限制性酶解結(jié)合糖基化改性對(duì)大豆分離蛋白乳化性質(zhì)的影響

李 琳

孫一熙

秦 文

張 清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 625099)

大豆蛋白作為大豆中最主要的營(yíng)養(yǎng)成分,是一種產(chǎn)量高、價(jià)格低廉的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源[1-2],主要優(yōu)點(diǎn)包括:① 氨基酸組成方面具有優(yōu)勢(shì),包含所有必需氨基酸;② 含有生物活性物質(zhì),能降低膽固醇,減少高脂血癥和心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn);③ 具有極好的加工性能,如凝膠性、乳化性和持水持油性[3-4]。在各種功能性質(zhì)中,對(duì)大豆蛋白的乳化特性研究最為廣泛。然而,天然大豆蛋白的乳化性會(huì)受到各種環(huán)境因素的影響,限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此,通常需要對(duì)天然大豆蛋白進(jìn)行改性處理。

目前,常用的蛋白質(zhì)改性方法主要有物理改性、化學(xué)改性和酶法改性3種[5]。協(xié)同改性是將兩種或兩種以上的改性方法協(xié)同作用,可有效克服單一改性方法的局限性以及不足。Jiang等[6]分別用胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)乳清蛋白—半乳糖軛合物進(jìn)行水解處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),水解后軛合物的抗氧化活性較水解前顯著提高。Song等[7]用堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白—?dú)ぞ厶擒椇衔?得到水解度為1%,2%,4%的水解產(chǎn)物,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與天然蛋白和經(jīng)軛合的蛋白相比,其結(jié)構(gòu)更靈活,乳化性和抗氧化活性更高。Zhang等[8]研究了有限水解對(duì)大豆分離蛋白—麥芽糊精軛合物物理化學(xué)性質(zhì)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有限的水解可以改善軛合物的結(jié)構(gòu),提高其乳化活性。除了將蛋白質(zhì)—多糖軛合物進(jìn)行酶解外,對(duì)蛋白質(zhì)的酶解物進(jìn)行糖基化處理也能使天然蛋白功能性質(zhì)得到提升。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn),與大米蛋白—葡聚糖軛合物相比,大米蛋白水解物(水解度為5%)—葡聚糖軛合物的溶解度、乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了3.5,5.3,7.3倍,與大米蛋白水解物相比,分別提高了1.5,2.2,8.0倍。Yu等[10]研究發(fā)現(xiàn),胰蛋白酶水解結(jié)合葡聚糖糖基化處理的大豆分離蛋白乳液在經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后,表現(xiàn)出比未處理的蛋白乳液更高的穩(wěn)定性,且較低水解度(2%)的糖基化水解物比較高水解度(5%)的糖基化水解物表現(xiàn)出更優(yōu)的乳化性能。

糖基化處理與酶解處理協(xié)同改性對(duì)天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能特性改善效果優(yōu)異,在開(kāi)發(fā)新型蛋白基食品配料方面有廣泛的發(fā)展前景。目前,對(duì)食品蛋白先進(jìn)行糖基化處理再酶解的研究相對(duì)較多[6-8],而先酶解后糖基化處理的報(bào)道較少[9-10]。研究以大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)為原料,采用中性蛋白酶對(duì)SPI先進(jìn)行限制性酶水解,再利用超濾處理將酶解SPI分成不同相對(duì)分子質(zhì)量的組分,對(duì)每個(gè)組分進(jìn)行糖基化改性,考察改性后產(chǎn)物的乳化特性,旨在為開(kāi)發(fā)基于SPI的新型乳化劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白:蛋白質(zhì)含量≥85%,水分含量≥7%,灰分≤15%,pH 6.5～7.5,北京索萊寶科技有限公司;

中性蛋白酶:來(lái)源于枯草芽孢桿菌,EC編號(hào)3.4.24.4,100 U/mg,上海源葉生物科技有限公司;

葡聚糖:相對(duì)分子質(zhì)量為4 000,上海源葉生物科技有限公司;

其余試劑:分析純,成都市科隆化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):RJ-TGL-2000R型,無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司;

恒溫恒濕培養(yǎng)箱:LHS-080型,鄭州生元儀器有限公司;

熒光酶標(biāo)儀:Varioskan Flash型,賽默飛世爾科技有限公司;

高速剪切均質(zhì)機(jī):AD500S-H型,上海昂尼儀器儀表有限公司;

