石屏臭豆腐來(lái)源的高產(chǎn)蛋白酶菌株篩選及酶學(xué)特性研究

劉 超

趙良忠1,2

王瑤瓊1

李 明3

馮緒忠4

(1. 邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽(yáng) 422000;2. 豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 邵陽(yáng) 422000;3. 廣州佳明食品科技有限公司,廣東 廣州 511458;4. 深圳尚古堂食品發(fā)展有限公司,廣東 深圳 518000)

石屏臭豆腐為發(fā)酵型臭豆腐[1],在發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生多種有益化合物。例如,臭豆腐富含生物可利用的S-雌馬酚,有助于減少骨質(zhì)流失和緩解更年期癥狀;大豆中蛋白質(zhì)經(jīng)生物降解為更易吸收的多肽和氨基酸,如谷氨酸、噻唑氨酸、酪氨酸和色氨酸等,這些氨基酸富含生物活性,能夠維持人體氮元素平衡[2];發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的維生素B12對(duì)預(yù)防老年癡呆有一定作用[3]。發(fā)酵臭豆腐中分離的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制肽和γ-氨基丁酸有利于緩解高血壓,表面活性素、異拉奉、呋喃酮、胰蛋白酶抑制劑和3-羥基鄰氨基苯甲酸具有抗癌活性[4]。

發(fā)酵豆制品以細(xì)菌作為發(fā)酵劑,主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽葡萄球菌、植物乳桿菌、醬油片球菌、醬油四聯(lián)球菌[5],鮮見(jiàn)以金黃桿菌屬菌株發(fā)酵豆制品的報(bào)道。金黃桿菌屬是一類(lèi)自然界廣泛分布的細(xì)菌[6],主要從人體[7]、廢水[8]、垃圾處理廠[9]、土壤[10]中分離得到,是引起食品變質(zhì)腐敗的重要因素。研究發(fā)現(xiàn),金黃桿菌屬所產(chǎn)蛋白酶具有多種生理特性,如抑制革蘭氏陰性致病菌的增殖;促進(jìn)屠宰場(chǎng)或家禽養(yǎng)殖場(chǎng)的羽毛廢棄物利用[11];可將農(nóng)用廢棄物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇[12]等。

石屏臭豆腐生產(chǎn)采用自然接種發(fā)酵工藝,即利用環(huán)境中存在的微生物進(jìn)行接種發(fā)酵,這導(dǎo)致石屏臭豆腐發(fā)酵過(guò)程周期長(zhǎng),微生物種類(lèi)不易控制,產(chǎn)品常因雜菌污染而變質(zhì),貯藏時(shí)間短[13]。研究擬從石屏臭豆腐中篩選高產(chǎn)蛋白酶優(yōu)勢(shì)菌株,探究其發(fā)酵條件及相關(guān)酶學(xué)特性,以期利用石屏臭豆腐高產(chǎn)蛋白酶優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)酵提供臭豆腐生產(chǎn)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

石屏臭豆腐:采于云南省紅河哈尼族彝族自治區(qū)州石屏縣豆腐園區(qū)5個(gè)工廠,每個(gè)工廠隨機(jī)無(wú)菌采取3份樣品,液氮速凍處理,-40 ℃貯藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

豆?jié){分離培養(yǎng)基:將黃豆與水按V水∶m黃豆=1∶8 (mL/g)制成豆?jié){,再稀釋3倍制成豆?jié){培養(yǎng)基,瓊脂1.5%;

腦花分離培養(yǎng)基:將黃豆與水按V水∶m黃豆=1∶8 (mL/g)制成豆?jié){,用酸漿點(diǎn)至成腦花后用豆?jié){機(jī)磨碎再用水稀釋4倍,制成腦花培養(yǎng)基,瓊脂1.5%;

初篩選培養(yǎng)基:大豆分離蛋白1.0%,瓊脂1.5%;

種子培養(yǎng)基:酪蛋白1.0%、酵母膏1.0%、葡萄糖1.0%、NaCl 0.5%、瓊脂1.5%、pH 7.0～7.5;

發(fā)酵培養(yǎng)基:酪蛋白1.0%、葡萄糖1.0%、NaCl 0.5%,pH 7.0～7.5;

