離子淌度質(zhì)譜法在D-氨基酸修飾多肽研究中的進(jìn)展

劉文靜，陳雨欣，李 博

（中國藥科大學(xué)藥物分析系，江蘇 南京 210009）

DAACPs 的研究早期僅限于在微生物的細(xì)胞壁和多肽類抗生素中，自20 世紀(jì)80 年代以來，約40 種內(nèi)源性DAACPs 被發(fā)現(xiàn)[1]。DAACPs 常充當(dāng)細(xì)胞間信號肽或毒素[2]，如非洲巨蝸牛的神經(jīng)肽-Fulicin[3]、貝類的神經(jīng)遞質(zhì)D-Leu 取代的Mytilus-FFRFamide 肽[4]、海兔的NdWFamide 異構(gòu)肽[5]。從甲殼動(dòng)物、漏斗網(wǎng)蜘蛛毒液、鴨嘴獸毒液、加州蠑螈、南美樹蛙等不同物種的生物體中也分別提取出了DAACPs[6-7]。此外，異構(gòu)性也被用于治療性生物制劑的工程，其中D-氨基酸可有效降低對藥物的免疫原性反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。市場上治療性DAACPs 的例子包括用于治療遺傳性血管性水腫的冰劑依卡西肽和美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)銷售用于治療繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)的泰卡肽等。但有時(shí)消旋化可能會(huì)造成我們不希望的結(jié)構(gòu)變化，因此開發(fā)合適的方法驗(yàn)證治療藥物的肽/蛋白穩(wěn)定性的方法是必要的[1]。而由于檢測手段的匱乏，生物體中DAACPs 的種類、含量和生物學(xué)作用已嚴(yán)重被低估。

發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性DAACPs 的方法主要包括兩個(gè)步驟：一是在生物樣本中篩選候選DAACPs，二是對D-氨基酸殘基進(jìn)行定位[8]。由于DAACPs 與天然L-氨基酸組成的多肽分子量一致，傳統(tǒng)的免疫分析法、色譜法等分離效率有限。且質(zhì)譜法難以實(shí)現(xiàn)這類立體異構(gòu)體的分析[9]。因此，需要額外的方法來實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜檢測的立體選擇性。離子遷移質(zhì)譜（Ion Mobility-Mass Spectrometry，IM-MS）提出了一種不同于以往的立體異構(gòu)體分析策略。在IM-MS 中，離子在惰性氣體和外加電場的作用下，根據(jù)其與漂移氣體CCS 的差異實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體分離。這一特點(diǎn)使其在各種異構(gòu)體的分離都有所應(yīng)用，本文著重介紹了IM-MS 在DAACPs 分離分析中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為IM-MS 法分析DAACPs提供參考。

1 離子淌度質(zhì)譜法基本原理

1.1 儀器構(gòu)成

離子淌度質(zhì)譜儀在離子源和質(zhì)量檢測器之間加入了漂移管，通過其兩端的電場和漂移氣體的共同作用實(shí)現(xiàn)分離。通常包括漂移時(shí)間離子遷移譜（Drift time ion mobility spectrum，DTIMS）、吸入離子遷移譜（Aspiration ion mobility spectrometers,AIMS）、差分離子遷移譜（Differential ion mobility spectrometers,DIMS）和行波離子遷移譜（Traveling wave ion mobility mass spectrometer，TWIMS）等[10]。離子遷移單元和質(zhì)量檢測器之間配以由錐體和離子透鏡組成的接口[11]，通過不同的離子遷移單元和質(zhì)量分析器的對接可以產(chǎn)生IMSn-MSm 型離子淌度質(zhì)譜儀[12]。

1.2 分離基本原理

離子遷移質(zhì)譜法根據(jù)氣體離子的大小和形狀來分離氣體離子，從而區(qū)分各種碰撞截面值不同的構(gòu)象異構(gòu)體。分辨率（Rp）為IM-MS 區(qū)分離子的能力，其公式為式（1）：

式中：td是離子漂移時(shí)間；wh是在探測器上以最大強(qiáng)度的一半測量到的離子脈沖持續(xù)時(shí)間。

溫度、壓力、漂移氣體組成、電場參數(shù)和待分析離子構(gòu)象的靈活性均可影響分離過程，通過對儀器結(jié)構(gòu)的修飾和漂移原理的改變也可顯著提高其分離能力。

