HPLC法測定參苓白術(shù)散中三種成分的含量

劉旭明　辛蕊華　仇正英　李錦宇　劉蓮　王貴波

【摘 要】 目的：建立參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的定量檢測方法。方法：采用HPLC法，以C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈作為流動相A，測定了參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、甘草苷的含量。結(jié)果：蒼術(shù)酮在0.0082～0.1308 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率97.8%（RSD=0.7%，n=6）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在0.0016～0.0256 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率103.4%（RSD=1.8%，n=6）；甘草苷在0.0153 ～0.2444 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率104.2%（RSD=0.5%，n=6）。結(jié)論：本研究成功建立了參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和甘草苷的檢測方法，且方法專屬性強(qiáng)，精密度、重復(fù)性良好。

【關(guān)鍵詞】 參苓白術(shù)散；HPLC；蒼術(shù)酮；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；甘草苷

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）05-0048-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.05.zgmzmjyyzz202405010

Determination of three components in Shenling Baizhu Powder by HPLC

LIU Xuming XIN Ruihua QIU Zhengying LI Jinyu LIU Lian WANG Guibo*

Abstract：Objective A method for the determination of Atractyloketone， Atractylolactone Ⅰ and Liquiritin in Shenling Baizhu Powder was established.Methods The contents of Atractylone， Atractylide Ⅰ and Liquiritin in Shenling Baizhu Powder were determined by HPLC on C18 column （5 μm， 4.6×250 mm） with acetonitrile as mobile phase A.Results Atractylone had a good linear relationship in the concentration range of 0.0082-0.1308 mg/mL， and the average sample recovery rate was 97.8% （RSD=0.7%， n=6）; Atractylide Ⅰ had a good linear relationship in the concentration range of 0.0016-0.0256 mg/mL， and the average sample recovery rate was 103.4% （RSD=1.8%， n=6）; The linear relationship of Liquiritin in the concentration range of 0.0153-0.2444 mg/mL was good， and the average sample recovery rate was104.2% （RSD=0.5%，n=6）.Conclusion In this study， a method for the detection of Atractyloketone， Atractylolactone Ⅰ and Liquiritin in Shenling Baizhu Powder was established successfully， and the method had strong specificity， good precision and repeatability.

Keywords：Shenling Baizhu Powder; HPLC; Atractylone;Atractylide Ⅰ ; Liquiritin

參苓白術(shù)散，出自《太平惠民和劑局方》［1］。由人參、茯苓、炒白術(shù)、甘草、山藥、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁、砂仁、桔梗等十味中藥粉碎混合，過篩制得，具有益氣、健脾、止瀉的功效［2］。該處方中人參、茯苓、炒白術(shù)為君藥，山藥、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁為臣藥，砂仁為佐藥，桔梗、甘草為使藥，可用于脾虛濕盛型泄瀉、脾虛濕阻型腹瀉、肺脾氣虛證慢性鼻竇炎、慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期等的治療［3-7］。處方中白術(shù)有“健脾補(bǔ)氣第一要藥”之稱，主要有效成分是倍半萜類，包括蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等，具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤等功效［8-9］。甘草苷作為甘草的主要活性成分之一，具有抗炎、抗胃潰瘍活性等功效［10］。目前中華人民共和國藥典和獸藥典對于參苓白術(shù)散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅記載薄層色譜法定性鑒別，未見收載相關(guān)成分含量測定項；已有的研究主要應(yīng)用HPLC法等對參苓白術(shù)散中人參的主要成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1、甘草的主要成分槲皮素和蘆丁、白術(shù)的主要成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、砂仁的主要成分樟腦、龍腦和乙酸龍腦酯進(jìn)行了含量測定［15-18］，而對其中的蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的含量研究鮮有報道；且市面上白術(shù)與甘草的質(zhì)量差異很大［11-12］。本試驗將其為切入點，用HPLC法定量測定參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的含量，以期為參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷含量測定法的確立及今后藥典和獸藥典制訂相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；AP-01P真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，美國Agilient公司）；多功能粉碎機(jī)（永康市紅太陽機(jī)電有限公司）。

1.2 材料 蒼術(shù)酮標(biāo)準(zhǔn)品（CAS#6989-21-5，95%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品（CAS#73069-13-3，98%）均購自上海源葉生物科技有限公司，甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品（111610-201908，95%）購自中國食品藥品檢定研究院，色譜純乙腈、甲醇均購自賽默飛；分析純磷酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗所用藥材全部購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所質(zhì)量檢測均合格。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒼術(shù)酮和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量測定

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 精密稱取一定量蒼術(shù)酮和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品粉末于5 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.1.2 供試品溶液制備［8］ 稱取參苓白術(shù)散粉末2.0 g，加入20 mL甲醇，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率50 Hz）30 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足缺失的重量，搖勻后過濾，濾液用0.45 μm濾膜濾過即得供試品溶液。

