水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923生物膜及其毒力因子的影響

王嘉康

唐浩國(guó)

陳 靜

司啟賀

申茹曉

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為一種常見(jiàn)的食源性致病菌,可引起人類和動(dòng)物的感染和食物性中毒[1]。隨著抗生素的使用,多重耐藥性金黃色葡萄球菌的傳播正在以驚人的速度增加[2]。金葡菌生物膜能夠幫助細(xì)菌抵御宿主免疫系統(tǒng),更容易產(chǎn)生耐藥菌株,甚至多重耐藥菌株,這些耐藥菌株是導(dǎo)致慢性感染的主要病源,給人類和家畜的生命健康和食品安全造成極大的危害[3]。

生物膜由細(xì)菌群落和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)構(gòu)成,是細(xì)菌黏附于物體的表面,通過(guò)分泌多糖、蛋白質(zhì)、糖蛋白、糖脂和細(xì)胞外DNA(eDNA)等形成的高度組織化的膜樣聚合物[4-5],具有極強(qiáng)的黏附性和抗逆性,能夠幫助細(xì)菌很好地適應(yīng)周圍的環(huán)境[6]。自然環(huán)境中大多數(shù)細(xì)菌都能以生物膜的形式存在,生物膜能夠黏附在宿主的組織表面,一旦組織細(xì)胞受損,致病菌能夠不斷釋放毒素引發(fā)感染,并且可能進(jìn)入機(jī)體內(nèi)隨血液流動(dòng)播散,導(dǎo)致全身性感染[7]。

苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、丙酸鈣等化學(xué)防腐劑雖能夠有效抑制食源性致病菌的生長(zhǎng),但它同時(shí)也對(duì)人體健康和環(huán)境造成一定威脅。因此,植物源天然防腐劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一[8-10]。水飛薊素是從水飛薊果實(shí)及種子中提取的一類二氫黃酮醇與苯丙素衍生物縮合而成的黃酮木脂素類成分,因其安全無(wú)毒、無(wú)刺激性且具有抗炎保肝、抗氧化等優(yōu)點(diǎn)[11-12],在食品保健[13-15]、醫(yī)藥[16]、化妝品[17]等行業(yè)得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。研究擬探究水飛薊素對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響,以期為植物源活性物質(zhì)的進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水飛薊素:純度80%,西安云悅生物科技有限公司;

二甲基亞砜(DMSO)、結(jié)晶紫:分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;

腦心浸出液肉湯(BHI):青島海博生物技術(shù)有限公司;

噻唑藍(lán)(MTT):純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923,ATCC29213,ATCC6538):中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì):UV2400型,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;

離心機(jī):TDZ5-WS型,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;

真空冷凍干燥機(jī):ALPHA 1-2 LD plus型,德國(guó)Christ公司;

傅立葉變換中遠(yuǎn)紅外光譜儀:IFS 125HR,德國(guó)Bruker公司;

多功能酶標(biāo)儀:Infinite E Plex型,上海Tecan實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測(cè)定

采用Fei等[18]的方法,MIC為肉眼看不見(jiàn)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的最低濃度,所有試驗(yàn)平行3次。

1.3 S. aureus ATCC25923產(chǎn)膜能力鑒定

采用Tremblay等[19]的方法,結(jié)晶紫染色生物膜后,使用酶標(biāo)儀于OD490 nm測(cè)OD值;判斷標(biāo)準(zhǔn):以O(shè)D490 nm<0.11為陰性株,0.111.50為強(qiáng)產(chǎn)膜菌株。

1.4 結(jié)晶紫染色研究水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923生物膜的抑制及清除作用

1.4.1 對(duì)S.aureusATCC25923生物膜的抑制作用 將制備好的含有不同濃度水飛薊素的菌懸液分別加入到96孔板中,每孔200 μL,以對(duì)應(yīng)濃度的含有水飛薊素的無(wú)菌培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm處的吸光度。移除菌懸液,PBS輕柔漂洗3次,在60 ℃烘箱中干燥20 min。在每個(gè)孔中加入250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)晶紫溶液,37 ℃下染色5 min,用蒸餾水輕柔漂洗3次,在60 ℃烘箱中干燥20 min。加入250 μL體積分?jǐn)?shù)為33%的醋酸溶液溶解生物膜上結(jié)合的結(jié)晶紫染料,5 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光度,所有試驗(yàn)平行3次。相對(duì)生物膜形成能力以生物膜形成指數(shù)表示[20],生物膜形成指數(shù)按式(1)計(jì)算。

