網(wǎng)絡藥理學結(jié)合分子對接技術(shù)揭示芹菜籽抑制痛風的潛在分子機制

李鎂娟

張 軍2

張云數(shù)2

李乾偉2

張 娜2

劉夢嬌2

張人平2

(1. 河南國德標檢測技術(shù)有限公司,河南 鄭州 451100;2. 鄭州工程技術(shù)學院化學與食品工程學院,河南 鄭州 450044)

近年來,隨著物質(zhì)生活水平的日益提高和生活方式的改變等因素的影響,代謝性疾病已經(jīng)成為全球亞健康狀態(tài)的主要原因[1]。代謝性疾病是指因生物體自身代謝引起的疾病,包括代謝減少或合成旺盛等,包括糖尿病、血糖紊亂癥、高尿酸癥等[2],高尿酸癥已成為繼高血糖、高血壓、高血脂后的“第四高”[3]。高尿酸癥可以引起高血壓[4]和一系列血管疾病[5],更是痛風形成的直接誘因[6]。痛風是人體嘌呤合成代謝增加,尿酸產(chǎn)生過多或排泄不暢而致血中尿酸濃度升高,尿酸鹽呈針狀結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)滑膜、腎臟及其他組織中引起的一種代謝炎性疾病[7]。痛風在一般人群中的患病率為1%～4%,男性比女性患病風險多2～6倍,全球痛風發(fā)病率仍有增加之勢[8]。痛風常用藥物秋水仙堿、別嘌呤醇、非布司他等都有一定的副作用而不能長期使用[9]。因此,尋找無副作用的藥物,或開發(fā)新的治療方法成為解決痛風等代謝性疾病的關(guān)鍵。

Downer等[10]認為,代謝引起的疾病最好用飲食方法來解決,即“食品就是藥品”。中國自古就有“藥食同源”之說,用食物治療或減輕疾病是中國中醫(yī)藥最偉大的思想之一[11-12]。芹菜(ApiumgraveolensL.)是二年或多年生草本類植物,香氣濃郁,是深受消費者喜愛的菜蔬之一,自古就有芹菜籽(種子)作為調(diào)料食用或中藥使用。實踐[13-15]表明,芹菜籽對抑制痛風的發(fā)生,緩解癥狀有一定效果,但芹菜籽對痛風的抑制機理仍不清晰。

隨著生物信息學和系統(tǒng)生物學的快速發(fā)展,網(wǎng)絡藥理學方法已被完美地用于尋找關(guān)鍵靶點及其潛在的分子機制[16]。基于“藥物—疾病—靶點”相互作用網(wǎng)絡的網(wǎng)絡藥理學,全面、系統(tǒng)地評價藥物對疾病的干預效果,符合中醫(yī)學的特點;分子對接是一種重要的計算機輔助藥物發(fā)現(xiàn)方法,可用于預測藥物成分與靶蛋白之間的相互作用,以及藥物可能的結(jié)合位點[17],這為藥物發(fā)現(xiàn)或疾病治療機理提供了重要思路和方法。研究使用網(wǎng)絡藥理學預測芹菜籽治療痛風的潛在機理、用分子對接技術(shù)驗證分子機制,為治療或預防痛風開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芹菜籽關(guān)鍵成分篩選及靶點基因提取

從已有能查到文獻[14-15,18-19]中篩選芹菜籽的成分共計74種,再使用化源網(wǎng)(https://www.chemsrc.com)查詢其CAS號,使用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫(https://www.tcmsp-e.com,TCMSP)以查找CAS號的方式來查找芹菜籽的關(guān)鍵成分,并且以類藥性(DL)≥0.10,口服生物利用度(OB)≥20%為篩選條件,篩選出具有藥物性質(zhì)且人類腸道易于吸收的成分,經(jīng)由TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得芹菜籽核心活性分子作用靶點;借助UniProt資料庫(http://www.uniprot.org)查詢并確立相應靶蛋白歸屬的規(guī)范化基因名,經(jīng)過去除冗余后,精準鎖定芹菜籽主要成分的靶向基因。

1.2 痛風疾病相關(guān)靶點的搜集

檢索孟德爾人類遺傳學數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/,OMIM)和人類基因數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org,GeneCards),搜索“gout”,刪除重復項,獲得痛風疾病所有的靶點基因。將芹菜籽的關(guān)鍵成分的靶點基因與痛風疾病的靶點基因?qū)雋ttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/網(wǎng)站繪制韋恩圖,獲得芹菜籽與痛風的交集靶點基因以及數(shù)量。

