基于多酶恒溫快速擴(kuò)增-側(cè)向流層析聯(lián)用技術(shù)的肉制品真實(shí)性研究

尚 柯，張 彪，張 敏，楊華雨，葉 梅，段慶梓，王 巍，宮亞君

（成都市食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611135）

食品真實(shí)性以實(shí)現(xiàn)消費(fèi)信任為目標(biāo)，防止摻假與欺詐[1]，保證食品的安全與可靠，是全球食品安全領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[2]，是當(dāng)前食品安全監(jiān)管領(lǐng)域的重點(diǎn)、難點(diǎn)?？v觀世界食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷程，從初始作坊式發(fā)展時(shí)期，到工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)期，乃至現(xiàn)代食品產(chǎn)業(yè)體系建立時(shí)期，從兩千多年前的古代社會(huì)到今天的現(xiàn)代社會(huì)，全球各個(gè)國(guó)家和地區(qū)食品摻假與欺詐行為一直存在[3-5]?！蛾套哟呵铩?nèi)篇雜下》中“君使服之于內(nèi)，而禁之于外，猶懸牛首于門而賣馬肉于內(nèi)也”和宋代釋普濟(jì)的《五燈會(huì)元》卷十六“懸羊頭，賣狗肉，壞后進(jìn)，初幾滅”是關(guān)于我國(guó)食品摻假的最早記載。13世紀(jì)意大利即有了食品造假的記載[6]，英國(guó)19世紀(jì)是牛奶摻假的盛行時(shí)期，其中尤以19世紀(jì)后半葉最為嚴(yán)重[7]，南北戰(zhàn)爭(zhēng)前后，美國(guó)也同樣經(jīng)歷了一個(gè)食品摻假肆虐橫行的漫長(zhǎng)過(guò)程。2013年“馬肉冒充牛肉事件”以來(lái)[8]，歐盟建立了食品和飼料快速預(yù)備警系統(tǒng)[9]，將食品真實(shí)性技術(shù)研究列入“歐盟地平線2020計(jì)劃”項(xiàng)目重點(diǎn)研究領(lǐng)域；美國(guó)藥典委員會(huì)建立了食品欺詐數(shù)據(jù)庫(kù)，美國(guó)食品保護(hù)與防御國(guó)家中心創(chuàng)建了經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)型摻假食品欺詐數(shù)據(jù)庫(kù)[10]；2014年，我國(guó)食品科學(xué)界將食品真實(shí)性單列出來(lái)，與食品安全和食品質(zhì)量并駕齊驅(qū)，成為消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)。

隨著科技的發(fā)展，肉制品真實(shí)性檢測(cè)方法越來(lái)越多樣化，基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、實(shí)時(shí)熒光PCR等技術(shù)可以從樣品中檢測(cè)出痕量目標(biāo)分子，具有靈敏特異等諸多優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為食品真實(shí)性研究的一個(gè)基本和必要的技術(shù)手段，并在檢測(cè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[11-12]。如GB/T 38164—2019《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[13]、SN/T 3730—2013[14]、SN/T 3731—2013[15]等系列標(biāo)準(zhǔn)已成為目前食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的常用技術(shù)，但是傳統(tǒng)的擴(kuò)增技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室、儀器及人員要求較高，不適于基層實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求，快速、便攜、可應(yīng)用于即時(shí)檢驗(yàn)的核酸擴(kuò)增技術(shù)相對(duì)缺乏[16-17]。近年來(lái)，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了核酸擴(kuò)增技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)快檢中的應(yīng)用，它不需要高溫變性、退火等步驟，對(duì)精密儀器依賴程度大大降低，是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快檢有效的技術(shù)手段，被廣泛應(yīng)用于食品安全、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和流行病學(xué)等領(lǐng)域[18-19]。

多酶恒溫快速擴(kuò)增（multienzyme isothermal rapid amplification，MIRA）技術(shù)是在重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增方法[20]，其技術(shù)原理如圖1所示。在37 ℃條件下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開始對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸，依賴核酸內(nèi)切酶的作用，加入根據(jù)模板設(shè)計(jì)的特異性分子探針[21-22]，結(jié)合封閉式側(cè)向流層析（lateral flow dipstick，LFD）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物快速檢測(cè)[23]。該方法與側(cè)流式膠體金法有機(jī)結(jié)合，不僅能達(dá)到簡(jiǎn)捷、靈敏、特異檢測(cè)的目的，而且能更好地為現(xiàn)場(chǎng)動(dòng)物源性成分檢測(cè)提供可視化應(yīng)用服務(wù)[24-25]。

