全自動固相萃取—高效液相色譜法測定現(xiàn)制飲料中7種合成著色劑

姚譽(yù)陽

徐 曼2

潘春燕1

繆 雄3,4

薛 強(qiáng)1

(1. 無錫市疾病預(yù)防控制中心〔南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫疾病預(yù)防控制中心〕,江蘇 無錫 214023;2. 新疆克拉瑪依市疾病預(yù)防控制中心,新疆 克拉瑪依 834000;3. 無錫市食品安全檢驗(yàn)檢測中心,江蘇 無錫 214142;4. 國家市場監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心〔特殊食品〕,江蘇 無錫 214142)

合成著色劑是一類人工合成色素,具有色澤鮮亮、著色力好、價格便宜、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等顯著優(yōu)勢,在食品加工過程中被廣泛使用,達(dá)到改善食品顏色的目的[1-3]。合成著色劑主要是由苯和甲苯為原料合成,對人體存在潛在危害,長期過量攝入,可能會導(dǎo)致生育力降低,幼兒行為過激乃至智力發(fā)育異常等[4-7]。雖然中國對合成著色劑使用有嚴(yán)格的限量規(guī)定,但是在實(shí)際生產(chǎn)過程中,往往存在一定的使用主觀性,如鮮榨果蔬汁、奶茶、奶昔和咖啡等現(xiàn)場制作飲料,易造成合成著色劑過量使用的情況[8-10]。

目前,中國針對食品中常用合成著色劑的測定標(biāo)準(zhǔn)有GB 5009.141—2016、GB 5009.35—2016、SN/T 1743—2006等,這些標(biāo)準(zhǔn)采用聚酰胺吸附法或液—液分配法提取,并不具備良好的普適性。其中,赤蘚紅僅能采用液—液分配法提取。同時,上述標(biāo)準(zhǔn)中的測定方法氨水等有機(jī)溶劑使用量大;還需采用抽濾、液—液萃取、水浴蒸發(fā)等操作,前處理繁瑣,難以應(yīng)用于批量樣品操作。針對以上問題,研究擬采用新型固相萃取柱同時提取現(xiàn)制飲料中7種合成著色劑,同時結(jié)合全自動固相萃取儀,優(yōu)化樣品前處理方法和色譜分析條件,以期提高檢驗(yàn)檢測效率,支撐現(xiàn)制飲料中合成著色劑的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(信息見表1):中國計量科學(xué)研究院;

表1 7種合成著色劑信息

乙酸銨、甲酸:色譜級,上海麥克林生化科技股份有限公司;

乙腈、甲醇:色譜純,賽默飛世爾科技有限公司;

檸檬酸、氨水:分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司;

食品中合成著色劑專用SPE小柱CNW Poly-sery(500 mg/6 mL):上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司;

Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm):美國安捷倫公司;

試驗(yàn)用水:自制超純水,電阻率18.2 MΩ·cm;

現(xiàn)制飲料樣品:市售。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀—二極管陣列檢測器:1200型,美國安捷倫公司;

渦旋振蕩器:DMT-2500型,常州白塔新寶儀器廠;

全自動固相萃取儀:Extrahera型,瑞典拜態(tài)齊公司;

超純水儀:Milli-Q型,美國密理博公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

移取7種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL,置于10 mL容量瓶中,用純水稀釋至刻度,配制成100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置于4 ℃冰箱保存(保存期為1個月)。將上述儲備液用純水逐級稀釋成0.5,1.0,5.0,10,20,50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

于15 mL聚丙離心管中稱取樣品約1 g(精確至0.001 g),加入6 mL純水,渦旋30 s,超聲提取5 min,4 000 r/min離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至另一15 mL離心管中。殘渣再加入6 mL純水,重復(fù)操作一次。合并兩次上清液。用20%的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)提取液至pH為3～4。

運(yùn)用全自動固相萃取儀,在0.12 MPa下,分別用5 mL 甲醇和5 mL純水對Poly-sery色素專用進(jìn)行活化,處理時間為150 s,立即在0.05 MPa壓力下,將上述全部提取液過柱,并用5 mL甲醇—甲酸—水混合溶液(V甲醇∶V甲酸∶V水=4∶2∶4)清洗小柱并干燥。在0.08 MPa下用3 mL 10%氨水甲醇溶液洗脫兩次。收集洗脫液于15 mL離心管中,50 ℃水浴下氮吹濃縮至200 μL左右,用50%的流動相A+50%的流動相B定容至1.0 mL,渦旋混勻。過0.45 μm親水PTFE針式過濾器,濾液置于進(jìn)樣小瓶中,待測。

