基于礦物元素結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)煙葉溯源

蘇贊 林濤 胡逸超 程新勝

摘要［目的］通過測定煙葉礦物元素的含量結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法建立關(guān)于煙葉溯源的特征指紋圖譜，并對方法的準(zhǔn)確性和可靠性進(jìn)行驗證。［方法］采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀結(jié)合微波濕法消解分析種植于5個不同地區(qū)土壤的25個煙葉樣品中礦物元素的含量，對所得到的元素含量進(jìn)行單因素方差分析、主成分分析和典型判別分析。［結(jié)果］種植于不同地區(qū)土壤的煙葉中礦物元素含量存在明顯差異。利用主成分分析得到的前2個主成分能夠充分反映原始數(shù)據(jù)信息，并且利用對煙葉中礦物元素含量的分析，實現(xiàn)了種植于不同地域土壤中煙葉的產(chǎn)地溯源。結(jié)合Fisher判別分析進(jìn)行驗證并用“留一法”進(jìn)行交叉檢驗，得到了理想的驗證結(jié)果，其正確判別率均達(dá)到了100%。［結(jié)論］基于煙葉中礦物元素含量的特異性差異可以對煙葉進(jìn)行正確的溯源分析。

關(guān)鍵詞煙草；礦物元素；化學(xué)計量學(xué)；地理來源；主成分分析；判別分析

中圖分類號TS47? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A? 文章編號05176611（2024）07019204

doi：10.3969/j.issn.05176611.2024.07.045

Geographical Identification of Tobacco Leaf Based on Inorganic Elements Combine Chemometrics Method

SU Zan1， LIN Tao2， HU Yi-chao1 et al

（1.China Tobacco Guangxi Industrial Co.，Ltd.，Nanning，Guangxi 530001;2.Institute of Advanced Technology， University of Science and Technology of China， Hefei，Anhui 230000）

Abstract［Objective］To establish the characteristic fingerprint of tobacco traceability by the determination of mineral elements in tobacco leaves combined with chemometrics method， and to verify the accuracy and reliability of the method. ［Method］The contents of inorganic elements in 25 tobacco leaf samples planted in soils from five different areas were analyzed by ICP-OES combined with microwave digestion method. The data matrix was sequentially analyzed by one-way-ANOVA， principal component analysis and discriminant analysis. ［Result］There were significant differences among tobacco leaves planted in different soils about the contents of mineral elements. The first two principal components obtained by principal component analysis could approximately reflect the information of original data， and realized the traceability of tobacco planted in soils from different regions by analyzing the mineral elements contents. Fisher discriminant analysis and leave-one-out cross-validation test were performed to validate these results， ideal verification results were obtained， and the correct discrimination rate were 100%， respectively.［Conclusion］Based on the specific differences of inorganic elements could discriminate the geographical origins of tobacco.

Key wordsTobacco;Mineral element;Chemometrics;Geographical origin;Principal component analysis;Discriminant analysis

建立一套高效的煙葉追溯系統(tǒng)不僅能夠防止非法煙葉流入市場、維持煙葉穩(wěn)定生產(chǎn)，有助于保護(hù)煙草種植者的利益，并確保終端卷煙生產(chǎn)企業(yè)得到穩(wěn)定的原料供應(yīng)。煙葉溯源有助于卷煙企業(yè)確定煙葉原料的原產(chǎn)地和特征，并向下游企業(yè)和顧客反饋產(chǎn)品質(zhì)量信息；煙葉供應(yīng)鏈上的企業(yè)在發(fā)現(xiàn)煙葉質(zhì)量、安全性問題時追溯其來源，確定問題所在及形成的原因。