圖1 MIRA技術(shù)原理Fig.1 Principle of MIRA

為了提高肉制品真實(shí)性檢測(cè)方法的可操作性，建立建全肉制品真實(shí)性檢測(cè)的快檢方法，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)肉制品建立了牛、羊、豬、雞、鴨專屬性MIRA-LFD檢測(cè)方法，以期為監(jiān)管部門提供肉制品真實(shí)性現(xiàn)場(chǎng)快檢技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用樣品均來(lái)自成都市風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。

細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；Qiagen QIAamp DNA mini Kit 德國(guó)Qiagen公司；PCR Mix、Marker、Loading緩沖液、Gold View染料 天根生化科技（北京）有限公司；DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒 濰坊安普未來(lái)生物科技有限公司；側(cè)流式膠體金試紙條 德國(guó)Milenia Biotec公司；SsoAdvanced? Universal Probes Supermix 美國(guó)Bio-Rad公司；RNA酶、淀粉酶 美國(guó)Sigma公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；水為滅菌去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Academic實(shí)驗(yàn)室超純水儀 美國(guó)Millipore公司；MM400行星球磨儀 德國(guó)Retsch公司；Centrifuge 5427R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；ME2002E電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；BSA224S電子天平德國(guó)賽多利斯公司；MK3渦懸振蕩器 德國(guó)IKA公司；P330核酸蛋白定量?jī)x 德國(guó)Implen公司；Thermo-Shaker BG-100干式恒溫器 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；熒光定量PCR儀、XR+凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物探針設(shè)計(jì)

引物及探針均為自行設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，最終確定的引物探針名稱及序列見表1。

表1 引物探針信息Table 1 Sequences of primers and probes

1.3.2 引物探針篩選

1.3.2.1 陽(yáng)性對(duì)照引物組篩選

根據(jù)設(shè)計(jì)的22 條正向引物、23 條反向引物、9 條探針進(jìn)行交叉組合，陽(yáng)性對(duì)照引物組合共計(jì)74 組，電泳反應(yīng)體系（50 μL）包括29.4 μL的A緩沖液、1.0 μL目標(biāo)源性核酸模板和2.5 μL B緩沖液、每對(duì)引物（10 μmol/L）各0.25 μL，并用去離子水補(bǔ)足50 μL，設(shè)立以滅菌去離子水為DNA模板的空白對(duì)照組；同時(shí)以MIRA試劑盒提供的正對(duì)照模板單元作為實(shí)驗(yàn)質(zhì)控對(duì)照。正對(duì)照體系配制（由試劑盒提供）：1 μL正對(duì)照模版、4 μL正對(duì)照引物Mix（包含上/下游引物），其他組分如上體系配制。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃、5 min。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行水平電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.3.2.2 空白對(duì)照引物組篩選

根據(jù)1.3.2.1節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MIRA陽(yáng)性對(duì)照引物探針組合共計(jì)96 對(duì)，MIRA-LFD膠體金反應(yīng)體系（50 μL）包括29.4 μL A緩沖液、2.0 μL去離子水和2.5 μL B緩沖液、每對(duì)引物（10 μmol/L）各1.0 μL、探針（10 μmol/L）0.3 μL，并用去離子水補(bǔ)足50 μL，設(shè)立動(dòng)物源性成分肉制品為陽(yáng)性對(duì)照，以去離子水為DNA模板的空白對(duì)照組。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃、5 min。吸取10 μL反應(yīng)液加入190 μL去離子水中，插入膠體金試紙，通過(guò)膠體金試紙直接判讀結(jié)果，C線為控制線，T線為檢測(cè)線。

1.3.2.3 陰性對(duì)照引物組篩選

根據(jù)1.3.2.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選空白對(duì)照中未出現(xiàn)檢測(cè)線（T線）的引物探針組合33 對(duì)，MIRA-LFD膠體金反應(yīng)體系（50 μL）包括29.4 μL A緩沖液、2.0 μL陰性對(duì)照核酸模板和2.5 μL B緩沖液、每對(duì)引物（10 μmol/L）各2.0 μL、探針（10 μmol/L）0.6 μL，并用去離子水補(bǔ)足50 μL。其中，陰性對(duì)照分別為牛、羊、豬、雞和鴨樣品提取的DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃、5 min；吸取10 μL反應(yīng)液加入190 μL去離子水中，插入膠體金試紙，通過(guò)膠體金試紙直接判讀結(jié)果，C線為控制線，T線為檢測(cè)線。其中樣品編號(hào)N為牛源性成分，Y為羊源性成分，Z為豬源性成分，C為雞源性成分，D為鴨源性成分檢測(cè)，B為相應(yīng)引物探針的空白對(duì)照。