B=(S-C1)/(G-C2),

(1)

式中:

B——生物膜形成指數(shù);

S——染色后OD570 nm值;

C1——染色后空白對(duì)照OD570 nm值;

G——培養(yǎng)后OD630 nm值;

C2——培養(yǎng)后空白對(duì)照OD630 nm值。

1.4.2 對(duì)S.aureusATCC25923成熟生物膜的清除作用

于96孔板上每孔加入1×108CFU/mL的菌懸液200 μL,靜置培養(yǎng)24 h形成成熟生物膜后棄去培養(yǎng)液,注入新的培養(yǎng)液與不同濃度的水飛薊素藥液。陰性對(duì)照組依舊使用培養(yǎng)液進(jìn)行處理。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,PBS洗去浮菌,使用結(jié)晶紫定量染色法觀察生物膜的剩余量,所有試驗(yàn)平行3次。按式(2)計(jì)算生物膜清除率[21]。

(2)

試中:

B——生物膜清除率,%;

c1——各處理組OD570 nm值;

c2——對(duì)照組OD570 nm值。

“拓基礎(chǔ)、強(qiáng)根基、淡專業(yè)、重運(yùn)用、靈考核”五位一體的人才培養(yǎng)模式是一個(gè)有機(jī)整體，不可分開(kāi)運(yùn)用與理解，但是各個(gè)部分的側(cè)重點(diǎn)又各不相同。

1.5 MTT染色法檢測(cè)水飛薊素對(duì)生物膜代謝的影響

參照J(rèn)adhav等[22]的方法,使用MTT染色法檢測(cè)水飛薊素對(duì)生物膜代謝的影響。所有試驗(yàn)平行3次。

1.6 水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923毒力因子的影響

1.6.1 對(duì)S.aureusATCC25923溶血活性的影響 參照徐云鳳[23]37-41的方法測(cè)定水飛薊素對(duì)金黃色葡萄球菌溶血活性的影響。溶劑組為陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)菌液組為陰性對(duì)照,所有試驗(yàn)平行3次。

1.6.2 對(duì)S.aureusATCC25923凝固酶效價(jià)的影響 參照徐云鳳[23]37-41的方法測(cè)定水飛薊素對(duì)金黃色葡萄球菌凝固酶效價(jià)的影響。使用凍干血漿測(cè)定細(xì)菌凝固酶效價(jià),6 h內(nèi)間隔0.5 h觀察一次結(jié)果,若出現(xiàn)凝固現(xiàn)象,即為陽(yáng)性,否則為陰性。所有試驗(yàn)平行3次。

1.7 光學(xué)顯微鏡觀察水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923生物膜的影響

取不同濃度水飛薊素處理的菌懸液1 mL加入6孔板中,同時(shí)放入已滅菌的蓋玻片,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用結(jié)晶紫染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察水飛薊素對(duì)生物膜的影響。所有試驗(yàn)平行3次。

1.8 傅里葉紅外光譜分析

參照Padmavathi等[24]的方法并稍作修改,采用傅里葉紅外光譜法(fourier transform infrared spectrometry,FT-IR)對(duì)水飛薊素處理的金黃色葡萄球菌成分變化進(jìn)行測(cè)定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析和處理數(shù)據(jù),采用Tukey法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)膜能力的鑒定

結(jié)晶紫染色后,S.aureusATCC25923生物膜在490 nm處的OD值為1.704±0.133,大于1.5,根據(jù)Tremblay等[19]的判斷標(biāo)準(zhǔn),試驗(yàn)采用的菌株為高產(chǎn)膜菌株。

2.2 MIC的測(cè)定

如表1所示,對(duì)照組均有菌落生長(zhǎng),但在水飛薊素質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg/mL的培養(yǎng)基上,S.aureusATCC25923均無(wú)菌落生長(zhǎng),證明水飛薊素對(duì)ATCC25923的MIC為0.5 mg/mL。與二氫楊梅素(MIC為1.25 mg/mL)和藤茶提取物(MIC為6.3 mg/mL)以及大蒜水提物(MIC為24.0 mg/mL)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性相比[25-26],水飛薊素的抑菌能力具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表1 水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923的最小抑菌濃度?

