液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中4種喹諾酮類藥物殘留量的不確定度評定

楊 韻

曹 陽1,2

李 菁1,2

鐘菲菲1,2

左 賀3

(1. 長沙市食品藥品檢驗所,湖南 長沙 410036;2. 湖南酒類產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心〔湖南〕,湖南 長沙 410036;3. 湖南勞動人事職業(yè)學(xué)院,湖南 長沙 410100)

中國有著悠久的養(yǎng)蜂史,是全球蜂蜜生產(chǎn)、貿(mào)易大國,產(chǎn)量和出口量均居世界首位[1]。隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)向規(guī)模化、集約化發(fā)展,蜂蜜中檢出獸藥的情況時有發(fā)生。2002年歐盟以抗生素(氯霉素)殘留超標(biāo)為由,全面禁止中國蜂蜜進入歐盟市場,因此,抗生素殘留控制已成為食品安全工作中的重要一環(huán),其檢測技術(shù)也是食品安全研究領(lǐng)域亟待解決的課題[2-3]。

喹諾酮類藥物是一種人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的類抗菌藥物,主要是將拓撲異構(gòu)酶與細菌DNA螺旋酶作為靶點,抑制DNA回旋酶促進DNA復(fù)制,對細菌DNA造成不可逆損傷以發(fā)揮抗菌效果,對多種革蘭氏陰性菌的殺菌效果明顯[4-6]。喹諾酮類藥物具有抗菌活性強、抗菌譜廣泛、不良反應(yīng)少、體內(nèi)分布良好等多重優(yōu)勢,被廣泛應(yīng)用于人和動物的疾病治療[7]。腐臭病、敗血病等細菌性疾病會嚴(yán)重影響蜜蜂產(chǎn)蜜的產(chǎn)量和質(zhì)量,為了蜜蜂的健康,蜂農(nóng)會使用喹諾酮類藥物為蜜蜂“治病”,若產(chǎn)生抗藥性,則會加大用藥劑量,從而造成蜂蜜的藥物殘留[8]。研究[9]表明,長期食用含喹諾酮類藥物殘留的蜂蜜會導(dǎo)致人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)問題,嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)肌無力的狀況,并且還有一定的致癌性。

不確定度是以測量結(jié)果本身為研究對象,由于隨機影響和系統(tǒng)影響的存在而對測量結(jié)果不能肯定的程度,只要是測量數(shù)據(jù),都不可避免地存在不確定度,是客觀存在的影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確的因素[10-12]。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,可以通過不確定度的評定來判定試驗結(jié)果的質(zhì)量,因此不確定度也是測量結(jié)果的一部分,同時是評價測量活動質(zhì)量的重要指標(biāo),是衡量檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要參數(shù)[13-14]。研究擬依據(jù)GB 31657.2—2021對蜂蜜進行檢測,并參照現(xiàn)行有效的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及指南對蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留的檢測結(jié)果進行不確定度評定[15-17],分析檢測過程中各測量不確定度分量對結(jié)果的影響,找出需要重點關(guān)注的環(huán)節(jié),為實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜:抽檢樣品;

水:GB/T 6682規(guī)定的一級水;

甲醇、乙腈:色譜純,德國MERCK公司;

甲酸:色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

恩諾沙星(CAS No:93106-60-6)、鹽酸沙拉沙星(CAS No:91296-87-6)、氧氟沙星(CAS No:82419-36-1)、環(huán)丙沙星(CAS No:85721-33-1):北京曼哈格生物科技有限公司;

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀:Triple Quad 5500+型,美國AB SCIEX公司;

固相萃取柱:Oasis PRiME HLB型,200 mg/6 mL,美國Waters公司;

分析天平:XS205DU型,德國Mettler toledo公司;

高速冷凍離心機:X1R型,賽默飛世爾科技有限公司;

