，較低劑量的FVP灌胃能夠顯著下調(diào)BaP染毒小鼠外周血和脾臟中3 種促炎細(xì)胞比例。

圖2 FVP灌胃對(duì)BaP誘發(fā)的外周促炎細(xì)胞積累的影響Fig.2 Effect of FVP gavage on BaP-induced accumulation of proinflammatory cells

2.3 FVP灌胃對(duì)BaP誘發(fā)的骨髓造血作用紊亂的影響

研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BaP染毒小鼠骨髓中造血祖細(xì)胞（c-Kit+Sca-1+）的比例增加了近2 倍，同時(shí)GMP（c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32high）的比例增加近1.5 倍；與之相反的是，BaP染毒小鼠骨髓中造血干細(xì)胞（c-Kit+Sca-1-）和CMP（c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32mid）的比例下降，其中MCP下降超過(guò)一半。而FVP灌胃逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，造血祖細(xì)胞比例下降至與對(duì)照組接近，且50 mg/kg FVP灌胃后GMP和造血干細(xì)胞的比例基本恢復(fù)至正常水平，200 mg/kg FVP灌胃后MCP比例相較BaP染毒小鼠明顯增加，接近正常小鼠骨髓細(xì)胞構(gòu)成的比例（圖3）。以上結(jié)果提示FVP灌胃使骨髓造血細(xì)胞的構(gòu)成回歸至健康對(duì)照組水平，顯著改善了BaP誘發(fā)的骨髓造血系統(tǒng)紊亂。

圖3 FVP灌胃對(duì)BaP誘發(fā)骨髓造血作用紊亂的影響Fig.3 Effect of FVP gavage on BaP-induced hemopoietic disorder in bone marrow

2.4 FVP預(yù)處理對(duì)BaP誘發(fā)Raw264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

研究結(jié)果顯示，1 μg/mL BaP處理2 h不可誘發(fā)Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，BaP處理時(shí)間延長(zhǎng)至10 h可誘發(fā)Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，BaP組DCFH-DA的MFI較對(duì)照組增加近百倍，125 μg/mL和250 μg/mL FVP預(yù)處理組DCFH-DA的M F I 較BaP 組顯著下降（圖4 A）。同時(shí)M D A 檢測(cè)結(jié)果表明，BaP處理10 h后細(xì)胞上清液中MDA含量增加2 倍以上，F(xiàn)VP預(yù)處理組細(xì)胞上清液中MDA含量較BaP組顯著降低，其中60 μg/mL FVP預(yù)處理組下降最明顯，接近正常對(duì)照水平，其余FVP預(yù)處理組較BaP組下降約16%（圖4B）。SOD檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞勻漿上清液中SOD活力為23 U/mL左右，而B(niǎo)aP處理10 h后細(xì)胞勻漿上清液中SOD活力下降至約19 U/mL，F(xiàn)VP預(yù)處理組細(xì)胞勻漿上清液中SOD活力較BaP組顯著改善，其中60 μg/mL FVP預(yù)處理組改善最明顯，接近正常對(duì)照水平，其余FVP預(yù)處理組細(xì)胞勻漿上清液中SOD活力恢復(fù)至約21 U/mL（圖4C）。結(jié)果提示，F(xiàn)VP預(yù)處理能夠顯著抑制BaP引發(fā)Raw264.7細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。

圖4 FVP預(yù)處理對(duì)BaP誘發(fā)Raw264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響Fig.4 Effect of FVP pretreatment on oxidative stress in Raw264.7 cells induced by BaP

3 討論

BaP是一類備受世界各國(guó)關(guān)注的食源性污染物，主要在食品熏、炸、燒、烤等加工過(guò)程中產(chǎn)生，通過(guò)飲食、飲水、皮膚暴露等方式被人體攝入[16]。研究顯示，主動(dòng)脈是BaP的靶器官之一。BaP可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期紊亂、自噬、炎癥損傷等細(xì)胞損傷事件增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[27-28]。研究表明，F(xiàn)VP具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和改善腸道菌群等多種潛在的生物活性[2]。例如，Ma Sheng等[5]的研究顯示，F(xiàn)VP可以增強(qiáng)小鼠抗氧化能力，減少血清中炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的含量，緩解腸炎表型。為明確FVP處理后BaP染毒小鼠血管炎癥損傷的變化情況，本研究通過(guò)免疫組化技術(shù)分析了經(jīng)不同劑量FVP灌胃后BaP染毒小鼠模型胸主動(dòng)脈血管組織炎癥損傷相關(guān)分子（IL-6、MCP-1和ICAM-1）的表達(dá)水平（圖1）。結(jié)果顯示，F(xiàn)VP灌胃可顯著改善BaP染毒小鼠血管組織炎癥相關(guān)因子表達(dá)及外周炎癥細(xì)胞的積累，且具有劑量依賴性。血管炎癥損傷過(guò)程中，促炎細(xì)胞的募集是損傷程度的重要過(guò)程，表現(xiàn)為外周促炎細(xì)胞的增多[19-21]。本研究使用多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了FVP灌胃后的BaP染毒小鼠單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例變化，進(jìn)一步分析FVP對(duì)促炎細(xì)胞募集的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)VP灌胃顯著改善了BaP染毒小鼠外周血中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例以及脾臟中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例（圖2）。這些結(jié)果共同提示，F(xiàn)VP能夠改善BaP誘導(dǎo)的血管炎癥損傷，并且這一功效可能是通過(guò)其免疫調(diào)節(jié)活性達(dá)成。