2.3 水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923生物膜的抑制及清除作用

*表示與對(duì)照組相比具有顯著差異,P<0.05;**表示與對(duì)照組相比具有極顯著差異,P<0.01

由圖1可以看出,水飛薊素可以顯著抑制金黃色葡萄球菌ATCC25923生物膜的形成,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,其中對(duì)照組的生物膜形成指數(shù)為2.679,1/2MIC和MIC濃度的生物膜形成指數(shù)為0.566和0.271,相比于對(duì)照組分別下降了78.9%和90.0%,具有極顯著差異。而低濃度的水飛薊素對(duì)生物膜形成的抑制作用較小?；艏验萚27]研究發(fā)現(xiàn),1/16MIC濃度下的蒲公英水提物可誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌生物膜的形成,使生物膜生成量增加,但高濃度的蒲公英水提物可顯著抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成。崔海英等[28]研究發(fā)現(xiàn),0.1%丁香精油對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的抑制率達(dá)到99.73%。與其他天然產(chǎn)物相比,水飛薊素對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用較為顯著。

2.3.2 對(duì)S.aureusATCC25923成熟生物膜的清除作用

在細(xì)菌生物膜成熟之后,加入不同濃度的水飛薊素處理,結(jié)晶紫染色后,使用酶標(biāo)儀測(cè)定其對(duì)生物膜的清除能力,結(jié)果如圖2所示。

*表示與對(duì)照組相比具有顯著差異, P<0.05;**表示與對(duì)照組相比具有極顯著差異,P<0.01

由圖2可以看出,較高濃度的水飛薊素對(duì)成熟生物膜具有良好的清除作用,其中1/4MIC、1/2MIC和MIC濃度的生物膜清除率分別為16.6%,46.4%,89.2%,而1/16MIC濃度的清除率僅有0.16%,與對(duì)照組相比差異不顯著。在李虹[29]的研究中,最小生物膜抑制濃度(MBIC)下的環(huán)二肽處理金黃色葡萄球菌8 h,其生物膜清除率達(dá)到59.17%。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明水飛薊素具有較好的生物膜清除作用,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

2.4 水飛薊素對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌代謝的抑制作用

MTT可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下,外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。

二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶,用多功能酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞代謝情況。如圖3所示,當(dāng)水飛薊素濃度達(dá)到1/4MIC時(shí)就能顯著抑制生物膜內(nèi)細(xì)菌的代謝,隨著水飛薊素濃度的增加,抑制作用逐漸增強(qiáng),MIC濃度的抑制率達(dá)到85.5%。此試驗(yàn)結(jié)果與結(jié)晶紫染色法測(cè)定水飛薊素對(duì)生物膜形成的抑制作用有較高的一致性。

*表示與對(duì)照組相比具有顯著差異,P<0.05;**表示與對(duì)照組相比具有極顯著差異,P<0.01

2.5 光學(xué)顯微鏡觀察水飛薊素對(duì)生物膜的抑制作用

將蓋玻片用結(jié)晶紫染色后,放在光學(xué)顯微鏡下觀察,結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923生物膜的影響

*表示與對(duì)照組相比具有顯著差異,P<0.05;**表示與對(duì)照組相比具有極顯著差異,P<0.01

低濃度的水飛薊素對(duì)生物膜的抑制作用較弱,高濃度的水飛薊素能夠顯著抑制S.aureusATCC25923生物膜的生長(zhǎng),在MIC濃度下僅有極少量的生物膜形成,生物膜覆蓋率僅為9.5%。這與結(jié)晶紫法檢測(cè)結(jié)果高度一致。

2.6 對(duì)溶血活性的影響

金黃色葡萄球菌溶血因子已被證明可影響多種人類細(xì)胞類型,包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,同時(shí)還可裂解哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(PMN)[30],β-溶血素還可以通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞抑制白細(xì)胞介素-8(IL-8)的表達(dá),這些有助于金黃色葡萄球菌的逃逸和誘導(dǎo)生物膜形成[31]。試驗(yàn)采用無(wú)菌脫纖維羊血,使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450 nm處吸光值來(lái)測(cè)定水飛薊素對(duì)S.aureusATCC25923溶血因子表達(dá)的影響,結(jié)果如圖6所示。