培養(yǎng)基滅菌條件:121 ℃、15 min。

1.1.3 主要試劑和儀器

大豆分離蛋白:BR級(jí),上海源葉生物科技有限公司;

福林酚試劑:BR級(jí),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

瓊脂:福建眾邦海洋生物科技有限公司;

無(wú)水碳酸鈉:AR級(jí),天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;

三氯乙酸:AR級(jí),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

鹽酸、磷酸氫二鈉:AR級(jí),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

磷酸二氫鈉:AR級(jí),天津市大茂化學(xué)試劑廠;

氫氧化鈉:AR級(jí),成都金山化學(xué)試劑有限公司;

乳酸、乳酸鈉:AR級(jí),天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;

硼酸:AR級(jí),德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;

酪蛋白:上海希格瑪高技術(shù)有限公司;

L-酪氨酸:中國(guó)惠興生化試劑廠;

顯微鏡:BA210型,麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;

恒溫振蕩器:IS-AX型,蘇州捷美電子有限公司;

雙人單面凈化工作臺(tái):SW-CJ-2FD型,江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司;

電熱恒溫水浴鍋:DZKW-4型,北京中心偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司;

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):D-7型,南京菲勒儀器有限公司;

臺(tái)式高速離心機(jī):3H16RI型,湖南赫西儀器裝備有限公司;

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀:EL340型,美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選 在無(wú)菌條件下,切取石屏臭豆腐樣品表皮25.0 g,充分研磨后倒入裝有225 mL無(wú)菌生理鹽水的廣口錐形瓶中充分混勻。采用10倍稀釋法,最終選擇10-4,10-5,10-63個(gè)梯度的稀釋液0.5 mL均勻涂布于豆?jié){分離培養(yǎng)基和腦花分離培養(yǎng)基,每種濃度稀釋液重復(fù)3次,30 ℃培養(yǎng)48～96 h挑選單菌落純化培養(yǎng),多次劃線,直至獲得單一菌落。

將純化后的單菌落點(diǎn)接于初篩選培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)72 h,觀察菌落大小和菌落周?chē)馊Υ笮?以菌株水解大豆分離蛋白所形成的透明圈直徑D與菌落徑d之比值(D/d)為篩選依據(jù),選取D/d值較大的菌株進(jìn)一步復(fù)篩。

挑選初篩菌株接種發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,160 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h后取10 mL發(fā)酵液,10 000 r/min離心10 min,收集上清液,得到粗酶液。測(cè)定蛋白酶的活力,選取蛋白酶活力最高的菌株為試驗(yàn)的目的菌株。

1.2.2 蛋白酶活力測(cè)定 按GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》執(zhí)行。

1.2.3 菌株鑒定

(1) 菌落和個(gè)體形態(tài)學(xué)觀察:將菌株在初篩選培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),30 ℃培養(yǎng)72 h,形成肉眼可觀察到的菌落形狀、顏色、表面質(zhì)地等形態(tài)特征,制片染色,觀察顯微鏡下菌株的形態(tài)特征。

(2) 菌株生理生化鑒定:參考文獻(xiàn)[14]。

(3) 菌株分子生物學(xué)鑒定:斜面保存的菌株平板劃線得出菌株單菌落,細(xì)菌16S rRNA中最保守的序列設(shè)計(jì)引物,引物F:5′-AGAGITTGATCMTGGCTCAG-3′,引物R:5′-AAGGAGGTGWTCCARCC-3′,PCR反應(yīng)體系20 μL。熱循環(huán)參數(shù)94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,循環(huán)30次,72 ℃延伸10 min,取2 μL反應(yīng)液進(jìn)行10 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序所得16S rRNA基因序列結(jié)果與NCBI中blast比對(duì),運(yùn)用MEGA6軟件,Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 菌株生長(zhǎng)與產(chǎn)酶曲線繪制 以2%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng),每間隔4 h取發(fā)酵液10 mL,未接種的作為空白對(duì)照,檢測(cè)OD600 nm值,繪制菌株生長(zhǎng)曲線。每隔12 h取10 mL,檢測(cè)酶活,繪制不同生長(zhǎng)時(shí)間下粗酶液中蛋白酶活力與時(shí)間的關(guān)系曲線。