植物源性農(nóng)產(chǎn)品溯源技術(shù)目前在國際上已經(jīng)得到了快速發(fā)展與應(yīng)用。農(nóng)產(chǎn)品溯源是基于產(chǎn)自不同地域農(nóng)產(chǎn)品中的特異性指標(biāo)，建立指紋圖譜庫進(jìn)行對不同地區(qū)的同類產(chǎn)品進(jìn)行區(qū)分鑒別。如利用礦物元素鑒別植源性農(nóng)產(chǎn)品來源的理論基礎(chǔ)是這些農(nóng)產(chǎn)品不能自發(fā)地合成這些礦物元素，只能從土壤中獲取這些元素，不同類型土壤的理化性質(zhì)和有機物質(zhì)組成有較大的差異，植物礦物元素組成與土壤組成有著直接關(guān)系，從而導(dǎo)致其栽培的農(nóng)作物中化學(xué)成分含量有很大差異；與此同時大部分礦物元素的理化性質(zhì)穩(wěn)定，短時間內(nèi)很難自發(fā)流失［12］。國際上已經(jīng)有很多利用農(nóng)產(chǎn)品中礦物元素的差異結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對一些農(nóng)產(chǎn)品（如蜂蜜［3］、水稻［4］、小麥［5］、牛奶［6］、柑橘［7］、大蒜［8］、葡萄酒［9］等）進(jìn)行溯源鑒別分析的報道。有關(guān)煙葉中礦物元素的研究也有很多［1011］，但是關(guān)于利用礦物元素對煙葉進(jìn)行溯源的研究卻鮮見報道。該試驗采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測定煙葉中鋁（Al）、鈣（Ca）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鋅（Zn）、鉻（Cr）、鍶（Sr）7種目標(biāo)礦質(zhì)元素的含量，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對煙葉進(jìn)行溯源分析，旨在為煙葉產(chǎn)地溯源建立指紋圖譜數(shù)據(jù)庫模型提供參考。

1材料與方法

1.1試材

硝酸（68%）、高氯酸（70%）、過氧化氫（30%），上海國藥試劑有限公司，所有試劑級別都是優(yōu)級純；1 000 mg/L的Al、Ca、Mn、Fe、Zn、Cr、Sr單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液購買自中國鋼鐵研究院，使用前用超純水稀釋成一系列不同的濃度；生物標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)灌木枝葉組合樣GBW 07603購買于地礦部物化探研究所；超純水（18 MΩ/cm）由MilliQ Element系統(tǒng)制備得到。

1.2儀器

Optima 7300DV 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICPOES）購自美國珀金埃爾默儀器公司；電子分析天平（精確度0.000 1 g）購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；FA1004冷凍干燥機購自上海比朗科技公司；MARS微波消解儀購于美國培安CEM公司；MilliQ超純水儀購自美國Millipore公司。試驗過程中所有的器皿使用前均用10%的稀硝酸浸泡，然后沖洗干凈烘干后再使用。

1.3試驗方法

1.3.1樣品采集。

從安徽蕪湖、廣東韶關(guān)、福建三明、云南曲靖和安徽合肥5個地區(qū)采集土樣。采樣地點地理信息如表1所示，以上這5個采樣地區(qū)（合肥除外）都是我國重要的煙葉種植區(qū)域［12］。采樣地點在煙草生產(chǎn)地塊中隨機選取的，取樣方法采用五點取樣法，且采樣土壤的前茬作物均是煙草。取表層土（15～30 cm深）約50 kg并帶回實驗室，在種植煙葉之前，將土壤中的腐根和爛葉去除。將呈塊狀的土壤弄碎，所有土壤準(zhǔn)確加入相同比例的煙葉復(fù)合肥［13］（N∶P2O5∶K2O=1∶1∶3）（質(zhì)量比400∶1，土壤∶復(fù)合肥），然后分為8份，每份裝入同一大小的口徑約為20 cm的塑料盆缽中待移栽煙葉幼苗。

煙苗（云煙97）是取自安徽省煙草公司皖南煙葉公司，選取長勢一致的煙苗，移栽到裝有不同地區(qū)土壤的塑料盆缽中，每隔3 d澆灌一次清水，初花期打頂，每株保留16片葉，待中部葉成熟后，一次性采集中部8片葉（下面去4片、頂部去4片），每種土壤處理選取5株長勢相同的煙株，將各單株葉片采收后懸于室內(nèi)避光處晾制，晾制前用毛刷去除煙葉表面粉塵與雜物。30 d后將各單株葉片烘干，干燥后用研缽粉碎，過100目（150 μm）篩，然后用塑料密封袋密封并標(biāo)記冷藏保存，待進(jìn)一步分析。