動(dòng)態(tài)光納米粒度電位儀:Nano ZS型,英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI酶水解處理 根據(jù)Huang等[11]的方法修改如下:利用超純水配制5 g/100 mL的SPI溶液,室溫下磁力攪拌2 h,置于4 ℃冰箱水合過(guò)夜。在55 ℃條件下,加入中性蛋白酶(0.5 g/100 g),恒溫振蕩(120 r/min)水解20 min。水解前先將SPI溶液在55 ℃恒溫振蕩水浴鍋中平衡30 min,水解過(guò)程中用1 mol/L NaOH溶液控制體系pH在7左右。水解完成后,將蛋白水解液置于90 ℃下加熱20 min滅酶。冷卻至室溫后于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min,收集上清液,一部分冷凍干燥后得到SPI水解物(soybean protein isolate hydrolysate,SPIH),置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SPIH超濾分離處理 根據(jù)Zhang等[12]的方法修改如下:將收集的另一部分上清液經(jīng)過(guò)0.45 μm水相濾膜微濾后,使用不同截留相對(duì)分子質(zhì)量(3 000和1 000)的超濾離心管按照相對(duì)分子質(zhì)量從高到低逐級(jí)超濾分級(jí)(4 000 r/min,20 min),將SPIH分成相對(duì)分子質(zhì)量不同的3種組分:>3 000(F30)、3 000～1 000(F30-10)和<1 000(F10)。收集濾液,冷凍干燥后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。F30、F30-10和F10的得率分別為15.31%,3.94%,0.84%。

1.3.3 SPIH超濾組分糖基化處理 根據(jù)Xue等[13]的方法修改如下:利用超純水配制2 g/100 mL的不同相對(duì)分子質(zhì)量的水解物組分(F30、F30-10和F10)的分散液,加入同等質(zhì)量的葡聚糖,混勻后室溫?cái)嚢? h,置于4 ℃冰箱中過(guò)夜。將混合液冷凍干燥后得到的粉末,置于培養(yǎng)皿中,在60 ℃、相對(duì)濕度79%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)2,4,6,12,18,24 h后取出,迅速冷卻以終止反應(yīng)。冷凍干燥48 h,得到F30/F30-10/F10-葡聚糖軛合物,-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ饕疾焖馕镏胁煌M分的糖基化后乳化性質(zhì)的改善情況,因此未對(duì)水解物整體進(jìn)行糖基化改性處理。

1.3.4 乳液制備 將樣品分散于超純水中,配制1,2,3 g/100 mL蛋白質(zhì)溶液,用0.5 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)pH至7,室溫下攪拌2 h,置于4 ℃冰箱水合過(guò)夜。將充分水合的樣品溶液在室溫下平衡30 min后,加入大豆油,使最終油相體積分?jǐn)?shù)為10%。在油水混合液中添加0.02 g/100 mL疊氮鈉后在12 000 r/min條件下高速均質(zhì)2 min,制得粗乳液。再將粗乳液在60 MPa下高壓均質(zhì)3次后制得細(xì)乳液。

1.3.5 乳化性質(zhì)測(cè)定 乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(emulsifying stability index,ESI)的測(cè)定根據(jù)Xu等[14]的方法修改如下:利用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)配制1 g/100 mL的樣品溶液,漩渦振蕩后于4 ℃冰箱中水合過(guò)夜。測(cè)試前將樣品溶液在室溫下平衡30 min,按最終油相體積分?jǐn)?shù)為10%加入大豆油。將混合液在12 000 r/min下高速均質(zhì)2 min。在均質(zhì)后的第0 min和第10 min從容器底部取50 μL乳液,與5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液混合,在500 nm處測(cè)定吸光值。以SDS溶液為空白對(duì)照。根據(jù)式(1)和式(2)計(jì)算EAI和ESI。另外,用膠頭滴管吸取上述新鮮制備的乳液滴于潔凈的載玻片表面,將蓋玻片緩緩覆蓋液滴,避免出現(xiàn)氣泡。采用光學(xué)顯微鏡觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)并拍照。

(1)

(2)

式中:

EAI——乳化活性指數(shù),m2/g;

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù),min;

A0、A10——乳液在第0 min和第10 min時(shí)的吸光度值;

DF——稀釋倍數(shù),100;

c——蛋白質(zhì)量濃度,g/mL;

φ——油相體積分?jǐn)?shù),%;

θ——光路,1 cm。

1.3.6 乳液粒徑和電位測(cè)定 乳液用超純水稀釋600倍,設(shè)置分散劑的折射率為1.590,吸收系數(shù)為0.010。將稀釋液放入粒度儀樣品池中,在25 ℃下平衡2 min后,測(cè)定光強(qiáng)平均粒徑及ζ-電位。