氮吹儀:N-EVAP45型,美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密稱取恩諾沙星0.010 08 g、鹽酸沙拉沙星0.011 26 g、氧氟沙星0.010 13 g、環(huán)丙沙星0.010 35 g,用0.5 mL氨水溶解,并用甲醇定容至10 mL容量瓶,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;用移液管準(zhǔn)確量取0.1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液;分別準(zhǔn)確吸取0.10,0.20,0.50,1.00,2.00,5.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于100 mL容量瓶中,用20%乙腈—甲酸水溶液(20 mL乙腈中加入80 mL 0.1%甲酸溶液)定容,配制成質(zhì)量濃度分別為1,2,5,10,20,50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液,各取1.00 mL,分別加入經(jīng)提取、凈化處理的空白試料中,溶解殘余物,上清液過微孔尼龍濾膜后,上機測定。

1.3.2 樣品前處理

(1) 提取:稱取2.024 3 g蜂蜜樣品于50 mL聚丙烯離心管中,加入磷酸鹽緩沖液20 mL,渦旋1 min,振蕩10 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液備用。

(2) 凈化:固相萃取柱分別用10 mL甲醇、10 mL水活化,將備用上清液過柱,用5 mL水淋洗,抽干后依次用4 mL 5%的甲酸—甲醇和4 mL乙酸乙酯洗脫,抽干后收集洗脫液,40 ℃氮氣吹干。用1.00 mL 20%乙腈—甲酸水溶液溶解殘余物,超聲1 min后渦旋混勻,上清液過尼龍濾膜,待測。

1.3.3 液相色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18,2.1 mm×100 mm,1.8 μm;柱溫35 ℃;進樣量10 μL;流速0.3 mL/min;流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇;按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

1.3.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓(IS)5 000 V;離子源溫度(TEM)500 ℃;霧化氣壓力(GS1)379 kPa;霧化氣壓力(GS2)379 kPa;氣簾氣壓力(CUR)207 kPa;碰撞器(CDA)62 kPa,質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測模式下6種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3.5 數(shù)學(xué)模型建立 按式(1)建立數(shù)學(xué)模型。

(1)

式中:

X——樣品中相應(yīng)的喹諾酮類藥物殘留量,μg/kg;

Cs——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的喹諾酮類藥物質(zhì)量濃度,ng/mL;

As——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的喹諾酮類藥物峰面積;

A——樣品溶液中相應(yīng)的喹諾酮類藥物峰面積;

V——溶解殘余物溶液體積,mL;

m——樣品質(zhì)量,g。

1.3.6 不確定度分量的主要來源分析 根據(jù)試驗步驟和數(shù)學(xué)模型進行分析,影響樣品中喹諾酮類藥物殘留量的測量不確定度主要有:標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度;樣品稱樣量引入的不確定度;樣品定容體積引入的不確定度;測量重復(fù)性引入的不確定度;加標(biāo)回收引入的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程引入的不確定度urel(C)

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Cp)

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Cw)

2.1.4 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Cs) 配制質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液需要用到1支1 mL A級分度吸量管,1個100 mL A級單標(biāo)線容量瓶。取均勻分布,量具及溫度波動引入的不確定度見表3。

表3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液制備過程引入的不確定度

因此,由混合標(biāo)準(zhǔn)中間液制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

(1)

表4 吸量管引入的不確定度

綜上,標(biāo)準(zhǔn)系列工作液制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

(2)

計算得:urel(C恩)=0.071 21;urel(C沙)=0.071 37;urel(C氧)=0.071 22;urel(C環(huán))=0.071 22。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(F)

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液6個濃度,每個濃度測定3次,用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液各質(zhì)量濃度與峰面積,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得到的線性回歸方程見表5。被測樣品重復(fù)測定6次,分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線上擬合得到喹諾酮類藥物殘留量見表6。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表6 樣品重復(fù)測定數(shù)據(jù)

按式(3)、式(4)計算標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(3)

(4)

式中:

urel(F)——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度;

S——標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比殘差的標(biāo)準(zhǔn)差;

c0——由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得到的樣品中喹諾酮類藥物殘留量的平均質(zhì)量濃度,ng/mL;

a——線性回歸方程的斜率;

P——樣品重復(fù)測定次數(shù),P=6;

m——標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度個數(shù),m=6;

n——標(biāo)準(zhǔn)曲線每個濃度溶液測定次數(shù),n=3;

ci——第i個由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度,ng/mL;