1.3.3 MIRA-LFD檢測(cè)方法建立

1.3.3.1 檢測(cè)體積篩選

根據(jù)1.3.2節(jié)篩選確定的引物探針組合，考察不同引物探針體積對(duì)MIRA反應(yīng)體系的影響。MIRA-LFD膠體金反應(yīng)體系（50 μL）如表2所示。其中，樣品分別為牛、羊、豬、雞和鴨樣品提取的DNA模板。

表2 反應(yīng)體系組合Table 2 Composition of different reaction systems μL

1.3.3.2 反應(yīng)溫度篩選

根據(jù)確定的反應(yīng)體系，考察不同溫度對(duì)MIRA反應(yīng)體系的影響，選擇30、37、40、45、50 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MIRA-LFD膠體金反應(yīng)體系（50 μL）包括29.4 μL A緩沖液、1.0 μL不同陽(yáng)性對(duì)照核酸模板和2.5 μL B緩沖液、每對(duì)引物各0.25 μL、探針0.075 μL，并用去離子水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0、37、40、45、50 ℃，分別進(jìn)行反應(yīng)。

1.3.3.3 反應(yīng)時(shí)間篩選

根據(jù)以上確定的反應(yīng)體系和溫度，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)MIRA反應(yīng)體系的影響，選擇1、5、10、15、25 min反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MIRA-LFD膠體金反應(yīng)體系（50 μL）包括29.4 μL A緩沖液、1.0 μL不同陽(yáng)性對(duì)照核酸模板和2.5 μL B緩沖液、每對(duì)引物各0.25 μL、探針0.075 μL，并用去離子水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為1、5、10、15、25 min。

1.3.3.4 檢出限確定及MIRA-LFD檢測(cè)體系建立

稱取200 mg牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉組織，分別轉(zhuǎn)移至2.0 mL的離心管中。然后向每個(gè)離心管加入400 μL細(xì)胞裂解液（由DNA提取試劑盒提供）和20 μL蛋白酶K（由DNA提取試劑盒提供），充分振蕩混勻，置于55 ℃過(guò)夜裂解，直至樣品裂解完全。

樣品完全裂解后，以一種動(dòng)物源性組織裂解液為樣品，以另一種動(dòng)物源性組織裂解液為本底配制10%、1%、0.1%和0.01%（體積分?jǐn)?shù)）的模擬樣本。分別進(jìn)行DNA提取，依照實(shí)時(shí)熒光PCR法（依據(jù)GB/T 38164—2019）和MIRA-LFD法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 快提試劑盒考察

將建立的MIRA-LFD方法與DNA快提試劑盒相結(jié)合，考察這兩種方法之間的適應(yīng)性，并且與現(xiàn)有DNA提取方法比較，樣品信息見表3。

表3 樣品信息及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果Table 3 Sample information and risk monitoring results

1.3.4.2 靈敏度考察

靈敏度是指方法在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到實(shí)際檢出限時(shí)，檢出陽(yáng)性結(jié)果的樣品數(shù)占總陽(yáng)性樣品數(shù)的百分比，分別選擇牛、羊、豬、雞、鴨的檢測(cè)體系進(jìn)行10 個(gè)樣品的靈敏度考察，確定方法的靈敏度。

1.3.4.3 特異性考察

采用快檢方法及其相關(guān)產(chǎn)品的交叉反應(yīng)率反映產(chǎn)品的特異性，即目標(biāo)源性成分檢出限與非目標(biāo)源性成分檢出陽(yáng)性的最小濃度的比值（以百分比計(jì)）。分別將目標(biāo)成分與非目標(biāo)成分按一定比例混合，評(píng)價(jià)方法的特異性，記錄檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的最小濃度。當(dāng)加入非目標(biāo)源性成分濃度水平大于或等于檢出限的1 000 倍時(shí)，特異性（交叉反應(yīng)率）視為小于1%。