1.3.7 乳液穩(wěn)定性測(cè)定

(1) 貯藏穩(wěn)定性:取4 mL新鮮乳液(pH 7)移入帶蓋玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,在4 ℃冰箱中靜置貯藏7 d。在第0,1,3,5,7天時(shí),對(duì)每個(gè)樣品的粒徑和電位進(jìn)行分析。

(2) pH穩(wěn)定性:用0.5 mol/L NaOH或HCl溶液將新鮮乳液的pH值調(diào)至3,5,7,9。取4 mL不同pH值的乳液移入帶蓋玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,在4 ℃冰箱中靜置貯藏24 h后,對(duì)乳液的粒徑和電位進(jìn)行分析。

(3) 離子強(qiáng)度穩(wěn)定性:向新鮮乳液(pH 7)中加入不同質(zhì)量的NaCl,調(diào)整乳液的離子濃度為0,50,100,200 mmol/L。取4 mL不同離子濃度的乳液移入帶蓋玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,在4 ℃冰箱中靜置貯藏24 h后,對(duì)乳液的粒徑和電位進(jìn)行分析。

(4) 溫度穩(wěn)定性:取4 mL新鮮乳液(pH 7)移入帶蓋玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,置于不同溫度(30,50,70,90 ℃)水浴鍋中加熱30 min。加熱后,立即取出冰水浴冷卻至室溫。隨后在4 ℃冰箱中靜置貯藏24 h后,對(duì)乳液的粒徑和電位進(jìn)行分析。

1.3.8 乳液的復(fù)溶性 將新鮮乳液冷凍干燥,取凍干粉末溶解于超純水(pH 7.0)中,質(zhì)量濃度為0.4 g/100 mL。將復(fù)溶后的乳液移入帶蓋玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,在4 ℃冰箱中靜置貯藏24 h后,對(duì)乳液的外觀進(jìn)行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行重復(fù)測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用Microsoft Office Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用SPSS 25.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析,采用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化性質(zhì)分析

由表1可知,與SPI相比,SPIH的EAI顯著增加,但ESI卻略微降低。這可能是SPI在酶解后形成了比SPI相對(duì)分子質(zhì)量小的產(chǎn)物,具有更疏松的結(jié)構(gòu)[15],有利于其在油—水界面的快速吸附。同時(shí),酶解也降低了蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和溶液黏度,使得SPIH重力分離的速度增加,因此SPIH穩(wěn)定乳液的穩(wěn)定性降低[16]。超濾后,與SPIH相比,F30的EAI有所降低,但仍高于SPI。而F30-10和F10的EAI則顯著降低,是因?yàn)镕30-10和F10相對(duì)分子質(zhì)量更低,不能在油—水界面形成連續(xù)的蛋白膜,從而表現(xiàn)出較差的乳化性能[17]。

表1 SPI、SPIH、F30、F30-10和F10的乳化性質(zhì)?

如表2所示,F30經(jīng)糖基化改性后,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,其EAI和ESI呈先上升后下降的趨勢(shì),分別在反應(yīng)6,12 h時(shí)達(dá)到最高值。EAI和ESI提高的原因分析如下:① 與多糖親水基團(tuán)的共價(jià)結(jié)合增加了F30的親水性,使其表面性質(zhì)更活躍,在油—水界面上更容易吸附重排;② 多糖分子鏈的接入增加了F30的空間位阻,可以防止新形成的液滴聚集,提高乳液穩(wěn)定性[18]。反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至18～24 h時(shí),F30-葡聚糖軛合物的ESI開(kāi)始下降,可能與過(guò)高的糖基化反應(yīng)程度有關(guān)。此外,糖基化改性未能改善F30-10和F10的乳化能力。

表2 F30、F30-10和F10反應(yīng)不同時(shí)間的軛合物的乳化性質(zhì)?

