基于血清藥物化學(xué)的烏蕨效用成分研究

黃斌　吳先昊　趙詩(shī)云　李雪　胡燕珍　張媛媛　陳樂(lè)

【摘 要】 目的：對(duì)烏蕨活性部位進(jìn)行血清藥物化學(xué)研究，分析其體內(nèi)入血成分。方法：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，通過(guò)對(duì)比浸膏、空白血清和含藥血清的圖譜差異，解析烏蕨活性部位浸膏經(jīng)大鼠灌胃后血清中的原型成分和代謝產(chǎn)物。結(jié)果：從血清中鑒定了30個(gè)吸收入血成分，其中3個(gè)為原型成分，27個(gè)為代謝產(chǎn)物。結(jié)論：該研究較為全面的闡釋了烏蕨抗炎活性部位在大鼠血中的移行成分，為進(jìn)一步研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 烏蕨；血清藥物化學(xué)；抗炎；UPLC-Q-TOF-MS/MS

【中圖分類號(hào)】R28 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2024）05-0055-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.05.zgmzmjyyzz202405011

Study on Effective Components of Stenoloma Chusanum Based on Serum Medicinal Chemistry

HUANG Bin，2 WU Xianhao ZHAO Shiyun LI Xue HU Yanzhen，2 ZHANG Yuanyuan，2 CHEN Le，2*

Abstract：Objective To study the serum medicinal chemistry of the active part of Stenoloma chusanum and analyze its blood entering components in vivo. Methods UPLC-Q-TOF-MS/MS technology was used to analyze the prototype components and metabolites in the serum of the active fraction extract of Stenoloma chusanum after intragastric administration in rats by comparing the differences in the chromatograms of the extract， blank serum， and medicated serum.Result 30 absorbed components were identified from the serum， of which 3 were prototype components and 27 were metabolites. Conclusion This study provides a comprehensive explanation of the migration components of the anti-inflammatory active site of the Stenoloma chusanum in rat blood， laying the foundation for further research on its pharmacological substance basis and mechanism of action.

Keywords：Stenoloma Chusanum; Serum Pharmacochemistry；Anti-inflammatory；UPLC-Q-TOF-MS/MS

烏蕨（Stenoloma chusanum Ching）又稱烏韭、苦黃連、大葉金花草等，為陵齒蕨科烏蕨屬多年生草本植物［1］。烏蕨中以黃酮類、有機(jī)酸類化合物為主要成分，研究表明烏蕨具有保肝、降血糖、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、解毒等作用［2-3］，《江西草藥》《中藥大辭典》《貴州中草藥名錄》、廣西中藥志》等都記載烏蕨用來(lái)治療痢疾、燙傷、支氣管炎、肝炎、黃疸等疾病。臨床上主要用于治療小兒細(xì)菌性或病毒性感染，如支氣管炎、肺炎、扁桃體炎及腸胃炎等疾?。?］。

文獻(xiàn)表明烏蕨乙酸乙酯部位提取物能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹［5］；本課題組前期對(duì)烏蕨抗炎活性篩選發(fā)現(xiàn)，烏蕨乙酸乙酯部位可顯著改善大鼠急性咽喉炎癥狀［6］，本實(shí)驗(yàn)旨在研究烏蕨抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析烏蕨乙酸乙酯部位血中移行成分，為進(jìn)一步探討烏蕨抗炎機(jī)制通路奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AB-Sciex 5600系列LC/MS Trap型質(zhì)譜儀，Waters C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），PeakView 1.2軟件；TDL-80-2B低速離心機(jī)、TCL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）。

1.2 材料 原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊素、木犀草苷、秦皮乙素、牡荊素葡萄糖苷（批號(hào)分別為110809-201906，110810-201608，111687-201704，11720-201106，741-200105，111979-201501，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院），葒草苷（批號(hào)：B20509，上海源葉生物科技有限公司）。健康雄性SPF級(jí)SD大鼠（180±20）g購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)CCXK（贛）2018-0003。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 取烏蕨藥材1 kg，按料液比1∶15，用60%乙醇溶液回流提取3次，濃縮成浸膏，加適量水混懸，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，最后得乙酸乙酯部位浸膏31.2 g，加蒸餾水適量制備成生藥量為2 g/mL的混懸液，冷藏備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取各對(duì)照品適量，制備成濃度約為40 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 空白血清及含藥血清的制備 取雄性SD大鼠12只，隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組6只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，全程不禁水?？瞻捉M給予蒸餾水灌胃，給藥組均按20 g/kg生藥量進(jìn)行灌胃給藥，早晚各一次，連續(xù)給藥3天，最后一次給藥后，分別于60 min、120 min、240 min，從大鼠股動(dòng)脈放血，靜置30 min，離心10 min（4000 r/min），吸取上清液，即得血清供試品，于-80 ℃冰箱存儲(chǔ)備用。