1.2.5 菌株JX-11發(fā)酵條件優(yōu)化

(1) 溫度:固定氮源蛋白胨添加量10 g/L,碳源葡萄糖添加量10 g/L,pH為7,金屬離子NaCl添加量5 g/L,考察溫度(20,25,30,35,40 ℃)對(duì)菌株JX-11產(chǎn)酶活力的影響。

(2) 碳源:固定氮源蛋白胨添加量10 g/L,pH為7,金屬離子NaCl添加量5 g/L,培養(yǎng)溫度30 ℃,考察碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、麥芽糖,10 g/L)對(duì)菌株JX-11產(chǎn)酶活力的影響,確定最適碳源后進(jìn)行最適碳源添加量(5,10,15,20,25 g/L)優(yōu)化。

(3) 氮源:固定碳源葡萄糖添加量10 g/L,pH為7,金屬離子NaCl添加量5 g/L,培養(yǎng)溫度30 ℃,考察氮源(蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、酪蛋白、尿素,10 g/L)對(duì)菌株JX-11產(chǎn)酶活力的影響,確定最適氮源后進(jìn)行最適氮源添加量(5,10,15,20,25 g/L)優(yōu)化。

(4) pH值:固定氮源蛋白胨添加量10 g/L,碳源葡萄糖添加量10 g/L,金屬離子NaCl添加量5 g/L,培養(yǎng)溫度30 ℃,考察pH(5,6,7,8,9,10,11)對(duì)菌株JX-11產(chǎn)酶活力的影響。

(5) 金屬離子:固定氮源蛋白胨添加量10 g/L,碳源葡萄糖添加量10 g/L,pH為7,培養(yǎng)溫度30 ℃,考察金屬離子(K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cu2+,10 g/L)對(duì)菌株JX-11產(chǎn)酶活力的影響,確定金屬離子后進(jìn)行最適金屬離子添加量(5,10,15,20,25 g/L)優(yōu)化。

1.2.6 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以培養(yǎng)溫度、葡萄糖、蛋白胨、pH為因素,酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.2.7 菌株JX-11蛋白酶酶學(xué)性質(zhì) 最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min,取上清液作為粗酶液,用于酶學(xué)性質(zhì)初步研究。

(1) 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性:固定反應(yīng)時(shí)間1 h,考察在不同反應(yīng)溫度(10,20,30,40,50,60 ℃)下,菌株JX-11的相對(duì)酶活力;固定粗酶液保溫時(shí)間1 h,將酶液置于上述溫度(10,20,30,40,50,60 ℃),考察在不同保溫溫度下,菌株JX-11的殘留酶活力。

(2) 最適反應(yīng)pH值及酸堿穩(wěn)定性:固定反應(yīng)時(shí)間1 h,考察在不同pH值緩沖液中[乳酸—乳酸鈉緩沖液(pH 3.0)、檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.0)、磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)、碳酸鈉—碳酸氫鈉緩沖溶液(pH 9.0)、硼酸—?dú)溲趸c緩沖液(pH 11.0)]菌株JX-11的相對(duì)酶活力;固定粗酶液保溫時(shí)間1 h,將酶液置于上述緩沖液(pH 3.0,5.0,7.0,9.0,11.0),考察在不同pH下,菌株JX-11的殘留酶活力。最高酶活為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力和殘留酶活力。

(3) 金屬離子及抑制劑對(duì)酶活性的影響:固定反應(yīng)時(shí)間1 h,考察不同金屬離子(Mg2+、K+、Na+、Ca2+、Mn2+、Cu2+,100 mmol/L)對(duì)菌株JX-11的相對(duì)酶活力。

(4) 有機(jī)化學(xué)試劑對(duì)JX-11菌株蛋白酶的影響:固定反應(yīng)時(shí)間1 h,考察不同有機(jī)試劑[吐溫80、乙醇、乙酸、丙酮、甘油、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲醇、十二烷基硫酸鈉(SDS),100 mmol/L]對(duì)菌株JX-11的相對(duì)酶活力。不加金屬離子、有機(jī)試劑的蛋白酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選

菌株在初篩平板透明圈效果見(jiàn)圖1,在大豆分離蛋白培養(yǎng)液中初篩結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)平板上菌落水解圈直徑及菌落直徑的比值(D/d)大小,篩選獲得酶活較強(qiáng)的菌株6株。由表1可知,編號(hào)為6的菌株D/d值最大(為2.91),但酶活力較低,僅有11.48 U/mL,初篩平板有一定的局限性。編號(hào)為4的菌株D/d值為1.94,蛋白酶酶活性最高,達(dá)23.25 U/mL,因此,選用該菌株進(jìn)行下一步研究,并將其命名為JX-11。

表1 石屏臭豆腐中產(chǎn)高蛋白酶活力菌株的初篩?