圖1是SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的微觀結(jié)構(gòu),可以看出乳液的液滴均呈現(xiàn)規(guī)則的球形。SPI、SPIH及F30 3種樣品穩(wěn)定的乳液分布著大小不均勻的液滴,并且由SPIH穩(wěn)定的乳液液滴尺寸更小。在F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液中,反應(yīng)4 h的產(chǎn)物穩(wěn)定乳液的液滴最小,且大小分布趨于均勻。此時(shí),液滴間隙小,依靠緊密,使得水相不容易下流而導(dǎo)致油水分層,同時(shí)也會(huì)提升乳液穩(wěn)定性[19]。圖2和圖3顯示了F30-10和F30-10-葡聚糖軛合物,以及F10和F10-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的微觀結(jié)構(gòu),可以看出所有樣品穩(wěn)定乳液的液滴直徑明顯增大,且視野內(nèi)液滴數(shù)量較少。綜合EAI、ESI及微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果,重點(diǎn)討論F30及其糖基化產(chǎn)物的乳化性質(zhì),并選擇反應(yīng)4 h的F30-葡聚糖軛合物進(jìn)行后續(xù)乳液穩(wěn)定性研究。

圖1 SPI、SPIH、F30及反應(yīng)不同時(shí)間的F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的光學(xué)顯微照片

圖2 F30-10及反應(yīng)不同時(shí)間的F30-10-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的光學(xué)顯微照片

圖3 F10及反應(yīng)不同時(shí)間的F10-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的光學(xué)顯微照片

2.2 乳液粒徑和電位分析

SPI、SPIH、F30及反應(yīng)4 h的F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液平均粒徑和ζ-電位如圖4所示。觀察圖4(a)可知,與SPI相比,SPIH穩(wěn)定的乳液粒徑顯著降低。這可能是酶水解破壞了蛋白質(zhì)的肽鍵,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開(kāi),使得內(nèi)部疏水基團(tuán)及其他活性氨基酸暴露[20],促進(jìn)了其在油—水界面的吸附速度和重新定向。與SPIH相比,F30穩(wěn)定的乳液粒徑則有所增加。這可能與F30的表面疏水性進(jìn)一步增加有關(guān)。此外,由F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液平均粒徑最小。這可能是多糖的大分子尺寸和親水性在乳液液滴表面產(chǎn)生了較強(qiáng)的空間位阻效應(yīng),增加了液滴周圍界面膜的乳化性能和物理穩(wěn)定性,促進(jìn)小粒徑液滴的形成[21]。

不同樣品之間字母不同表示差異顯著(P<0.05)

通常來(lái)說(shuō),當(dāng)體系的ζ-電位絕對(duì)值>30 mV時(shí),被認(rèn)為足以抑制靜電聚集[22]。如圖4(b)所示,與SPI相比,SPIH穩(wěn)定乳液的ζ-電位絕對(duì)值有所增加,這與酶水解增加了蛋白質(zhì)表面可電離基團(tuán)的數(shù)量有關(guān)。此外,SPIH經(jīng)超濾后,所得F30組分的表面電荷數(shù)量進(jìn)一步增加,所以乳液表現(xiàn)出更高的ζ-電位絕對(duì)值。然而,F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液卻表現(xiàn)出比F30穩(wěn)定乳液更低的ζ-電位絕對(duì)值。這可能是與F30共價(jià)結(jié)合的葡聚糖覆蓋在F30的表面,并且提供使蛋白質(zhì)電荷遠(yuǎn)離水相的靜電屏蔽效應(yīng),減少了帶電蛋白質(zhì)與周圍液體之間的靜電相互作用,最終降低了軛合物表面的電荷數(shù)量[23-24]。因此,由軛合物穩(wěn)定的乳液表現(xiàn)出相對(duì)較低的ζ-電位絕對(duì)值。

2.3 乳液貯藏穩(wěn)定性分析

由于油相與水相之間存在正的自由能,會(huì)通過(guò)絮凝、沉淀、聚集、Ostwald熟化和重力相分離等各種機(jī)制,導(dǎo)致乳液液滴逐漸破裂,穩(wěn)定性下降[25]。如圖5所示,所有乳液液滴的平均粒徑總體上均隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增大。其中,F30樣品穩(wěn)定乳液的粒徑增大速度最快,而F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的粒徑增大速度則相對(duì)較慢。這是由于F30-葡聚糖軛合物吸附層能夠提供給乳液液滴更有效的空間位阻穩(wěn)定作用,從而減緩液滴之間的聚集。此外,在貯藏過(guò)程中,乳液的ζ-電位呈波動(dòng)性變化,說(shuō)明與靜電排斥相比,空間斥力對(duì)乳液的貯藏穩(wěn)定性有更大的影響。這些結(jié)果表明,酶解和進(jìn)一步的糖基化反應(yīng)可以有效改善乳液在長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中的穩(wěn)定性。雖然乳液的粒徑有所增加,但是所有樣品的外觀在貯藏期間均保持穩(wěn)定,未觀察到明顯的相分離或乳析現(xiàn)象。