1.5 色譜條件

色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流動相:20 mmol/L乙酸銨—甲醇;洗脫方式:梯度洗脫;柱溫:35 ℃;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;檢測器:二極管陣列;波長:254,628 nm。梯度洗脫程序見表2,其中A相為甲醇,B相為20 mmol/L乙酸銨溶液。

表2 梯度洗脫程序

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用儀器工作站進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及含量計算,Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,Origin 8.1繪制圖譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件優(yōu)化

為探究最佳萃取條件,采用單因素法對前處理過程中的影響參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。取不含7種合成著色劑的現(xiàn)制飲料樣品(檸檬汁)進(jìn)行5 mg/kg加標(biāo),所有試驗(yàn)在此加標(biāo)水平下完成,每個試驗(yàn)平行3次。

2.1.1 提取方式優(yōu)化 已報道的食品中合成著色劑的提取溶劑有氨水—甲醇[1]、乙醇—氨水—水[11-13]、三正辛胺—正丁醇[11]、甲醇—水[14]、純水[15]等。研究的基質(zhì)為現(xiàn)制飲料,合成著色劑在制作過程中絕大部分已溶于水中。因此,優(yōu)先采用純水提取。當(dāng)取樣量為1 g時,采用6 mL以上水提取,提取效率已無明顯變化。如果部分飲料含有果蔬纖維、蛋白質(zhì)、脂肪等,一次提取無法完全,這可能是由于離心后殘渣較多,部分合成著色劑吸附在殘渣上。進(jìn)一步二次提取后,各合成著色劑回收率均達(dá)到90%以上,采用3次提取,回收率無明顯變化。試驗(yàn)表明,現(xiàn)制飲料,經(jīng)過純水提取兩次后,7種合成著色劑均取得滿意的提取效果,無須使用任何有機(jī)溶劑。故采用6 mL純水提取兩次,每次超聲5 min,4 000 r/min離心5 min,合并兩次上清液待凈化。

2.1.2 提取液pH值優(yōu)化 現(xiàn)制飲料的pH值大多為5與7,用20%的檸檬酸水溶液或氨水(1+1)調(diào)節(jié)pH值為2～6,考察了pH值對回收率的影響,結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取液pH對回收率的影響

由圖1可知,pH值在3～4時,7種物質(zhì)的回收率均達(dá)到最大,可能是由于合成著色劑在此pH值范圍內(nèi)以單分子的形式存在,保持良好的穩(wěn)定性,提取過程中損失較小。故后續(xù)試驗(yàn)調(diào)節(jié)提取液pH值為3～4。

2.1.3 淋洗液優(yōu)化 采用1.4中甲醇—甲酸—水混合溶液淋洗,赤蘚紅回收率僅為(79.8±3.85)%,其余6種物質(zhì)回收率均在90%以上,推測可能是除赤蘚紅外,6種合成著色劑均含有較多的磺酸鈉基團(tuán),在酸性條件下生成磺酸根,與SPE填料結(jié)合很緊密,甲醇/甲酸/水溶液并不能使其分離,故淋洗液可以洗去一些雜質(zhì);而赤蘚紅在酸性條件下生成酚羥基,與填料相互作用不強(qiáng),在甲醇等有機(jī)溶劑的淋洗下,容易溶解在甲醇中隨淋洗液流出,故赤蘚紅回收率低。嘗試僅用純水淋洗,有效降低淋洗液的洗脫強(qiáng)度,赤蘚紅的回收率提高至(93.4±0.60)%,提取效果滿意。因此,當(dāng)樣品中存在赤蘚紅時,可用純水淋洗。

2.1.4 洗脫液優(yōu)化 欲將合成著色劑從固相萃取小柱中洗脫出來,需調(diào)節(jié)體系為堿性,常用的洗脫液為氨水甲醇溶液?？疾炝税彼壤龑厥章实挠绊?結(jié)果如圖2所示。