2.4 含藥血清樣品的處理 各時(shí)間點(diǎn)分別取200 μL血清樣品并混合，得600 μL混合血清樣本，加入3倍量的乙腈，渦旋混合3 min，離心10 min（12000 r/min），取上清液，重復(fù)操作一次，上清液置EP管中，37 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.5 色譜條件 色譜柱為Waters C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%～30% A；20～25 min，30%～100% A；25～30 min，100%-100% A）柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，流速為0.25 mL/min。

2.6 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），掃描方式為負(fù)離子模式（ESI-，M/Z：100-1250 Da）；噴霧電壓（IS）為-4500 V，霧化氣溫度（TEM）為500 ℃，氣簾氣（CUR）為40.00 Psi，霧化氣（GS1）為50.00 Psi，輔助加熱氣（GS2）為50.00 Psi，去簇電壓（DP）為-100 V，碰撞能量（CE）為-40 V，碰撞能量疊加（CES）為15 V。

3 結(jié)果

通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS檢測(cè)，并經(jīng)過(guò)與對(duì)照品、文獻(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)比對(duì)，初步鑒定30種血中移行成分，其中3個(gè)為原型成分，27個(gè)為代謝產(chǎn)物，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，各樣品總離子流圖如圖1所示。

3.1 入血原型成分的解析 化合物2在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 153［M-H］-，二級(jí)碎片m/z 109［M-H-CO2］-，m/z108 ［M-H-HCO2］-，與對(duì)照品及文獻(xiàn)［7］比對(duì)，鑒定為原兒茶酸。化合物13在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 179［M-H］-，二級(jí)碎片 m/z 135［M-H-CO2］-，m/z134 ［M-H-HCO2］-，與文獻(xiàn)［7］比對(duì)，鑒定為咖啡酸。

3.2 代謝產(chǎn)物的解析 原兒茶酸代謝途徑分析：化合物1在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 233［M-H］-，二級(jí)碎片m/z 153［M-H-SO3］-，m/z 109［M-H-SO3-CO2］-；化合物3在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 329［M-H］-，二級(jí)碎片m/z 153［M-H-GluA］-，m/z 109［M-H-GluA-CO2］-；化合物6在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 247［M-H］-，二級(jí)碎片m/z 167［M-H-SO3］-，m/z 152［M-H-SO3-CH3］-，m/z 108［M-H-SO3-CH3-CO2］-；化合物7在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為為m/z 189［M-H］-，二級(jí)碎片m/z 109［M-H-SO3］-，m/z 108［M-2H-SO3］-，m/z 153，m/z 109，m/z 108為原兒茶酸的特征碎片離子，結(jié)合參考文獻(xiàn)［8］，推測(cè)化合物1為原兒茶酸硫酸化產(chǎn)物，化合物3為原兒茶酸葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，化合物6為原兒茶酸甲基化和硫酸化產(chǎn)物，化合物7為原兒茶酸脫羧后的硫酸化產(chǎn)物。代謝途徑如圖2所示。

木犀草素代謝途徑分析：化合物23在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 637［M-H］-，二級(jí)碎片m/z 461［M-H-GluA］-，m/z 285［M-H-GluA-GluA］-；化合物25在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 475［M-H］-，二級(jí)碎片m/z 299［M-H-GluA］-，m/z 284［M-H-GluA-CH3］-；化合物26在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 541［M-H］-，二級(jí)碎片m/z 461［M-H-SO3］-，m/z 285［M-H-SO3-GluA］-。m/z 285為木犀草素的特征離子，結(jié)合參考文獻(xiàn)［9］，推測(cè)化合物23為木犀草素雙葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，化合物25為木犀草素甲基化和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，化合物26為木犀草素硫酸化和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。代謝途徑如圖3所示。