不同貯藏時(shí)間之間字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 乳液pH穩(wěn)定性

由圖6可知,隨著pH增加,所有乳液的平均粒徑呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì):在pH值為3～5時(shí),乳液體系不穩(wěn)定,液滴大量聚集,平均粒徑超過(guò)1 000 nm。相比之下,在pH值為7～9時(shí),乳液相對(duì)穩(wěn)定,液滴分布均勻。此外,所有乳液的ζ-電位絕對(duì)值均隨著pH的增大而逐漸增加。由于乳化劑的主要成分為SPI或其水解物,所以乳液體系對(duì)pH值比較敏感。當(dāng)pH值接近SPI等電點(diǎn)(pH 4.5)時(shí),乳液液滴之間的靜電斥力不夠強(qiáng),無(wú)法抵抗疏水性和范德華力的吸引,導(dǎo)致乳化能力下降[25]。因此,雖然葡聚糖可以增強(qiáng)F30的乳化能力,但其物理化學(xué)性質(zhì)仍然受到乳液體系pH值的影響。

不同pH之間字母不同表示差異顯著(P<0.05)

如圖7所示,從樣品外觀圖中也可以看到,3 g/100 mL SPI穩(wěn)定的乳液在pH 5時(shí),形成了絮凝體,出現(xiàn)了明顯的相分離情況。此外,1 g/100 mL SPI穩(wěn)定的乳液在pH 5時(shí)出現(xiàn)了輕微的分層。而對(duì)于SPIH和F30穩(wěn)定的乳液,在pH值為3和5時(shí)出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象,上層為白色乳析層,下層為透明乳清層。而且隨著濃度的降低,分層現(xiàn)象更加明顯。值得注意的是,F30-葡聚糖軛合物所形成的乳液,由于液滴表面高度水合的葡聚糖極大地抑制了軛合物在不同液滴之間的相互作用,從而降低了在pH值為3和5時(shí)的分層現(xiàn)象?？梢?jiàn),界面膜的空間斥力和高度水合作用是提高乳狀液穩(wěn)定的必要條件。相反,在pH值為7～9時(shí),所有乳液保持穩(wěn)定,沒(méi)有出現(xiàn)分層現(xiàn)象,這也與粒徑的結(jié)果一致。

圖7 pH對(duì)不同濃度的SPI、SPIH、F30及F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的外觀的影響

2.5 乳液離子強(qiáng)度穩(wěn)定性

在pH 7時(shí),測(cè)量了SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液在不同離子強(qiáng)度(0,50,100,200 mmol/L)下粒徑和ζ-電位的變化,如圖8所示。當(dāng)NaCl濃度在0～200 mmol/L范圍內(nèi)增加時(shí),所有乳液的粒徑均逐漸增大。并且1 g/100 mL的SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖軛合物增加程度最明顯。此外,隨著NaCl濃度增加,乳液的ζ-電位絕對(duì)值均逐漸降低。這種現(xiàn)象可能與鹽離子的靜電屏蔽作用有關(guān)。水相中的反離子(Na+)由于靜電吸引,松散地聚集在蛋白質(zhì)表面的負(fù)電荷基團(tuán)(—COO-)周圍,從而屏蔽了它們的凈電荷[26]。這促進(jìn)了乳液液滴之間的聚集和絮凝,增大了液滴尺寸。具體來(lái)說(shuō),由SPI穩(wěn)定的乳液表現(xiàn)出最小的粒徑變化幅度,且乳液在外觀上沒(méi)有明顯變化(如圖9所示)。但是,由SPIH穩(wěn)定的乳液則表現(xiàn)出相對(duì)較弱的對(duì)抗離子強(qiáng)度穩(wěn)定性,特別是1 g/100 mL的SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖軛合物的乳液放置24 h后出現(xiàn)了分層現(xiàn)象(如圖9中虛線位置所示)。而這種現(xiàn)象在F30穩(wěn)定的乳液中更加明顯,乳液分層程度也更大。這可能是因?yàn)镕30具有較短的肽鏈和較低的相對(duì)分子質(zhì)量,在油—水界面的吸附層更薄。但是與F30相比,F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的粒徑變化幅度明顯減小。此外,從外觀上未發(fā)現(xiàn)分層現(xiàn)象,表明其穩(wěn)定性優(yōu)于F30。

不同濃度之間字母不同表示差異顯著(P<0.05)