Aj——第j個標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積;

cj——第j個標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制質(zhì)量濃度,ng/mL;

b——線性回歸方程的截距。

將各值代入式(4)得:S恩=37 163.680 38,S沙=16 132.613 53,S氧=110 103.370 46,S環(huán)=96 300.170 38;urel(F恩)=0.034 86,urel(F沙)=0.014 74,urel(F氧)=0.032 26,urel(F環(huán))=0.012 58。

2.3 樣品稱樣量引入的不確定度urel(M)

2.4 樣品定容體積引入的不確定度urel(V)

2.5 測量重復(fù)性引入的不確定度urel(R)

在空白蜂蜜樣品中分別添加質(zhì)量濃度為5,10,8,15 μg/kg的恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星,從樣品稱量開始重復(fù)測定6次(n=6),測量結(jié)果見表6。用貝塞爾公式(5)～式(7)計算測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(5)

(6)

(7)

計算得:urel(R恩)=0.012 38,urel(R沙)=0.023 12,urel(R氧)=0.015 76,urel(R環(huán))=0.018 39。

2.6 加標(biāo)回收引入的不確定度urel(A)

取6份空白樣品,在恩諾沙星5 μg/kg、沙拉沙星10 μg/kg、氧氟沙星8 μg/kg、環(huán)丙沙星15 μg/kg質(zhì)量濃度下進行加標(biāo)回收,樣品回收率見表7。

表7 樣品回收率

計算得:urel(A恩)=0.010 18,urel(A沙)=0.015 20,urel(A氧)=0.009 90,urel(A環(huán))=0.006 56。

3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度與擴展不確定度

根據(jù)各不確定度分量得,相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

urel沙=0.078 09;urel氧=0.080 50;urel環(huán)=0.075 05。

根據(jù)RB/T 030—2020,以恩諾沙星為例,當(dāng)恩諾沙星含量為4.97 μg/kg時,其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u恩=4.97×0.081 02=0.403 μg/kg,擴展不確定度U恩=u恩×k=0.403×2=0.81 μg/kg。則u沙=0.791 μg/kg,U沙=1.58 μg/kg;u氧=0.617 μg/kg,U氧=1.23 μg/kg;u環(huán)=1.123 μg/kg,U環(huán)=2.25 μg/kg(取包含因子k=2,置信水平P=95%)。

4 測量結(jié)果及其不確定度報告

采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留量,恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星的測量不確定度結(jié)果分別表示為:X恩=(4.97±0.81) μg/kg;X沙=(10.13±1.58) μg/kg;X氧=(7.67±1.23) μg/kg;X環(huán)=(14.97±2.25) μg/kg。

5 結(jié)論

研究采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留量進行了測定,通過建立數(shù)學(xué)模型對試驗過程中引入的不確定度各分量進行了評定。結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對試驗的不確定度結(jié)果貢獻最大且不容忽視,其次是樣品重復(fù)性測定和加標(biāo)回收。因此,在測定蜂蜜中喹諾酮藥物殘留量的實際工作中,要確保標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及稀釋精準(zhǔn),選擇精密度高的移液器和容量瓶,增加標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品的測量次數(shù),多做平行測定,提高檢驗操作技術(shù),定期維護保養(yǎng)測量儀器,從而降低操作過程中各不確定度分量對檢測結(jié)果的影響,提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

方法GB 31657.2—2021包含了14種喹諾酮藥物,試驗只選取了其中4種較常見、易檢出、具有一定代表性的藥物,其中,2021年國家食品安全監(jiān)督抽查計劃將氧氟沙星列為蜂產(chǎn)品的風(fēng)險監(jiān)測項目。但該研究未考慮方法中其余10種藥物的不確定度,加標(biāo)濃度相對隨機,且未考慮檢測儀器對試驗結(jié)果帶來的影響,對實際工作的指導(dǎo)仍然存在一定的局限性。因此,在日常檢測工作中應(yīng)該以檢出結(jié)果為目標(biāo),綜合全面考慮不確定度來源,才能使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確、科學(xué)、規(guī)范。