離子結(jié)構(gòu)越緊湊，發(fā)生碰撞的機(jī)會(huì)越少，具有更快的漂移速度。施加較低電場時(shí),漂移時(shí)間與CCS 存在一定的相關(guān)性，分離基本原理可以使用Mason-Schamp方程[式（2）]將測量的漂移時(shí)間轉(zhuǎn)換為CCS 值：

式中：z 為離子的電荷狀態(tài)；e 為基本電荷；N 為漂移氣體的數(shù)密度；μ 為離子-中性漂移氣體對的減質(zhì)量；kB為玻爾茲曼常數(shù)；T 為氣體溫度；P 為實(shí)驗(yàn)壓力；L 為漂移長度；E 為外加電場強(qiáng)度；td為離子通過漂移管所需時(shí)間。離子在漂移管中受庫侖力和氣體分子碰撞阻礙力的作用，其通過漂移管所需的時(shí)間（td）與K直接相關(guān)，而這取決于離子的形狀、質(zhì)量和電荷量。

CCS 并非真正的分子截面，而是一個(gè)平均所有幾何方向和離子中性相互作用的觀測特性[13]。將漂移時(shí)間轉(zhuǎn)化為CCS 值，不僅可以用來推斷對離子三維構(gòu)象的信息，還大大提升了分析方法的可重復(fù)性[14]。

2 離子淌度質(zhì)譜法的應(yīng)用

D/L 構(gòu)型轉(zhuǎn)換不影響肽段本身和碎片的質(zhì)量，離子碎片豐度的差異進(jìn)行鑒別和定量會(huì)限制低豐度的異構(gòu)體的測定[15]。而離子淌度質(zhì)譜法已經(jīng)開發(fā)了多種方法，為更多內(nèi)源性DAACP 的發(fā)現(xiàn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

2.1 酸絡(luò)合法

直接離子淌度質(zhì)譜法中，DAACP 與天然多肽的碰撞截面差異不足，單個(gè)位點(diǎn)異構(gòu)化肽段可能無法區(qū)分?？衫脡A性氨基酸殘基與一些酸類形成非共價(jià)結(jié)合物，放大異構(gòu)體多肽之間的立體差異，增加淌度分離，可用于鑒定DAACP。酸的結(jié)構(gòu)和配合物離子類型可顯著影響分離效果。Zimnicka 等[9]使用TWIMS 法，以手性結(jié)構(gòu)羧酸或磺酸的單酸、二酸改善含Arg 殘基多肽的遷移，由于靜電力作用，多肽的堿性基團(tuán)和酸的配合物足夠穩(wěn)定，這一研究也為后續(xù)各種體系中的堿性氨基酸殘基的計(jì)數(shù)和鑒定奠定了的基礎(chǔ)[16]。

2.2 手性氣體添加

手性離子淌度譜（Chiral ion mobility spectrum，CIMS）是在漂移氣體中添加揮發(fā)性手性試劑提供不對稱環(huán)境，以離子與手性氣體的立體特異性相互作用分離鑒定DAACPs 離子。

Dwivedi 等[17]以（S）-（+）-2-丁醇為手性改性劑，分離阿替洛爾、絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸等手性化合物。發(fā)現(xiàn)手性修飾劑會(huì)降低遷移率，但對映異構(gòu)體的遷移率變化存在差異。雖然缺乏對映體分離的具體數(shù)據(jù)，但該方法為DAACPs 的鑒定提供了方向。

2.3 溶劑添加劑

溶劑中加入添加劑可使形狀緊密的離子分離。N-叔丁基羰基-O-芐基-L-絲氨酸作為移位試劑，在DIMS 中實(shí)現(xiàn)了氨基酸色氨酸和苯丙氨酸對映異構(gòu)體的分離[18]。He 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，甘油可影響牛血清白蛋白（BSA）空間結(jié)構(gòu)，引起B(yǎng)SA 平均電荷和CCS 增加。這為DAACPs 分離方法的開發(fā)提供了一種思路。

2.4 金屬離子

在溶液中加入金屬離子，由于有些金屬離子可以帶多重電荷，可能會(huì)最大限度地改善分子的聚集狀態(tài)，從而改變異構(gòu)體的離子化模式，提高分辨率。Fouque等[20]觀測了多肽WKYMVM 與K+結(jié)合后的金屬離子化肽段，雖然峰值寬度幾乎沒有變化，但肽段中D-氨基酸的CCS 增加了0.9%（2.6 A2），而L-異構(gòu)體的CCS 增加了1.6%（4.8 A2），使其在低掃描速率下實(shí)現(xiàn)完全分辨率（R=1.0）。