1.3 芹菜籽活性成分—痛風靶點網(wǎng)絡構(gòu)建及可視化分析

通過Cytoscape 3.9.0軟件收集芹菜籽活性物質(zhì)與痛風相關(guān)基因的數(shù)據(jù),構(gòu)筑了一幅涵蓋“分子—疾病靶點”復雜網(wǎng)絡圖。隨后,運用該軟件的Network Analyzer工具,對圖中的多個節(jié)點進行了精確的拓撲屬性評估。特別關(guān)注的是節(jié)點的中介中心性(BC)、緊密中心性(CC)以及度中心性(DC)三項指標。它們的平均值超過特定閾值的節(jié)點,即為在芹菜籽對痛風治療中發(fā)揮核心作用的關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(PPI網(wǎng)絡)的構(gòu)建

輸入芹菜籽與痛風相關(guān)基因的交互數(shù)據(jù),轉(zhuǎn)至String數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org),選擇“Multiple proteins”作為搜索維度,將種屬鎖定為“Homo sapiens”,并設定置信度閾值不低于0.9。為清晰可視化,屏蔽掉所有斷裂節(jié)點,之后將信息以tsv格式導出。并將該文件納入Cytoscape 3.9.0軟件中,借助CytoNCA插件進行深入的網(wǎng)絡拓撲分析。通過綜合比較6個核心參數(shù)——中介中心性、緊密中心性、度中心性、特征向量中心性(EC)、局部邊連通性(LAC)以及網(wǎng)絡中心性(NC)的平均值,從中篩選出具有代表性的網(wǎng)絡關(guān)鍵節(jié)點,即為核心靶向基因。

1.5 GO功能和 KEGG通路富集分析

采用 DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),對芹菜籽潛在治療痛風靶點進行GO功能分析,以了解靶點的生物學過程,KEGG通路分析研究藥物靶點主要信號通路,DAVID平臺列表與背景均設置為“Homo sapiens”,GO富集分析選擇生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cellular component,CC)3個模塊,通路分析選擇KEGG。將GO分析的BP、CC、MF通路分析的數(shù)據(jù)下載保存好,然后按照P值從小到大排序,KEGG通路富集分析靶點信號通路,以P<0.05為閾值,依據(jù)count值進行排序。再選取前20條信號通路對BP、CC、MF和KEGG通路分析的重要通路,使用微生信在線網(wǎng)(http://www.bioinformatics.com.cn/)作帶顏色富集條形圖進行可視化分析。

1.6 分子對接過程

利用軟件Chemdraw畫出篩選的芹菜籽成分的2D結(jié)構(gòu),再使用Chem3D軟件將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu),優(yōu)化力學結(jié)構(gòu),使其結(jié)構(gòu)處于穩(wěn)定狀態(tài),從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中提取針對痛風疾病相關(guān)的靶蛋白的三維構(gòu)象文件。通過PyMOL軟件的精確操作,排除了水分子及非必要的小分子配體,僅留下純凈的受體蛋白結(jié)構(gòu)并保存為標準的.pdb文件。隨后,借助AutoDock 1.2.0軟件對該蛋白受體進行精細化處理,包括加氫和調(diào)整分子的柔韌性。同時,對小分子配體也執(zhí)行了加氫處理,并精確識別了配體的活性中心。經(jīng)過一系列的預處理后,將蛋白受體與配體統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為.pdbqt格式,并利用Grid模塊仔細設定對接盒子的參數(shù),力求將其體積最小化以精準覆蓋蛋白結(jié)構(gòu),確?？臻g定位的高效率和精確性。參數(shù)設置完畢后,保存配置,并運用AutoDock軟件進行配體與受體的分子對接工作,從而計算出結(jié)合能(BE)的分值。此過程不僅體現(xiàn)了對分子生物學深刻的理解,也展現(xiàn)了計算化學在藥物設計中的實際應用。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜籽關(guān)鍵成分的篩選結(jié)果

芹菜籽主要活性成分為黃酮化合物、烯萜類成分等。利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)檢索到芹菜籽主要活性成分除洋川芎內(nèi)酯-N、洋川芎內(nèi)酯-J、木栓酮、佛手苷內(nèi)酯、β-芹子烯外均有對應靶點,總計375個,刪除重復項,相關(guān)主要活性成分16種,對應202個活性成分靶點。芹菜籽主要活性成分信息見表1。

表1 芹菜籽的活性成分

由于TCMSP篩選有效成分多依據(jù)DL和OB,設置較高會使本來有效果的成分無法進行全面分析,因此,將OB≥20%,DL≥0.10[20],所得有效成分16種。