然而，多項(xiàng)研究表明FVP能夠通過(guò)激活TLR2-NF-κB抑制激酶α軸促進(jìn)B細(xì)胞或Raw264.7細(xì)胞激活，發(fā)揮免疫激活、抗腫瘤等功能[29]。本實(shí)驗(yàn)機(jī)制探究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VP不能顯著抑制BaP染毒Raw264.7細(xì)胞模型IL-6、TNF-α等促炎基因的表達(dá)（結(jié)果未展示），這提示FVP可能通過(guò)其他途徑抑制促炎細(xì)胞的募集和血管炎癥反應(yīng)。炎癥細(xì)胞因子主要來(lái)源于成熟血細(xì)胞，也是炎癥損傷的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子[30-31]。成熟血細(xì)胞由骨髓中的造血干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)[32]，因此造血系統(tǒng)的變化顯著影響機(jī)體的炎癥損傷。本研究結(jié)果表明BaP染毒小鼠血管炎癥發(fā)生的同時(shí)，伴隨著骨髓中造血祖細(xì)胞和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞比例的增加，以及造血干細(xì)胞和普通髓系祖細(xì)胞比例的降低，提示造血系統(tǒng)紊亂。而FVP灌胃顯著改善了造血系統(tǒng)紊亂，使造血祖細(xì)胞的構(gòu)成回歸至健康對(duì)照組水平（圖3），這提示FVP可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)造血系統(tǒng)紊亂，延緩血管炎癥損傷的發(fā)生發(fā)展。

此外，在炎癥發(fā)展過(guò)程中，減少ROS的生成是減輕炎性損傷的一種潛在策略[33]。ROS生成是氧化應(yīng)激的主要特征，低濃度的ROS有助于細(xì)胞生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)，而過(guò)量的ROS可通過(guò)氧化脂質(zhì)分子、激活炎性信號(hào)通路等機(jī)制介導(dǎo)血管重塑性疾病的發(fā)生發(fā)展[34-35]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)VP預(yù)處理可以顯著抑制BaP染毒Raw264.7細(xì)胞模型中ROS和MDA的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞SOD的活力（圖4）。這與之前的研究一致，Wu Ming等[36]發(fā)現(xiàn)FVP在體外具有對(duì)羥自由基、超氧化物自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除作用和還原力；Hu Yuning等[37]的結(jié)果顯示與白色金針菇菌株相比，黃色菌株中經(jīng)80%乙醇沉淀的多糖組分具有最強(qiáng)的抗氧化活性，表明不同品種或FVP的不同組分具有多樣性的生物活性。上述結(jié)果提示具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然活性成分可能通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路最終使細(xì)胞改變應(yīng)激或病理狀態(tài)，回歸穩(wěn)態(tài)。

4 結(jié)論

本研究探討了FVP處理對(duì)BaP染毒小鼠胸腹主動(dòng)脈炎癥標(biāo)志物表達(dá)、外周血和脾臟中促炎細(xì)胞比例變化及骨髓造血細(xì)胞亞群構(gòu)成變化的影響，并在細(xì)胞層面檢查了FVP處理對(duì)BaP共培養(yǎng)后Raw264.7細(xì)胞的炎癥損傷。結(jié)果表明，F(xiàn)VP處理能顯著抑制BaP誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈炎癥介質(zhì)（IL-6、MCP-1、ICAM-1）的表達(dá)，緩解外周免疫器官中的促炎細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）的積累。同時(shí)，F(xiàn)VP處理顯著改善了BaP引起的骨髓中造血祖細(xì)胞亞群構(gòu)成的紊亂狀態(tài)。以上研究結(jié)果提示，F(xiàn)VP能夠通過(guò)維持造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，緩解BaP對(duì)機(jī)體的炎癥損傷，細(xì)胞層面上，F(xiàn)VP處理后可抑制BaP誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。綜上所述，F(xiàn)VP可能具有良好的抗炎和心血管保護(hù)作用，這為開(kāi)發(fā)相關(guān)的功能食品或藥品提供了參考。