不同大寫字母表示組間具有顯著差異(P<0.05)

由圖6可以看出,水飛薊素處理組的溶血活性與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著降低,當(dāng)水飛薊素濃度達(dá)到1/8MIC時(shí)可以顯著抑制S.aureusATCC25923溶血因子的表達(dá),且濃度達(dá)到1/4MIC時(shí)的溶血活性與無(wú)菌空白對(duì)照組相當(dāng)。

2.7 凝固酶效價(jià)的測(cè)定

金黃色葡萄球菌凝固酶能夠與凝血酶原以及其他幾種血漿蛋白結(jié)合,形成血纖蛋白凝塊,觸發(fā)血纖蛋白原向血纖蛋白轉(zhuǎn)化,進(jìn)而增加金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面的血纖維蛋白凝塊,抑制吞噬作用[32]。試驗(yàn)采用凍干兔血漿來(lái)測(cè)定金黃色葡萄球菌凝固酶的表達(dá),結(jié)果如表2所示。

表2 對(duì)凝固酶表達(dá)的影響?

由表2可知,對(duì)照組在0.5 h后出現(xiàn)凝固現(xiàn)象,1 h后完全凝固,1/8MIC組在5.5 h后完全凝固,而1/4MIC組在4 h后已完全凝固,1/2MIC以及MIC組分別在2.5 h和4 h開(kāi)始出現(xiàn)凝固現(xiàn)象,且一直處于半凝固狀態(tài)。說(shuō)明水飛薊素可以顯著抑制S.aureusATCC25923凝固酶的表達(dá),但未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

2.8 FT-IR分析

圖7 傅里葉紅外分析

2.9 水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923生物膜的作用機(jī)制

如圖8所示,在金黃色葡萄球菌生物膜形成的4個(gè)階段中,水飛薊素可以作用于細(xì)菌增殖聚集階段抑制初期生物膜的形成,也可作用于成熟生物膜形成階段,清除已形成的生物膜。同時(shí)水飛薊素還可在很大程度上抑制金黃色葡萄球菌溶血因子以及凝固酶等毒力因子的表達(dá)。

圖8 水飛薊素對(duì)S. aureus ATCC25923生物膜及毒力因子影響機(jī)制

3 結(jié)論

采用結(jié)晶紫法探究了水飛薊素對(duì)S.aureusATCC25923生物膜形成的抑制以及對(duì)成熟生物膜的清除作用,0.5倍和1倍最小抑菌質(zhì)量濃度下的水飛薊素處理對(duì)生物膜的抑制率分別達(dá)到78.9%和90%,清除率分別達(dá)到46.4%和89.2%。同時(shí)采用MTT染色法測(cè)定水飛薊素對(duì)生物膜內(nèi)活菌代謝的影響,結(jié)果顯示亞抑制濃度下的水飛薊素能夠顯著抑制生物膜內(nèi)細(xì)菌的代謝能力。在Jadhav等[22]的研究中,使用MTT染色法檢測(cè)處蓍草精油可以顯著抑制單增李斯特菌生物膜內(nèi)活菌的代謝能力。后續(xù)試驗(yàn)中,采用結(jié)晶紫染色在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)一步觀察水飛薊素對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響,以更直觀地呈現(xiàn)水飛薊素對(duì)細(xì)菌生物膜的影響。之后針對(duì)S.aureusATCC25923溶血活性以及凝固酶的表達(dá)進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)低濃度的水飛薊素可以顯著抑制其溶血因子及凝固酶的表達(dá),在徐云風(fēng)[23]37-41關(guān)于安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的研究中顯示,低劑量的安石榴苷可以抑制其毒力因子的表達(dá),但未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。傅里葉紅外光譜分析結(jié)果顯示,在水飛薊素處理后,與金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)、脂肪酸、水合作用等相關(guān)吸收峰強(qiáng)度明顯減弱,這也揭示了水飛薊素可能通過(guò)影響細(xì)菌水合,蛋白質(zhì)合成來(lái)影響細(xì)菌表面疏水性、黏附性、毒力因子的表達(dá),從而抑制其生物膜形成的潛在機(jī)制。

綜上所述,水飛薊素對(duì)金黃色葡萄球菌的生物膜形成具有很好的抑制以及清除作用,同時(shí)能夠顯著抑制其毒力因子的表達(dá)。