2.2 “芹菜籽成分—痛風靶點”篩選

通過GeneCards共獲得芹菜籽核心成分的靶點基因共202個;使用OMIM database篩選痛風對應的靶點基因,刪除重復項后共1 732個。其中芹菜籽與痛風疾病交集靶點基因合計69個,見圖1。

圖1 芹菜籽藥效成分靶點與痛風相關(guān)靶點的韋恩圖

2.3 “芹菜籽成分—痛風靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建及可視化分析

利用Cytoscape 3.9.0軟件建立藥物——活性成分—靶點—疾病的可視化網(wǎng)絡圖,再利用Cytoscape 3.9.0軟件的Analyze Network功能,對交集靶點基因進行評分(0～1分有38個基因,為一類評分;2～3分有22個基因,為二類評分;4～8分有9個基因,為三類評分),一類基因在最外層,二類基因放在第二層,三類基因放在最內(nèi)層。在建立芹菜籽核心成分與痛風疾病的網(wǎng)絡圖時,發(fā)現(xiàn)芹菜籽有5個成分所對應的靶點基因與痛風疾病靶點基因沒有聯(lián)系,即這5個成分對治療痛風疾病并沒有效果,因此在繪制網(wǎng)絡圖時不納入。通過評分得到10種關(guān)鍵成分,“芹菜籽成分—痛風靶點”網(wǎng)絡詳見圖2。成分節(jié)點的大小表示與其相關(guān)的靶點基因數(shù)量多少,藍色菱形越大表示與之相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量越多,在網(wǎng)絡中作用也就越明顯。

菱形代表芹菜籽的關(guān)鍵成分,橢圓形代表“芹菜籽—痛風”交集靶點基因

使用Cytoscape 3.9.0軟件的Network Analyer插件對上述網(wǎng)絡中的藍色藥物節(jié)點進行拓撲分析得出,芹菜籽核心靶點網(wǎng)絡節(jié)點平均BC值為0.217 5,平均CC值為0.456 7,平均DC值為13.6。其中只有槲皮素1種成分的BC值、CC值、DC值均大于芹菜籽核心靶點網(wǎng)絡節(jié)點平均值(槲皮素BC 0.723 814 1,CC 0.685 185 19,DC 63),推測其可能是芹菜籽治療痛風的重要成分。

2.4 PPI網(wǎng)絡結(jié)果分析

將芹菜籽與痛風的交集基因?qū)隨tring在線平臺對69個潛在靶點進行PPI蛋白互作網(wǎng)絡分析。如圖3所示,網(wǎng)絡中包含69個節(jié)點,115條邊,平均節(jié)點度為3.33,平均局部聚類系數(shù)0.475。

圖3 PPI網(wǎng)絡與關(guān)鍵靶點

靶點連接的線越多,表明該靶點DC值越高,越是關(guān)鍵靶點,按照DC值≥10篩選條件[21],獲得10個核心靶點基因,分別為絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、血小板衍生的生長因子受體β(PDGFRβ)、酪氨酸蛋白激酶(LYN)、白細胞介素-4(IL4)、酪氨酸蛋白激酶HCK(HCK)、白細胞介素-8(CXCL8)、整合素αV(ITGAV)、白細胞介素-2(IL2),以上10種靶點基因拓撲參數(shù) BC、CC、DC、EC、LAC、NC皆大于各自均值121.033 02,0.148 69,7.392 86,0.085 02,2.216 19,3.122 07,詳見表2。

表2 核心靶點基因拓撲參數(shù)

通過建立芹菜籽成分—痛風基因靶點網(wǎng)絡,發(fā)現(xiàn)10個藥物成分中,有5個成分與核心基因靶點密切相關(guān),推測這5個藥物成分是治療痛風疾病的關(guān)鍵成分,即核心成分:槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素、芹菜甲素,在網(wǎng)絡中DC值分別是63,28,25,7,5,詳細情況見圖4。

圖4 芹菜籽核心成分—痛風關(guān)鍵基因靶點網(wǎng)絡

2.5 分子對接驗證分析

將2.4得到的5個核心成分為配體與痛風關(guān)鍵基因TNF、MAPK14、IL4、CXCL8、LYN、PDGFRB、HCK、VEGFA、ITGA、IL2為受體進行分子對接進行驗證。對接RMSD<0.2 nm,分子對接結(jié)合能見表3。如果分子對接結(jié)合能<0 kJ/mol時,表明小分子配體可以與蛋白受體結(jié)合;結(jié)合能<-17.7 kJ/mol,表明可以自發(fā)地結(jié)合;結(jié)合能<-29.3 kJ/mol,說明分子間具有很強的結(jié)合活性[22-23]。結(jié)合能越小,說明配體與蛋白之間親和力越大,兩者發(fā)生相互作用的可能性越高,進而發(fā)揮作用越大[24]。