圖2 氨水比例對回收率的影響

由圖2可知,當(dāng)氨水比例為10%時,各物質(zhì)的回收率達(dá)到最大,繼續(xù)提高氨水比例,各物質(zhì)回收率基本不變,推測可能是10%的氨水甲醇作為洗脫液,使合成著色劑分子與填料作用力減弱從而被有機(jī)溶劑洗脫。同時,相對于更高比例的氨水,有效減少了氮吹濃縮時間。故選擇10%的氨水甲醇作為洗脫液,用量為3 mL洗脫2次。

2.1.5 復(fù)溶試劑優(yōu)化 嘗試采用純水作為復(fù)溶劑,觀察到管壁上有很多紅色物質(zhì)殘留,反復(fù)渦旋后仍難以溶解,上機(jī)測定,發(fā)現(xiàn)赤蘚紅回收率低于20%,其他6種合成著

色劑回收率超過90%,推測是赤蘚紅水溶性差所致。加入一定比例甲醇后,有望明顯提升赤蘚紅回收率。研究表明,用甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)或甲醇—20 mmol/L乙酸銨(V甲醇∶V乙酸銨=1∶1)溶解,赤蘚紅回收率在90%以上。因流動相也為甲醇—20 mmol/L乙酸銨溶液,為減小溶劑效應(yīng),復(fù)溶試劑也采用甲醇—20 mmol/L乙酸銨(V甲醇∶V乙酸銨=1∶1)。

2.1.6 濾膜選擇 研究過程中發(fā)現(xiàn),部分濾膜對合成著色劑有吸附作用。為評估濾膜的適用情況,采用20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接過濾膜測定,共考察了7種常見的濾膜,結(jié)果如表3所示。

表3 不同濾膜對合成著色劑的吸附作用

由表3可知,尼龍濾膜對各物質(zhì)均有吸附作用,可能是因?yàn)槟猃垶V膜由聚酰胺制成,與各種合成著色劑作用明顯,應(yīng)避免使用。此外,除親水性PTFE濾膜,其他類型的濾膜對赤蘚紅有不同程度的吸附。綜合考慮,采用親水性PTFE濾膜過濾。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動相優(yōu)化 考察了乙酸銨水溶液—甲醇體系和乙酸銨水溶液—乙腈體系對分離效果的影響,結(jié)果在兩種流動相體系下,各物質(zhì)均能達(dá)到良好的分離效果,且基線均平穩(wěn)。考慮到甲醇毒性小且價格低廉,故采用乙酸銨水溶液—甲醇體系作為流動相。比較了乙酸銨水溶液含量(0,5,10,20,30,40,50 mmol/L)對分離效果的影響,結(jié)果表明,不添加乙酸銨時,某些物質(zhì)無法被洗脫,且峰形較差,隨著乙酸銨含量的提高,待測物的峰型明顯改善,峰面積隨之升高,當(dāng)乙酸銨含量超過20 mmol/L時,各物質(zhì)分離效果均無明顯變化,且高濃度的乙酸銨與甲醇混合后易析出,造成色譜柱損壞。故流動相采用甲醇20 mmol/L乙酸銨體系。

由于7種物質(zhì)極性相差大,故采用梯度洗脫方式。其中檸檬黃與新紅結(jié)構(gòu)相似,較難分離,需小心調(diào)節(jié)流動相比例,最終形成1.5中的色譜條件。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖3。

1. 檸檬黃 2. 新紅 3. 莧菜紅 4. 胭脂紅 5. 日落黃 6. 亮藍(lán) 7. 赤蘚紅

由圖3可知,在優(yōu)化后的條件下,7種合成著色劑在10 min內(nèi)可完全分離,由于流動相比例變化大,從10 min后恢復(fù)初始流動相比例,維持至18 min,各物質(zhì)保留時間重復(fù)性良好。

2.2.2 波長的優(yōu)化 目前國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法多采用254 nm檢測,但是在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)254 nm下亮藍(lán)響應(yīng)值極小[見圖3(a)],難以滿足檢測要求。利用二極管陣列檢測器對亮藍(lán)在200～800 nm進(jìn)行波長掃描,紫外光譜圖見圖4。