4 討論

中藥成分復(fù)雜，不同成分的體內(nèi)過(guò)程具有不同的藥動(dòng)學(xué)特征，為了更全面表征烏蕨乙酸乙酯部位的血中移行成分，結(jié)合文獻(xiàn)［10-11］選擇將60 min、120 min、240 min的血清樣本混合進(jìn)行分析；同時(shí)比較了乙腈和甲醇對(duì)血清樣本的除雜效果，發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀效果明顯強(qiáng)于甲醇；目前對(duì)烏蕨質(zhì)量控制的研究多以原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素、木犀草苷等為主要指標(biāo)性成分，本次對(duì)烏蕨乙酸乙酯部位浸膏灌胃大鼠血清中移行成分研究中發(fā)現(xiàn)原兒茶酸、原兒茶醛、木犀草素相關(guān)代謝產(chǎn)物，未發(fā)現(xiàn)葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷原型成分及相關(guān)代謝產(chǎn)物，文獻(xiàn)［12-14］表明牡荊素等黃酮碳苷首過(guò)效應(yīng)明顯，胃腸吸收弱，半衰期短，導(dǎo)致選取的目標(biāo)時(shí)間點(diǎn)不合適。

本研究基于中藥血清藥物化學(xué)理論和UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)探討烏蕨乙酸乙酯部位浸膏灌胃大鼠血清中移行成分，共推斷了3個(gè)原型成分和27個(gè)代謝產(chǎn)物，以原兒茶酸、咖啡酸、香草酸、木犀草素代謝產(chǎn)物為主，其代謝類型主要是甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等二相代謝。同時(shí)可推斷原兒茶酸、木犀草素等為烏蕨主要抗炎藥效成分，與文獻(xiàn)資料相吻合，為研究烏蕨藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］秦仁昌.中國(guó)植物志（第2卷）［M］.北京：科學(xué)出版社，1959：275-279.

［2］國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草（第2卷）［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：110-112.

［3］全國(guó)中草藥匯編編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編（上冊(cè)）［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：45.

［4］周潔.壯藥大葉金花草質(zhì)量評(píng)價(jià)研究［D］.南寧：廣西中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

［5］陳明，王恒，趙鴻賓，等. 苗藥烏蕨提取物抗炎作用及其機(jī)制研究［J］. 中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2018，24（2）：46-49.

［6］陳樂(lè)，胡燕珍，吳先昊，等. 烏蕨的不同提取組分治療大鼠急性咽喉炎模型初步研究［J］. 實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2019，19（12）：175-176.

［7］汪丹，蔡甜，吳志軍，等.銀黃清肺膠囊化學(xué)成分的 LC-ESI-MS/MS分析［J］.中國(guó)測(cè)試，2016，42（3）：36-40.

［8］遲明艷，向文英，楊武，等.UPLC-Q-TOF/MS分析頭花蓼提取物在大鼠尿液中的代謝產(chǎn)物［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，（17）：77-80.

［9］梁潔，韋金玉，黃冬芳，等.基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)的龍眼葉入血成分分析［J］.中藥材，2021，44（3）：615-621.

［10］梁風(fēng)塵，周晉華，吳歡，等.超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜快速分析復(fù)方守宮散化學(xué)成分及血中移行成分［J］.安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，41（1）：92-99.

［11］魏婷婷，沈晨，韓園園，等.UPLC-Q-TOF-MS快速鑒定止動(dòng)顆粒血漿及尿液中移行成分［J］.中草藥，2019，50（17）：4244-4253.

［12］吳成舉，柴紀(jì)嚴(yán)，張文潔.牡荊素-4″-O-葡萄糖苷大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（8）：2183-2189.

［13］吳成舉，柴紀(jì)嚴(yán)，張文潔.牡荊素葡萄糖苷在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34（9）：2279-2282.

［14］童成亮，劉曉東.牡荊素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（1）：65-68.

（收稿日期：2023-06-01 編輯：杜玲玉珊）

基金項(xiàng)目：江西省中醫(yī)藥管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019A228）； 江西省中醫(yī)藥中青年骨干人才（第四批）培養(yǎng)計(jì)劃（贛中醫(yī)藥科教字［2020］6號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：黃斌（1990—），男，漢族，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幏治?。E-mail：3279844869@qq.com

通信作者：陳樂(lè)（1982—），女，漢族，碩士，研究員，研究方向?yàn)橹兴幏治?。E-mail：76349830@qq.com