圖1 不同菌株大豆分離蛋白板水解圈照片

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株菌落形態(tài) 如圖2所示,JX-11菌落為圓形,邊緣呈鋸齒狀,表面水潤(rùn),顏色黃色,經(jīng)革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性桿菌。

圖2 JX-11菌落形態(tài)及革蘭氏染色圖

2.2.2 生理生化鑒定 由表2可知,JX-11菌株不適合高鹽環(huán)境,可以利用葡萄糖、麥芽糖、淀粉、甘露醇、甘油等碳源產(chǎn)酸。過(guò)氧化氫酶、氧化酶、明膠酶結(jié)果呈陽(yáng)性,其他試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

表2 JX-11菌株的生理生化特征表?

2.2.3 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)過(guò)基因組DNA的提取,以總DNA為模板,利用27F/1492R引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳后得到菌株約1 000 bp的16S rRNA基因條帶,結(jié)果見(jiàn)圖3。將菌株的16S rRNA基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)。發(fā)現(xiàn)JX-11菌株與彭尼普爾金黃桿菌(C.pennipullorum)的16S rRNA基因序列自然聚類(lèi),相似度為99.65%,與10條相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖4所示,JX-11菌株與彭尼普爾金黃桿菌(C.pennipullorum)strain7 F195菌株在同一分支上,表明JX-11菌株與彭尼普爾金黃桿菌(C.pennipullorum)的親緣關(guān)系最近。

M. Marker 1. 其他菌株 2. JX-11

圖4 JX-11依據(jù)16S rRNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株JX-11生長(zhǎng)與產(chǎn)酶情況

如圖5(a)所示,JX-11菌株在0～4 h時(shí)為生長(zhǎng)延滯期,該菌株對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)能力較弱,生長(zhǎng)緩慢;在4～8 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,該菌株潛伏期短,生長(zhǎng)迅速,對(duì)新鮮培養(yǎng)基的適應(yīng)能力強(qiáng)[15],32 h后菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期,可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少,生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的增加,導(dǎo)致菌株的生長(zhǎng)繁殖受到抑制,逐步進(jìn)入衰亡,菌落密度降低。如圖5(b)所示,JX-11菌株在0～36 h時(shí)處于生長(zhǎng)時(shí)期,產(chǎn)蛋白酶能力弱;36～48 h細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期,產(chǎn)蛋白酶能力增強(qiáng);JX-11菌株培養(yǎng)48 h后,培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少,細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制,代謝產(chǎn)物增加,蛋白酶活力降低。因此,選擇48 h作為JX-11菌株的最適發(fā)酵時(shí)間。

圖5 JX-11菌株生長(zhǎng)曲線及其產(chǎn)酶活力曲線

2.4 JX-11菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

如圖6(a)所示,JX-11菌株利用淀粉、乳糖、葡萄糖的活性在同一水平上,考慮到葡萄糖分子量,選擇葡萄糖為最適碳源,優(yōu)化添加量結(jié)果[圖6(b)]為10 g/L;JX-11菌株利用碳源廣泛,可以有效降解可溶性淀粉,如Wang等[16]從土壤中分離得到的C.taeanenseTKU001可以有效降解可溶性淀粉,得到最終產(chǎn)物葡萄糖和麥芽糖;Dahal等[17]從北極土壤中分離得到的C.antibioticumRP-3-3能夠水解CM-纖維素、酪蛋白、淀粉和DNA。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

以蛋白胨為氮源時(shí)蛋白酶活性最高,為(30.57±0.68) U/mL[圖6(c)],最適添加量為10 g/L[圖6(d)];且有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更有利于促進(jìn)該菌株蛋白酶的酶活,由此可以認(rèn)為,有機(jī)氮源能為該菌體的生長(zhǎng)提供更豐富的氨基酸、維生素和生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而促進(jìn)蛋白酶的產(chǎn)生。