圖4 亮藍(lán)的紫外光譜圖

由圖4可知,亮藍(lán)的特征吸收波長有307,408,628 nm,其中628 nm處響應(yīng)值遠(yuǎn)大于254 nm處。圖3(b)為628 nm下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖,亮藍(lán)的峰面積由24.8(254 nm)提升至5 596.4(628 nm),增幅超過220倍,同時在628 nm下基線更穩(wěn)定,雜質(zhì)干擾更少,這可能是亮藍(lán)在628 nm下發(fā)生帶邊躍遷導(dǎo)致的。故利用二極管陣列檢測器同時采集254,628 nm處信號。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性 取同一5 mg/kg加標(biāo)樣品提取液,于0,2,4,6,8,12,24 h進(jìn)樣,計算檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),分別為0.64%,0.85%,0.97%,0.83%,1.03%,0.41%,0.47%?？梢?種合成著色劑在24 h內(nèi)非常穩(wěn)定。

2.3.2 線性參數(shù)和檢出限、定量限 按1.3的方法配制0.5,1.0,5.0,10,20,50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按1.5的色譜條件進(jìn)行測定,得到各物質(zhì)的線性參數(shù)。

測定實(shí)際加標(biāo)樣品的噪音值和各物質(zhì)的信號值,并結(jié)合取樣量,提取分離過程,將檢出限和定量限換算成樣品中的質(zhì)量濃度。其中檢出限以3倍信噪比計算,定量限以10倍信噪比計算。如表4所示,7種合成著色劑在0.5～50.0 μg/mL范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9。檢出限為0.023～0.179 mg/kg,定量限為0.078～0.598 mg/kg,均低于GB 5009.35—2016中檢出限和定量限。

2.3.3 回收率及重復(fù)性 結(jié)合各物質(zhì)的測定低限、限量指標(biāo)以及實(shí)際樣品中的含量,對現(xiàn)制飲料空白樣品進(jìn)行4個濃度的加標(biāo)試驗(yàn),每個濃度平行6次試驗(yàn)。如表5所示,7種合成著色劑回收率為92.4%～96.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～4.2%。該方法回收率和重復(fù)性均較好,適合于現(xiàn)制飲料中7種合成著色劑的測定。

表5 回收率及重復(fù)性結(jié)果

2.4 實(shí)際樣品測定

在江蘇無錫校園周邊的奶茶店、飲料鋪等采集現(xiàn)制飲料54件,其中29件檢出上述合成著色劑,陽性樣品測定結(jié)果見表6。由表6可見檢出的合成著色劑有檸檬黃、新紅、胭脂紅和日落黃,含量為0.33～56.93 mg/kg,均未超過GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》所規(guī)定的限量。其中日落黃的檢出率最高(50.0%),其次為胭脂紅(9.3%)。從實(shí)際檢測結(jié)果來看,不同產(chǎn)品中合成著色劑的種類和含量均存在顯著差異。這可能是現(xiàn)制飲料中的合成著色劑引入方式不明,可能由制作者人為添加或原料引入,且制作過程中主觀性強(qiáng),疏于質(zhì)量控制。因此,加強(qiáng)現(xiàn)制飲料的安全監(jiān)管是必要的。

表6 陽性樣品測定結(jié)果?

圖5為陽性樣品色譜圖,可見該方法凈化效果較好,合成著色劑色譜峰未受到雜質(zhì)干擾。

1. 檸檬黃 2. 胭脂紅 3. 日落黃

3 結(jié)論

研究建立了全自動固相萃取結(jié)合高效液相色譜雙波長法測定現(xiàn)制飲料中7種常見合成著色劑的分析方法。該方法結(jié)合自動固相萃取儀,優(yōu)化樣品前處理方法,操作簡單快速,可實(shí)現(xiàn)批量化檢測,顯著提高檢驗(yàn)檢測效率;進(jìn)一步采用雙波長法,顯著提高了亮藍(lán)的檢測靈敏度和抗干擾性,應(yīng)用于實(shí)際樣品的測定中,回收率和重復(fù)性結(jié)果均達(dá)到滿意。在江蘇無錫校園周邊采集的54份現(xiàn)制飲料中,有29件檢出上述合成著色劑,不同樣品中合成著色劑的種類和含量均存在顯著差異,可能是現(xiàn)制飲料中合成著色劑的引入方式不明,且制作過程主觀性強(qiáng)。因此,加強(qiáng)現(xiàn)制飲料的安全監(jiān)管是非常必要的。