1.3.4.4 假陽(yáng)性率與假陰性率考察

按照本方法建立的反應(yīng)參數(shù)、體系、反應(yīng)條件，對(duì)方法進(jìn)行假陽(yáng)性率與假陰性率的考察。分別選擇牛、羊、豬、雞、鴨的檢測(cè)體系進(jìn)行5 種物種的假陽(yáng)性率與假陰性率的考察。樣品來(lái)源于日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，具體情況見表3。

1.4 假陰性率與假陽(yáng)性率計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針設(shè)計(jì)結(jié)果

本方法選取被廣泛應(yīng)用于物種鑒別的線粒體基因細(xì)胞色素氧化酶b（cytochrome oxidase b，Cyt b）基因、線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I亞基（cytochrome coxidase subunit I，Cox I）和線粒體DNA 12S rRNA（12S）作為靶基團(tuán)，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇牛（GU249568.1）、豬（X56295）、羊（AF010406）、雞（MT800504.1）、鴨（U59666.1）的基因序列進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)（表4）。

表4 引物探針序列比對(duì)靶基因Table 4 Target gene-specific primer and probe sequences

在引物設(shè)計(jì)時(shí)，選擇堿基排布隨機(jī)性高、GC相對(duì)含量在30%～70%之間的引物序列，并且在下游引物的5’端標(biāo)記biotin修飾基團(tuán)；對(duì)于MIRA法的探針序列，應(yīng)避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基，長(zhǎng)度一般在46～52 nt，在5’端修飾一個(gè)FAM標(biāo)記，在距5’端約30 nt序列位置上標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃）作為nfo（核酸內(nèi)切酶）的識(shí)別位點(diǎn)，另外THF距離3’末端約15 nt，并且3’末端標(biāo)記一個(gè)C3 spacer修飾基團(tuán)。

根據(jù)物種序列比對(duì)結(jié)果，結(jié)合MIRA引物探針設(shè)計(jì)原則，對(duì)牛、羊、豬、雞、鴨的引物和探針序列進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)分析比對(duì)，以確保其高度的特異性，防止出現(xiàn)二聚體、莖環(huán)及發(fā)卡等影響檢測(cè)效率的結(jié)構(gòu)，共設(shè)計(jì)22 條正向引物、23 條反向引物、9 條探針。

2.2 引物探針篩選結(jié)果

2.2.1 陽(yáng)性對(duì)照篩選研究

根據(jù)74 對(duì)引物與試劑盒配套陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果（以鴨源性檢測(cè)為例，見圖2），70 對(duì)引物組合陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)條帶（除N1～N4），但其中D3組合和D6組合空白對(duì)照結(jié)果出現(xiàn)明顯引物二聚體，因此篩選其他引物組合與相應(yīng)的探針進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 鴨源性成分陽(yáng)性對(duì)照篩選結(jié)果Fig.2 Results of positive control screening for duck-derived ingredients

2.2.2 空白對(duì)照篩選研究

96 對(duì)引物探針空白對(duì)照篩選結(jié)果表明（以牛源性檢測(cè)為例，見圖3），33 對(duì)引物探針組合空白對(duì)照未出現(xiàn)T線，表明未出現(xiàn)非特異結(jié)合；其余63 對(duì)引物探針均出現(xiàn)T線，因此選擇33 對(duì)未出現(xiàn)T線的引物探針組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 牛源性引物探針空白對(duì)照篩選結(jié)果Fig.3 Results of blank control screening for bovine-derived primers and probes

2.2.3 陰性對(duì)照篩選研究

根據(jù)33 對(duì)引物探針陰性對(duì)照結(jié)果（以豬源性檢測(cè)部分結(jié)果為例，見圖4），5 對(duì)引物探針組合（分別為牛源性F3R1P1、豬源性F3R4P2、羊源性F3R3P、雞源性BF3BR3BP和鴨源性BF2BR2BP）結(jié)果最為理想，無(wú)非特異結(jié)合現(xiàn)象。

圖4 豬源性引物探針陰性對(duì)照篩選結(jié)果Fig.4 Results of negative control screening for porcine-derived primers and probes

在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)5 對(duì)引物探針組合增加陰性對(duì)照物種數(shù)，進(jìn)一步考察這5 對(duì)引物探針組合的特異性，MIRA-LFD結(jié)果見圖5。