2.5 二聚體及寡聚體

Pang 等[21]用IM-MS 研究了achatin I 和皮素肽異構(gòu)體的單體、二聚體和寡聚體，發(fā)現(xiàn)二聚體的淌度差異較單體更大，表明二聚體和寡聚體在一定條件下增強(qiáng)了多肽異構(gòu)體分離差異。

2.6 基于儀器自身改造的D/L-異構(gòu)體分辨率提高的策略

DTIMS 最早出現(xiàn)，其分辨率約在60 左右。TWIMS則在更小的儀器結(jié)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)與DTIMS 相似的分辨率。經(jīng)過幾代發(fā)展，無損離子淌度儀（Structures for Lossless Ion Manipulations，SLIM）可以在較低氣壓下工作，在射頻聚焦電場的輔助下，離子可以在SLIM 中穩(wěn)定存儲(chǔ)數(shù)小時(shí)，并實(shí)現(xiàn)近乎無損的傳輸，提高檢測靈敏度[22]。高分辨環(huán)狀離子淌度儀也是TWIMS 的一種，可在漂移管中多圈掃描，將離子分辨率提高至200 左右[23]。DIMS 通過高低電場周期性交替使帶電粒子在電極之間鋸齒狀運(yùn)動(dòng)，并通過離子遷移率對非線性電場的依賴性而產(chǎn)生分離，但靈敏度較低。捕獲式離子淌度質(zhì)譜（Trapped ion mobility spectrometer，TIMS）設(shè)備以緊湊的形式提供R 高達(dá)400，且易與各種質(zhì)譜組合。

離子淌度質(zhì)譜儀的分辨率依賴于其工作原理、漂移管結(jié)構(gòu)以及長度，通過儀器原理和硬件結(jié)構(gòu)的變遷，能夠有效地改善其遷移率，從而提高DAACPs 的分辨率。

3 IM-MS 數(shù)據(jù)處理策略

3.1 三維手性鑒定平臺

D/L-異構(gòu)體在商業(yè)IM-MS 儀器上的分辨能力仍是關(guān)鍵的限制因素。雖在近幾年已取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，發(fā)展快速和有效的分析策略來進(jìn)行光學(xué)不純肽異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)鑒別仍是研究重點(diǎn)。在無法快速更新儀器硬件的情況下，多維手性差異放大和多維分離技術(shù)的應(yīng)用十分必要。

Li 等[24]開發(fā)了基于金屬離子結(jié)合的多維手性剖析平臺（iCAP）,通過對金屬結(jié)合配合物在三維空間中的CCS 值的三維散射，使數(shù)據(jù)可視化，同時(shí)解決了三個(gè)挑戰(zhàn)：通過金屬離子增強(qiáng)多維異構(gòu)體鑒別；利用生長曲線直接讀出Aβ 片段齊聚過程，并評價(jià)齊聚過程中的手性效應(yīng)；基于碰撞誘導(dǎo)展開（CIU-IM-MS）測量和基于表面等離子體共振（Surface plasma resonance，SPR）的動(dòng)力學(xué)分析，可靠地可視化手性識別誘導(dǎo)的受體結(jié)構(gòu)變化。三維分析具有更好的空間分布，隨著待測離子與銅離子結(jié)合量的增加使分離尺寸增加，D/L-異構(gòu)體之間的分離效率顯著提高[25]。

3.2 CCS 值查詢與預(yù)測

目前CCS 查詢和預(yù)測方法主要包括機(jī)器學(xué)習(xí)和理論計(jì)算兩種方式。

3.2.1 機(jī)器學(xué)習(xí)

CCSbase 是一個(gè)綜合平臺，包括CCS 測量數(shù)據(jù)的綜合數(shù)據(jù)庫，以及高質(zhì)量和高通量CCS 預(yù)測模型。通過使用基于MQNs 的無監(jiān)督聚類對化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分解，可以訓(xùn)練出每個(gè)聚類的特定和準(zhǔn)確的預(yù)測模型，這優(yōu)于使用所有數(shù)據(jù)訓(xùn)練的單一模型的性能?？蓪Σ煌幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行高精度的CCS 預(yù)測模型的穩(wěn)健訓(xùn)練和描述[14]。