分別收集5份土壤樣品在70 ℃的恒溫干燥箱內(nèi)烘干過夜，用研缽研碎并過100目篩，然后用塑料密封袋密封并標(biāo)記冷藏保存，待進(jìn)一步分析。

1.3.2樣品制備。

準(zhǔn)確稱量均質(zhì)化的煙葉粉末0.5 g（精確到0.000 1 g）并轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯（PFA）消解罐中，加入4 mL濃HNO3、1 mL HClO4和1 mL H2O2后靜置過夜，第2天再加入2 mL硝酸，然后裝入消解罐內(nèi)再放入微波消解儀內(nèi)，并按照表2所示的升溫程序進(jìn)行消解［1011］。消解完畢待溫度降至低于40 ℃后取出消解罐，將消解后的澄清溶液轉(zhuǎn)移至聚對苯二甲酸類塑料（PETP）容量瓶中，用超純水洗滌PFA消解罐3次，洗滌液也轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用超純水定容至100 mL。采用上述相同的方法消解3個灌木枝葉標(biāo)準(zhǔn)品，并制備一組溶劑空白溶液。

1.3.3無機元素測定。

由于ICPOES具有優(yōu)良的重現(xiàn)性和精確度，常用來測定動植物組織中礦物元素的含量［2，813］。該試驗采用ICPOES對煙葉中目標(biāo)礦物元素進(jìn)行測定，結(jié)合前人的檢測方法［1417］，此次試驗中所選的波長如表3所示。

1.4數(shù)據(jù)分析

對煙葉中的所有原始數(shù)據(jù)統(tǒng)一濃度（平均值±方差，mg/kg）表示。為消除不同元素之間的差異性，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前對所有原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用單因素方差分析比較分析不同土壤種植的煙葉樣品中礦物元素的差異，利用主成分分析將25個煙葉樣品進(jìn)行聚類分析，再利用Fisher函數(shù)典型判別分析評估驗證主成分分析聚類方法對煙葉種植土壤來源的判別的可行性和準(zhǔn)確性［18］。主成分分析和典型判別分析都是通過降維的思想，在原始信息大部分被保留的前提下，將多個變量轉(zhuǎn)化為幾個綜合變量的多元統(tǒng)計分析方法［1820］。不同于主成分分析，典型判別分析是有管理模式的模式識別方法，也就是說主成分分析是無監(jiān)督式學(xué)習(xí)而典型判別分析是監(jiān)督式學(xué)習(xí)［1820］?！傲粢环ā苯徊骝炞C的原理是每個樣品數(shù)據(jù)都是按照從該數(shù)據(jù)矩陣以外的所有其他數(shù)據(jù)集派生的函數(shù)來進(jìn)行分類［19］。以上所有數(shù)據(jù)分析都是利用IBM SPSS 19.0和MATLAB 2010來實現(xiàn)。

2結(jié)果與分析

2.1礦物元素分析方法準(zhǔn)確度檢驗

為了考察所選用的微波消解結(jié)合ICPOES檢測方法測定煙葉中礦物元素含量的準(zhǔn)確性和可靠性，試驗過程中平行測定了國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)灌木枝葉（GBW 07603）［2122］，測定的值均在參考值范圍內(nèi)（表3），表明該方法適用于植物組織的礦物元素含量的測定?；厥章实臏y定方法是隨機挑選一個已測煙葉樣品，然后加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，再次檢測濃度，回收率在89.7%～106.2%，說明穩(wěn)定性良好。參照BrzezichaCirocka等［23］的方法，將空白溶液平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差定義為檢出限（LOD），由表3可知，7種礦質(zhì)元素的檢出限為0.010～0.538 μg/g。