圖5 陰性對(duì)照篩選結(jié)果Fig.5 Results of negative control screening

實(shí)驗(yàn)篩選出的5 對(duì)引物探針組合在牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、狐貍、貂、貓和海貍鼠為陰性（其中包括引物探針對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性情況）表現(xiàn)出良好的特異性，未出現(xiàn)明顯的非特異性結(jié)合，因此將這5 種組合（牛源性F3R1P1、豬源性F3R4P2、羊源性F3R3P、雞源性BF3BR3BP和鴨源性BF2BR2BP）作為該項(xiàng)目檢測(cè)牛、羊、豬、雞和鴨源性體系的引物探針組合。

2.3 MIRA-LFD檢測(cè)體系建立

2.3.1 反應(yīng)體積篩選結(jié)果

根據(jù)圖6結(jié)果顯示，各組合C線均出現(xiàn)條帶，組合2中CB、組合3中的YB、組合4中的YB和CB的檢測(cè)線T線均出現(xiàn)明顯條帶，說(shuō)明隨著濃度增高，假陽(yáng)性結(jié)果隨之升高，因此選擇最終確定的引物探針添加量為引物0.25 μL、探針0.075 μL。

圖6 引物探針體積篩選結(jié)果Fig.6 Results of screening of primer and probe volumes

2.3.2 反應(yīng)溫度篩選結(jié)果

根據(jù)圖7結(jié)果顯示，30、37、40 ℃樣品動(dòng)物源性成分檢測(cè)結(jié)果T線均出現(xiàn)明顯條帶，但在37 ℃條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果最好。40 ℃羊源性、豬源性、雞源性樣品空白對(duì)照T線均出現(xiàn)明顯條帶，說(shuō)明出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增情況。50 ℃條件下，T線條帶均不明顯，推測(cè)50 ℃影響了酶的活性。因此選擇37 ℃作為MIRA-LFD反應(yīng)的溫度。

圖7 反應(yīng)溫度篩選結(jié)果Fig.7 Results of reaction temperature screening

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間篩選結(jié)果

根據(jù)圖8結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MIRALFD檢測(cè)體系中的非特異結(jié)合更易出現(xiàn)（圖中空白對(duì)照結(jié)果）。因此選擇5 min作為MIRA-LFD檢測(cè)體系的反應(yīng)時(shí)間。

圖8 反應(yīng)時(shí)間篩選結(jié)果Fig.8 Results of reaction time screening

2.3.4 檢出限研究及方法建立

根據(jù)圖9結(jié)果顯示，熒光定量PCR均檢出混合樣品中的相應(yīng)動(dòng)物源性，并且不同稀釋度之間呈良好的梯度，表明上述混樣方法有效。根據(jù)圖10結(jié)果顯示，膠體金試紙條出現(xiàn)明顯色差，證明可以通過(guò)膠體金顏色的深淺判斷樣品中是否含有相應(yīng)的動(dòng)物源性成分，其中牛源性成分的檢出限為1%，羊源性成分的檢出限為1%，豬源性成分的檢出限為0.1%，雞源性成分的檢出限為0.1%，鴨源性成分的檢出限為1%，所有方法的檢出限均能達(dá)到1%。

圖9 牛、羊、豬、雞、鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢出限結(jié)果Fig.9 Detection limits of fluorescent real-time PCR for bovine,porcine,ovine,chicken and duck-derive ingredients

圖10 混合樣品牛、羊、豬、雞、鴨成分檢出限Fig.10 Detection limits of bovine,porcine,ovine,chicken and duckderived ingredients in mixed samples

根據(jù)以上篩選與研究，最終確定的MIRA-LFD反應(yīng)體系及條件為：引物（10 μmol/L）各0.25 μL、探針（10 μmol/L）0.075 μL、A緩沖液29.4 μL、B緩沖液2.5 μL、模板DNA 1 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足50 μL。37 ℃反應(yīng)5 min，吸取10 μL反應(yīng)液加入190 μL去離子水中，插入膠體金試紙，通過(guò)膠體金試紙直接判讀結(jié)果。本方法的檢出限為1%。

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 快提試劑盒與傳統(tǒng)試劑盒比對(duì)

根據(jù)圖11結(jié)果顯示，本方法采用DNA快速提取方法與傳統(tǒng)DNA提取方法結(jié)果一致，均檢出相應(yīng)的動(dòng)物源性成分。

圖11 傳統(tǒng)DNA提取試劑盒與快提試劑盒方法比對(duì)結(jié)果Fig.11 Comparison of traditional and rapid DNA extraction kits

2.4.2 靈敏度考察結(jié)果

靈敏度考察結(jié)果見圖12與表5。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的牛、豬、羊、雞、鴨方法的靈敏度分別為90%、100%、100%、100%、80%，平均靈敏度為94%。