表3 核心成分與靶點基因蛋白的分子對接結(jié)合能

由表3中數(shù)據(jù)可知,5個核心成分與痛風關(guān)鍵基因平均結(jié)合能<-17.7 kJ/mol,表明活性成分與核心靶點之間可以自由結(jié)合,槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素與關(guān)鍵基因平均結(jié)合能<-29.3 kJ/mol,表明其與核心靶點之間有強烈的結(jié)合力。因此,認為分子對接預測結(jié)果真實可靠,PyMol軟件可以對每個小分子配體與疾病靶點蛋白結(jié)合能最低的分子對接結(jié)果進行可視化調(diào)節(jié),如圖5所示。

圖5 分子對接模式圖

由對接結(jié)果可知氫鍵是促進芹菜籽主要成分和與痛風關(guān)鍵基因活性位點結(jié)合的主要作用力。即槲皮素-HCK結(jié)合的活性位點ALA-293、THR-338、MET-341形成3個氫鍵;芹菜素-HCK編碼蛋白的活性位點THR-338、MET-341形成2個氫鍵;木犀草素-ITGAV的活性位點VAL-23、VAL-98、ARG-99、PHE-278、TYR-406形成5個氫鍵;柯伊利素-LYN的活性位點ASP-156、ILE-86、LYS-44、MET-91、GLU-89 形成5個氫鍵;芹菜甲素-HCK的活性位點THR-338形成1個氫鍵。從對接結(jié)果來看,配體—受體形成氫鍵越多,復合體系越穩(wěn)定,對蛋白質(zhì)的活性控制能力就越強[25-26]。因此,木犀草素、柯伊利素對痛風的抑制效果較強。

2.6 GO功能富集和KEGG信號通路分析

將獲得的69個芹菜籽抗痛風的潛在靶點基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo Sapiens”,以P<0.05為篩選條件,進行GO功能富集和KEGG分析[27],結(jié)果如圖6所示。GO富集得到463個條目,其中BP 349個,CC 39個,MF 75個。BP主要是細胞凋亡過程的負調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、正向調(diào)控細胞增殖(positive regulation of cell proliferation)、細胞遷移的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell migration)等;CC主要是細胞外間隙(extracellular space)、胞外區(qū)(extracellular region)、細胞表面(cell surface)等;MF主要是酶結(jié)合(enzyme binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、蛋白質(zhì)同源二聚活性(protein homodimerization activity)等。

圖6 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析共得到1 225條目,以P<0.05為閾值,依據(jù)count值排序,選取前20條KEGG信號通路上的基因作為痛風治療靶基因。由于研究的是芹菜籽抗痛風作用,因此在得到的前20條通路中去掉與之無關(guān)的通路,得到PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、流體剪切應力和動脈粥樣硬化(fluid shearstress and atherosclerosis)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)等。按照打分排列前10的通路見表4。

表4 通過KEGG通路富集的前10條通路

3 結(jié)論

綜上所述,研究應用網(wǎng)絡藥理學方法預測了芹菜籽藥效成分及作用靶點,其中抑制或治療痛風關(guān)鍵成分為槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素和芹菜甲素,與痛風相關(guān)的靶點TNF、MAPK14、IL4、CXCL8、LYN、PDGFRβ、HCK、VEGFA、ITGA、IL2密切相關(guān)。使用分子對接技術(shù)將芹菜籽活性成分與關(guān)鍵靶點進行結(jié)合能力預測,發(fā)現(xiàn)槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素、芹菜甲素與10種蛋白均具有良好的結(jié)合活性,結(jié)合能均小于-20.97 kJ/mol,驗證了芹菜籽中多種有效成分通過作用于關(guān)鍵靶點起到防治痛風的作用,其中柯伊利素與10種關(guān)鍵靶點蛋白結(jié)合能最低,為-33.76 kJ/mol,表明具有強烈的結(jié)合活性。GO 功能富集分析表明芹菜籽具有調(diào)控細胞凋亡,影響炎癥反應的作用。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn),芹菜籽活性成分與痛風靶標之間相互作用的主要信號通路可能是PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路等,表明芹菜籽通過多條通路作用于痛風的調(diào)控過程。