虛線表示乳液分層位置;0,50,100,200對(duì)應(yīng)的NaCl濃度分別為0,50,100,200 mmol/L

2.6 乳液溫度穩(wěn)定性

研究了在30～90 ℃熱處理30 min后,SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的粒度和ζ-電位變化,如圖10所示。從30 ℃加熱至50 ℃時(shí),SPI穩(wěn)定乳液的粒徑均明顯降低;而當(dāng)溫度進(jìn)一步增大至90 ℃時(shí),乳液粒徑則逐漸增大。由SPIH、F30和F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液在30～70 ℃熱處理后,粒徑增大幅度較小,而在較高的溫度70～90 ℃下處理后,粒徑明顯增加,表明乳液有聚集的趨勢(shì)。但是F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液的粒徑增加程度相對(duì)較低。此外,在熱處理過(guò)程中,所有乳液的ζ-電位變化不明顯,說(shuō)明熱處理未影響乳液液滴之間的靜電相互作用,而液滴粒徑的增加可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)吸附層之間通過(guò)疏水或二硫鍵等相互作用聚集所引起的。雖然乳液的粒徑在熱處理后明顯增加,但仍然低于1 000 nm,所以從外觀上未觀察到分層現(xiàn)象。

不同溫度之間字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.7 復(fù)溶特性

將SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液冷凍干燥后,分散在一定量的去離子水中,對(duì)其復(fù)溶特性進(jìn)行探究。如圖11(a)所示,由SPI和SPIH穩(wěn)定的乳液在凍干后呈淡黃色,且凍干物質(zhì)地黏稠,有明顯的漏油跡象。而由F30和F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液在凍干后呈白色,粉末干燥,無(wú)黏稠或漏油跡象。此外,如圖11(b)所示,由SPI穩(wěn)定的乳液在凍干后,幾乎不溶于水,即使在經(jīng)過(guò)外力攪拌后,都很難再恢復(fù)至凍干前的狀態(tài)。這可能與SPI具有較低的溶解度有關(guān)。而對(duì)于SPIH、F30和F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液,凍干后加水能迅速溶解,形成的乳液分散體系均一、流動(dòng)性好。但是經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的放置后,出現(xiàn)輕微的脂肪上浮現(xiàn)象;且該現(xiàn)象在F30穩(wěn)定的乳液中更為明顯。這些結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)酶水解后,降低了蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量,使其結(jié)構(gòu)更加疏松,從而提高了蛋白質(zhì)的溶解度,這有利于提升乳液凍干后的復(fù)溶效果。此外,F30-葡聚糖軛合物較F30表現(xiàn)出更低的脂肪上浮程度,進(jìn)一步說(shuō)明了糖基化改性對(duì)F30乳化性質(zhì)的改善作用。同時(shí),良好的復(fù)溶效果也將有利于F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定的乳液作為食品配料在食品體系中的應(yīng)用。

圖11 不同濃度SPI、SPIH、F30及F30-葡聚糖軛合物穩(wěn)定乳液凍干后的外觀形態(tài)和復(fù)溶效果

3 結(jié)論

通過(guò)中性蛋白酶水解和葡聚糖糖基化相結(jié)合的協(xié)同改性對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性處理,探究了改性大豆分離蛋白在乳化特性上的變化,評(píng)估了改性大豆分離蛋白作為乳化劑穩(wěn)定乳液的能力。研究結(jié)果表明:① 大豆分離蛋白水解物中對(duì)乳化性質(zhì)最有利的主要是相對(duì)分子質(zhì)量較大的組分(F30),相對(duì)分子質(zhì)量較小的組分(F30-10和F10)乳化性質(zhì)較差。② 酶水解可以提高大豆分離蛋白表面疏水性,促進(jìn)水解物在油—水界面吸附,乳化活性明顯改善;但是在液滴表面形成的界面膜較薄,且水解物之間容易因疏水相互作用發(fā)生結(jié)構(gòu)重排,導(dǎo)致乳液在不利環(huán)境條件下容易失穩(wěn)分層。③ 糖基化后,與F30共價(jià)結(jié)合的葡聚糖可以在液滴表面提供額外的空間位阻作用,增加界面膜厚度,減緩因NaCl的靜電屏蔽作用和熱處理導(dǎo)致的液滴聚集,提高乳液穩(wěn)定性。綜上,限制性酶解結(jié)合糖基化改性是提高大豆蛋白乳化性能的有效手段,后續(xù)可繼續(xù)探討該研究獲得的改性大豆蛋白在穩(wěn)定新型乳液,如多重乳液、Pickering乳液、多層乳液等方面的潛力。