表5 靈敏度考察數(shù)據(jù)Table 5 Sensitivity of the method

圖12 靈敏度考察結(jié)果圖Fig.12 Results of sensitivity analysis

2.4.3 特異性考察結(jié)果

特異性考察結(jié)果見圖13與表6。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的牛、豬、羊、雞、鴨方法的特異性均達(dá)到1%。

表6 特異性考察數(shù)據(jù)Table 6 Specificity of the method

圖13 特異性考察結(jié)果Fig.13 Results of specificity analysis

2.4.4 假陽(yáng)性率、假陰性率考察結(jié)果

假陽(yáng)性率、假陰性率考察結(jié)果見表7。以表3實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果作為對(duì)比依據(jù)，結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的牛源性檢測(cè)方法假陽(yáng)性率為0%，假陰性率為2.56%；豬源性檢測(cè)方法假陽(yáng)性率為7.69%，假陰性率為5.13%；羊源性檢測(cè)方法假陽(yáng)性率為4.76%，假陰性率為0%；雞源性檢測(cè)方法假陽(yáng)性率為0%，假陰性率為10%；鴨源性檢測(cè)方法假陽(yáng)性率為5%，假陰性率為0%；方法的平均假陽(yáng)性率為3.49%，假陰性率為3.54%。

表7 假陽(yáng)性率、假陰性率考察Table 7 False positive and false negative rates of the method

3 結(jié)論

自2006年P(guān)iepenburg等[26]研發(fā)出RPA技術(shù)以來(lái)，RPA技術(shù)發(fā)展極為迅速[27]，在醫(yī)療診斷、農(nóng)業(yè)、食品等方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，本研究所涉及的MIRA法就以RPA技術(shù)為基礎(chǔ)，在一定程度上優(yōu)化了多酶條件下相關(guān)試劑的穩(wěn)定性，更易于在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。鑒于肉類摻假現(xiàn)象的出現(xiàn)，基于DNA的肉類鑒定方法已成為食品真實(shí)性鑒定的首選方法[28]。

項(xiàng)目組建立了MIRA-LFD快速檢測(cè)方法，本方法可在10 min內(nèi)動(dòng)物源性成分檢測(cè)，方法的檢出限可達(dá)1%；對(duì)建立的方法進(jìn)行靈敏度考察、特異性考察、假陽(yáng)性率、假陰性率考察[29-30]，該試劑盒平均靈敏度為94%，特異性為1%，方法的平均假陽(yáng)性率為3.49%、假陰性率為3.54%，均未超過(guò)20%，使用市售商業(yè)化DNA快速提取試劑進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與傳統(tǒng)DNA提取試劑盒一致，說(shuō)明MIRA-LFD的多酶反應(yīng)體系適用于DNA快速提取和常規(guī)提取方法?？焖貲NA提取方法在時(shí)效性、操作性和對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害性等方面明顯優(yōu)于現(xiàn)有DNA提取方法，在提高檢測(cè)效率的同時(shí)為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了一種解決方案，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

項(xiàng)目承擔(dān)單位組織中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心、天津海關(guān)植物與食品檢測(cè)中心、成都海關(guān)技術(shù)中心3 家單位采用本項(xiàng)目研發(fā)的引物探針、膠體金試劑盒及操作說(shuō)明，對(duì)提供的不同基質(zhì)的樣品進(jìn)行了豬、牛、羊、雞、鴨源性成分的靈敏度、特異性、假陽(yáng)性率、假陰性率驗(yàn)證。聯(lián)合驗(yàn)證的結(jié)果表明，該方法的平均靈敏度88%～92%，特異性均達(dá)到1%，假陽(yáng)性率9.70%～14.51%，假陰性率6.56%～14.54%。評(píng)價(jià)結(jié)果均為該試劑盒可靠有效。本研究開發(fā)了現(xiàn)場(chǎng)快速可視化檢測(cè)肉制品中動(dòng)物源性成分的方法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，同時(shí)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，可用于現(xiàn)場(chǎng)的肉制品真實(shí)性鑒別。結(jié)果表明，該方法是一種高效、靈敏、特異、高實(shí)用性的動(dòng)物源性成分鑒別方法，為肉制品的真實(shí)性鑒定和摻假提供了更加準(zhǔn)確和科學(xué)的檢測(cè)方法，為監(jiān)管部門提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)依據(jù)，使基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)真實(shí)性快檢成為可能。