2.2煙葉中礦物元素的含量

分別對種植在5個不同地區(qū)土壤的煙葉中礦物元素含量進(jìn)行檢測并進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），種植在不同地區(qū)土壤上的煙葉中所有目標(biāo)元素（Al、Ca、Mn、Fe、Zn、Cr、Sr）間均存在明顯差異，說明土壤對煙葉中礦物元素含量的影響明顯。煙葉中礦物元素含量從大到小依次是Ca>Fe>Al>Mn>Sr>Zn>Cr。

2.3主成分分析

利用上述7個元素作為分析參數(shù)因子，對5個地區(qū)的煙葉樣品進(jìn)行產(chǎn)地主成分分析。通過主成分分析，得到6個有效主成分，選取第1、第2主成分進(jìn)行得分分析。第1主成分貢獻(xiàn)率為46.109%，第2主成分貢獻(xiàn)率為28.623%，前2個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到了74.732%，達(dá)到可充分反映原始數(shù)據(jù)信息的要求［24］。此外，基于這些元素進(jìn)行主成分分析的KaiserMeyerOlkin（KMO）檢測結(jié)果是0.517，巴特利特球形檢驗的結(jié)果為df=21，P<0.001，表明使用7個元素的濃度數(shù)值作為參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析是可行的［25］。各主成分荷載表達(dá)式（F1、F2）如下所示：

F1=0.359Al0.469Ca+0.456Mn+0.280Fe+0.061Zn+0.358Cr0.481Sr

F2=0.062Al0.337Ca+0.334Mn0.571Fe+0.607Zn0.152Cr+0.230Sr

以第1、第2主成分作為坐標(biāo)系，將25個煙葉樣品進(jìn)行聚類分析的得分圖如圖1所示。第1、第2主成分可以將25個煙葉樣品完全正確區(qū)分，判別準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

2.4典型判別分析為了驗證主成分分析的分類結(jié)果，對7個元素含量的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行Fisher典型判別分析，典型判別分析函數(shù)系數(shù)表達(dá)式如下：

函數(shù)1=0.765Al0.197Ca+0.553Mn+1.892Fe0.120Zn0.035Cr2.188Sr

函數(shù)2=0.292Al0.341Ca+0.788Mn0.878Fe+0.578Zn0.177Cr+0.915Sr

從圖2和表5可以看出，利用判別分析能夠?qū)?5個煙葉樣品完全區(qū)分，準(zhǔn)確率達(dá)到了100%，采用“留一法”對數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗證，交叉驗證的準(zhǔn)確率也是100%。

3結(jié)論

該研究采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀結(jié)合微波濕法消解分析了種植于5個不同地區(qū)土壤的25個煙葉樣品中礦物元素的含量，對所得到的元素含量進(jìn)行單因素方差分析、主成分分析和典型判別分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)種植于不同地區(qū)土壤的煙葉中礦物元素含量存在明顯差異，表明植物體內(nèi)的生物元素組成與土壤密切相關(guān)。利用主成分分析得到的前2個主成分能夠充分反映原始數(shù)據(jù)信息，并且利用對煙葉中礦物元素含量的分析，實現(xiàn)了種植于不同地域土壤中煙葉的產(chǎn)地溯源。將礦物元素作為因素進(jìn)行Fisher函數(shù)典型判別分析在小范圍內(nèi)區(qū)分煙葉植株的來源，其初始正確率達(dá)到了100%，用“留一法”進(jìn)行交叉驗證檢驗的正確識別率同樣達(dá)到100%，說明可以通過煙葉中的礦物元素含量差異對煙葉進(jìn)行溯源。建立基于礦物元素結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可以為煙葉生產(chǎn)和進(jìn)出口質(zhì)量控制建立指紋圖譜數(shù)據(jù)庫模型提供參考依據(jù)，可以對煙葉進(jìn)行快速溯源鑒別。此外，對于今后煙葉種植過程中應(yīng)根據(jù)不同地域的背景差異從有機肥料和特殊比例復(fù)合肥料等方面進(jìn)行深入研究。

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基金項目廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司資助項目（2021450000340033）。

作者簡介蘇贊（1980—），男，廣西梧州人，農(nóng)藝師，從事煙葉原料質(zhì)量研究。

通信作者，農(nóng)藝師，碩士，從事植物病理和生物技術(shù)研究。