溫度是催化蛋白酶活性和促進(jìn)菌株生長(zhǎng)發(fā)酵的重要因素之一,如圖6(e)所示,培養(yǎng)溫度為25 ℃的酶活力與20,30 ℃的有顯著性差異(P<0.05),培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)酶活最高,達(dá)(35.13±0.81) U/mL;當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)25 ℃時(shí),隨著溫度的增加,酶活力逐漸降低,過(guò)高的溫度(>30 ℃)會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶活力。因此,選擇最適培養(yǎng)溫度為25 ℃。

如圖6(f)所示,隨著pH的上升,酶活逐漸增加,在pH 6.0時(shí)酶活最高,為(36.25±0.84) U/mL;當(dāng)pH繼續(xù)上升時(shí),酶活逐漸降低。因此,選擇pH 6.0為最佳pH。

金屬離子對(duì)JX-11菌株產(chǎn)酶活力的影響在同一水平上[P>0.05,圖6(g)],選擇Na+作為最適金屬離子。進(jìn)一步優(yōu)化添加量結(jié)果顯示,不添加與添加0.5%的NaCl,JX-11菌株產(chǎn)酶活力無(wú)顯著性差異,低鹽度對(duì)JX-11菌株產(chǎn)酶活力無(wú)顯著促進(jìn)作用[P>0.05,圖6(h)];且隨著NaCl添加量的增加,JX-11菌株產(chǎn)酶活力降低。高濃度NaCl會(huì)抑制JX-11菌株所產(chǎn)蛋白酶的活力。JX-11菌株更適合在低鹽度下發(fā)酵產(chǎn)酶,與何小玉等[18]的研究結(jié)果一致。因此,不選擇金屬離子Na+為響應(yīng)面試驗(yàn)因素。

2.5 發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇溫度、葡萄糖添加量、蛋白胨添加量和pH 4個(gè)因素的水平值,以酶活力為響應(yīng)值,運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3,試驗(yàn)方案見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表4 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果

表5 回歸方程方差分析?

2.5.2 響應(yīng)面模型建立與方差分析 通過(guò)Design-Expert 11對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到酶活力與各因素的二次回歸方程:

Y=35.09-5.63A-1.50B+2.03C-0.043D-0.29AB-3.56AC-1.82AD-1.94BC-0.38BD-0.52CD-9.14A2-1.61B2+0.40C2-2.49D2。

(1)

由表3可知,模型P值<0.000 1,影響顯著;失擬項(xiàng)P=0.258 1,影響不顯著;R2=0.926 3,表明此回歸方程為回歸顯著型,與實(shí)際擬合程度較好。該回歸模型中,A、C對(duì)酶活力的影響達(dá)到極顯著效應(yīng)(P<0.01);AC對(duì)酶活力的影響達(dá)到顯著效應(yīng)(P<0.05),其他項(xiàng)對(duì)酶活力的影響不顯著(P>0.05)。從P值以及F值可以看出,4個(gè)因素對(duì)酶活力的影響顯著性大小依次為溫度>蛋白胨添加量>葡萄糖添加量>pH,溫度對(duì)JX-11菌株所產(chǎn)酶活力影響最大。

2.5.3 響應(yīng)面交互作用分析 由圖7可知,溫度與蛋白胨添加量的響應(yīng)面斜面較陡,交互作用較明顯,達(dá)到顯著水平(P<0.05);溫度對(duì)JX-11菌株所產(chǎn)酶活力的影響最大,葡萄糖添加量、蛋白胨添加量次之,pH的影響最小,與方差分析結(jié)果一致。

圖7 兩兩因素交互作用響應(yīng)面與等高線圖

2.5.4 響應(yīng)面結(jié)果及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件分析,預(yù)測(cè)出酶活力的最優(yōu)工藝為溫度22.66 ℃,葡萄糖添加量6.66 g/L,蛋白胨添加量14.98 g/L,pH 6.4,模型預(yù)測(cè)菌株JX-11酶活力為41.32 U/mL,調(diào)整工藝為溫度23.00 ℃,葡萄糖添加量6.70 g/L,蛋白胨添加量15.00 g/L,pH 6.4,測(cè)定酶活力為(39.16±3.24) U/mL,與預(yù)測(cè)值的偏差<5%,模型有效。