MetCCS predictor 的功能包括CCS 值預(yù)測、MetCCS 數(shù)據(jù)庫搜索和代謝物匹配功能，只需導(dǎo)入一種代謝物的7 個(gè)及以上數(shù)量常見分子描述符就可在幾秒鐘內(nèi)預(yù)測出CCS。Zhou 課題組[26]開發(fā)了一種采用支持向量回歸（SVR）算法預(yù)測代謝物CCS 值的方法，預(yù)測精確度在3%左右，優(yōu)于理論計(jì)算法，但該方法目前還不支持在多肽和蛋白中的應(yīng)用。

CCSondemand 軟件是Waters 聯(lián)合推出的一款機(jī)器學(xué)習(xí)軟件，可用于模擬潛在代謝物結(jié)構(gòu)并獲取理論CCS 預(yù)測值，有助于進(jìn)一步了解代謝物結(jié)構(gòu)。

3.3.2 理論計(jì)算類

理論驅(qū)動(dòng)的方法通常使用分子建模來產(chǎn)生分子的三維和電子結(jié)構(gòu)的近似，然后通過模擬漂移氣體和分析物離子之間的相互作用計(jì)算CCS 值。這些方法的好處是植根于堅(jiān)實(shí)的理論原理，但根據(jù)細(xì)節(jié)的程度，計(jì)算可能變得非常費(fèi)時(shí)和費(fèi)力[27]。此外，根據(jù)所選方法的理論所做的假設(shè)，也可能會(huì)引入系統(tǒng)誤差，并且在不引入偏差的情況下很難進(jìn)行糾正。CCS database 是一種基于理論計(jì)算的CCS 查詢工具，含3334 個(gè)化合物，但無預(yù)測功能[28]。Colby 等[29]開發(fā)的ISiCLE 通過使用分子動(dòng)力學(xué)、量子化學(xué)和離子淌度計(jì)算來生成結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)庫，大大提高了計(jì)算效率的數(shù)量級，且優(yōu)于其他基于密度泛函理論（Density Functional Theory，DFT）的方法和機(jī)器學(xué)習(xí)方法。

4 基于IM-MS 的DAACP 修飾位點(diǎn)鑒定策略

IM-MS 不僅可以實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體肽段的分離，還可鑒定D-氨基酸殘基位點(diǎn)[30]。多肽異構(gòu)體首先被LC分離，借助CID 產(chǎn)生y+和b+碎片離子，以碎片離子的淌度漂移時(shí)間偏移作為D-氨基酸殘基確定的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)修飾位點(diǎn)的鑒定。

Jia 等[8]將該消旋化位點(diǎn)策略應(yīng)用于美洲龍蝦中的CHHs 肽生物樣本鑒定，通過IMS 的差異信號放大作用，鑒定到D-氨基酸位于末端的苯丙氨酸。

5 基于IM-MS 的DAACP 定量策略

離子淌度質(zhì)譜法在含量測定中也有所應(yīng)用。Guo課題組[31]采用IM-MS/MS 技術(shù)研究了電噴霧電離下亮氨酸和異亮氨酸的電離行為與其原單體之間的定量關(guān)系。結(jié)果表明，羧基質(zhì)子化離子的豐度與氨基酸濃度成正比，可用于定量分析。Dittmar 等[32]采用TIMS-Q TOF MS 進(jìn)行靶向肽定量方法研究，通過正交分析，在30 min 內(nèi)檢測到了大約200 個(gè)肽，并且成功量化了添加在HeLa 細(xì)胞提取物中的合成肽。

6 總結(jié)與展望

IM-MS 為化合物立體異構(gòu)體分析提供了一個(gè)額外的維度，其在DAACPs 分離檢測中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，不僅為具有一定生物活性的DAACPs 發(fā)現(xiàn)提供了可行的檢測手段，也有望為某些疾病的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，以及蛋白質(zhì)多肽類藥物中DAACPs 的研究奠定基礎(chǔ)。雖然目前，IM-MS 儀器的更新?lián)Q代已經(jīng)很大程度上改善了異構(gòu)體的分離，然而這種分離度的提高是在犧牲一定的檢測靈敏度的基礎(chǔ)上的，因此仍需要不斷地優(yōu)化儀器的原理和結(jié)構(gòu)，以同時(shí)滿足靈敏度和分離度需求。