在優(yōu)化工藝條件下,JX-11菌株所產(chǎn)酶的活力已超過(guò)同屬的C.taeanenseTKU001 (0.14 U/mL)[19]、C.proteolyticum9670 (0.16 U/mL)[20]、C.indologenesTKU014 (0.47 U/mL)[21]和C.spkr6 (33.2 U/mL)[22]等菌株,為高產(chǎn)蛋白酶菌株。

2.6 JX-11菌株酶學(xué)性質(zhì)

2.6.1 溫度對(duì)JX-11菌株的蛋白酶反應(yīng)活性和穩(wěn)定性的影響 如圖8所示,JX-11菌株所產(chǎn)蛋白酶在10～40 ℃幾乎保持了原有酶活力,相對(duì)酶活力>66.90%;但隨著溫度上升,酶活迅速降低,超過(guò)60 ℃時(shí),殘留酶活僅剩4.14%,表明JX-11菌株所產(chǎn)蛋白酶對(duì)高溫敏感。當(dāng)溫度為10～30 ℃時(shí)蛋白酶能保持原有的活性,相對(duì)酶活力>50%;JX-11菌株蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃,但當(dāng)溫度高于30 ℃后,保溫1 h,蛋白酶活力迅速下降,溫度達(dá)到60 ℃時(shí)保溫1 h,相對(duì)酶活力為16.35%,推測(cè)蛋白酶在高溫下活性的急劇下降與蛋白酶結(jié)構(gòu)的變化和高溫下蛋白酶反應(yīng)體系中溶解氧的減少有關(guān)。JX-11菌株所產(chǎn)蛋白酶有較廣的適應(yīng)溫度,可以一定程度地適應(yīng)粗放型工業(yè)生產(chǎn)條件,其蛋白酶產(chǎn)酶能力使其在工業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

圖8 溫度對(duì)JX-11菌株所產(chǎn)蛋白酶活力的影響

2.6.2 pH對(duì)JX-11菌株的蛋白酶反應(yīng)活性和穩(wěn)定性的影響 如圖9所示,pH>5.0時(shí),相對(duì)酶活力快速增大,在pH 7.0時(shí)達(dá)到最大酶活力;pH在6.0～9.0時(shí)殘留酶活力為60%以上,有較好的穩(wěn)定性;當(dāng)pH>9.0,酶活性迅速下降,說(shuō)明該粗酶液對(duì)堿性環(huán)境較敏感,不適合在強(qiáng)堿性環(huán)境下進(jìn)行保存。反應(yīng)體系的pH值會(huì)影響酶與不同底物的結(jié)合狀態(tài),從而產(chǎn)生不同的催化效率。在pH 7.0～9.0范圍內(nèi)反應(yīng)1 h,相對(duì)酶活力>80%,最大酶活力pH為7.0,表明JX-11蛋白酶為中性蛋白酶,上清粗酶液對(duì)堿性環(huán)境較敏感,當(dāng)pH>9.0時(shí),酶活性迅速降低。因此,該酶在洗滌、制革、絲綢等行業(yè)具有較大的應(yīng)用潛力。

圖9 pH對(duì)JX-11菌株所產(chǎn)蛋白酶活力的影響

2.6.3 金屬離子對(duì)JX-11菌株蛋白酶活性的影響 如圖10所示,向蛋白酶粗酶液中加入金屬離子Zn2+、Cu2+、K+抑制該蛋白酶的活性,其中Zn2+抑制該蛋白酶的活性作用次之,相對(duì)酶活力72.92%,Cu2+抑制作用最強(qiáng),相對(duì)酶活力僅有43.52%;Mn2+對(duì)該蛋白酶酶活力有顯著促進(jìn)作用,對(duì)比空白,Mn2+對(duì)JX-11菌株所產(chǎn)酶活力促進(jìn)率達(dá)到433.42%;而Na+、Mg2+、Ca2+對(duì)JX-11蛋白酶活力影響不大。其中Mn2+對(duì)JX-11菌株所產(chǎn)酶的影響和其他文獻(xiàn)報(bào)道有差異,Deng等[23]發(fā)現(xiàn)Mn2+對(duì)芽孢桿菌屬蛋白酶起抑制作用;殷方榮等[24]發(fā)現(xiàn)Mn2+對(duì)貝萊斯芽孢桿菌角蛋白酶有輕微抑制作用;張軍等[25]發(fā)現(xiàn)Mn2+完全抑制乙酰微小桿菌低溫蛋白酶。但Mageswari等[26]的研究表明,Mn2+具有促進(jìn)金黃桿菌屬酶活的作用,當(dāng)Mn2+存在時(shí)酶活性顯著增強(qiáng),這是C.pennipullorum蛋白酶的罕見(jiàn)特征。此外,Bhavikatti等[27]從河水和河岸土壤樣品中分離出的C.cucumerisSARJS-2,Zn2+對(duì)其酶活無(wú)顯著抑制作用。Wang等[28]以紅曲稻為唯一的碳氮源,從土壤中分離得到C.taeanenseTKU001,Mg2+、Ca2+對(duì)其酶活無(wú)顯著影響,Zn2+抑制該酶活性,且在5 mmol Cu2+和Fe2+條件下完全失活,與JX-11菌株所產(chǎn)酶的特征相似。綜上,JX-11菌株所產(chǎn)酶可能是一種活性中心需Mn2+參與的金屬蛋白酶類(lèi),有關(guān)該酶分子的具體結(jié)構(gòu)及活性中心有待進(jìn)一步深入研究。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.6.4 化學(xué)試劑對(duì)JX-11菌株蛋白酶活性的影響 如圖11所示,甘油對(duì)該酶有顯著的激活作用,相對(duì)酶活可達(dá)132.94%,甘油可作為非離子表面活性劑能夠與游離水進(jìn)行水合,降低了游離水含量,減少了游離水對(duì)蛋白酶構(gòu)象靈活性的影響[29];乙醇、丙酮對(duì)酶活基本無(wú)影響;吐溫80、乙酸、甲醇顯著抑制該酶活性,有機(jī)溶劑會(huì)削弱蛋白質(zhì)的疏水鍵,使蛋白酶分子內(nèi)斥力增加,造成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)延展,最終導(dǎo)致催化活性喪失;EDTA對(duì)該酶的抑制作用顯著,EDTA是一種金屬螯合劑,與酶分子中的金屬離子形成螯合物從而使酶失活,進(jìn)一步表明該酶發(fā)揮作用需要金屬離子參與;而SDS對(duì)酶活具有顯著抑制作用,可能是因?yàn)镾DS為離子型表面活性劑,可通過(guò)靜電作用結(jié)合到蛋白酶表面帶有電荷的氨基酸殘基上,從而產(chǎn)生抑制作用[30]。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

利用模擬豆腐營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基,從石屏臭豆腐中分離篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株,命名為JX-11,經(jīng)過(guò)鑒定,為彭尼普爾金黃桿菌(Chryseobacteriumpennipullorum)。研究對(duì)菌株JX-11培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后酶活達(dá)到(39.16±3.24) U/mL,較優(yōu)化前提高了40.63%。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明菌株JX-11所產(chǎn)蛋白酶最適溫度為30 ℃,最適pH為7.0,是中性蛋白酶;在10～40 ℃和pH 6.0～9.0時(shí)酶活力穩(wěn)定;金屬離子Mn2+對(duì)酶活力有明顯激活作用,可使酶活提高4.33倍,而Zn2+、Cu2+、K+對(duì)其有抑制作用,乙醇、丙酮對(duì)酶活基本無(wú)影響;吐溫80、乙酸、甲醇、SDS、EDTA顯著抑制該酶活性,金屬螯合劑EDTA對(duì)該酶活性的抑制作用最大,同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了該酶為金屬蛋白酶類(lèi)?？紤]C.pennipullorum菌株的安全性,今后可采用代謝工程的方法對(duì)相關(guān)致病基因進(jìn)行敲除;也可通過(guò)基因工程手段異源表達(dá)蛋白酶的基因,利用所產(chǎn)蛋白酶應(yīng)用于石屏臭豆腐的發(fā)酵。