2.1.1.3 陰性對照溶液制備 去除方劑中的白術(shù)，按2.1.1.2方法制備陰性對照溶液。

2.1.2 色譜條件［8］ C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相A為乙腈，流動相B為水，梯度洗脫程序見表1，柱溫 25 ℃；蒼術(shù)酮檢測波長220 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ檢測波長276 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.3 專屬性試驗 精密吸取蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液，按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1～6所示，參苓白術(shù)散供試品溶液和蒼術(shù)酮標(biāo)準(zhǔn)品、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品在相同時間出現(xiàn)色譜峰，陰性對照無干擾，說明該方法專屬性良好。

2.1.4 線性關(guān)系考察 將2.1.1.1中蒼術(shù)酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至濃度為0.1308 mg/mL、0.0654 mg/mL、0.0327 mg/mL、0.0164 mg/mL、0.0082 mg/mL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至濃度為0.0256 mg/mL、0.0128 mg/mL、0.0064 mg/mL、0.0032 mg/mL、0.0016 mg/mL。按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果如圖7、圖8所示，蒼術(shù)酮的回歸方程為y=10000000X+62991，R2=0.9991；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的回歸方程為y=60000000X-8055.9，R2=0.9997。說明蒼術(shù)酮在0.0082～0.1308 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在0.0016～0.0256 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取2.1.1.1項下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計算出蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積RSD值分別為0.3%、0.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密稱定同一批樣品6份，每份2.0 g，按2.1.1.2方法制備供試液，按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計算出蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量的RSD值分別為1.5%、0.5%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.1.1.2項下供試品溶液，按2.1.2色譜條件分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計算出蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量的RSD值分別為0.7%、1.3%，表明蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱定1g已知含量樣品6份，精密加入濃度為0.327 mg/mL蒼術(shù)酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，濃度為0.064 mg/mL白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按2.1.1.2方法制備供試液，按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)，計算回收率。結(jié)果見表2，蒼術(shù)酮和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ平均加樣回收率分別為97.8%、103.4%，RSD值分別為0.7%、1.8%（n=6）。

2.2 甘草苷含量測定

2.2.1 溶液配制

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 精密稱取一定量的甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品粉末于5 mL容量瓶，加70%乙醇溶解并定容，配制成含甘草苷濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液制備［13］ 精密稱取參苓白術(shù)散粉末2.0 g，加入70%乙醇20 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再次稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足缺失的重量，搖勻后過濾，濾液用0.45 μm濾膜濾過即得供試品溶液。

2.2.1.3 陰性對照溶液制備 去除方劑中甘草，按2.2.1.2方法制備陰性對照溶液。

2.2.2色譜條件［13］ C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫程序見表3；柱溫30 ℃；檢測波長237 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.3 專屬性試驗 精密吸取甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖9～11所示，參苓白術(shù)散供試品溶液和甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品在相同時間出現(xiàn)色譜峰，陰性對照無干擾，說明該方法專屬性良好。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1.1項下甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至濃度為0.2444 mg/mL、0.1222 mg/mL、0.0611 mg/mL、0.0306 mg/mL、0.0153 mg/mL，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果如圖12所示，甘草苷的回歸方程為y=10000000X+16664，R2=0.9994，說明甘草苷在0.0153 ～0.2444 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.1.1項下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計算出甘草苷峰面積RSD值為0.9%（n=6），說明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 精密稱定同一批樣品6份，每份2.0 g，按2.2.1.2方法制備供試品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計算出甘草苷含量的RSD值為1.3%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取2.2.1.2項下供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計算出甘草苷含量的RSD值為1.8%，說明甘草苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取0.5g已知含量樣品6份，精密加入濃度為0.306 mg/mL甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按2.2.1.2方法制備供試品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。結(jié)果見表4，甘草苷平均加樣回收率為104.2%，RSD值為0.5%（n=6）。

2.3 樣品含量測定 分別取3批購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司的中藥飲片，按照藥典要求粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻。取各批參苓白術(shù)散各約2.0 g，分別進(jìn)樣測定，計算制劑中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的含量。結(jié)果見表5。

3 討論

HPLC法具有靈敏度高，方便快速等特點，現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于中藥成分鑒別、含量測定等方面［14］。在參苓白術(shù)散的研究中，多數(shù)研究者利用HPLC法僅對人參皂苷Rg1、Re及Rb1進(jìn)行定量分析［1，15］，個別學(xué)者應(yīng)用HPLC、UPLC和氣相色譜法對甘草黃酮和人參皂苷等進(jìn)行了定量分析［16-18］，而對蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的研究較少。

在對白術(shù)含量測定時，按照丁逸雪等［8］構(gòu)建的色譜條件檢測時所呈現(xiàn)的峰形對稱、分離效果良好，因此直接選用該色譜條件分別考察了100%甲醇溶液、100%乙醇溶液兩種溶劑的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100%甲醇溶液作為溶劑時，檢測到待測成份的含量較高，雜峰較少。此外，也考察了超聲提取時間（20 min、30 min、40 min）對待測成份的影響，結(jié)果表明樣品在100%甲醇溶液中超聲處理30 min時，待測成份已提取完全，該方法在操作上簡單易行。

在對甘草苷含量測定時，參考《中華人民共和國獸藥典》甘草項檢測方法色譜條件及樣品處理方法，對流動相比例稍作調(diào)整用以檢測樣品，結(jié)果顯示峰形對稱、分離效果良好。在樣品制備方面，本試驗所用方法相對于靳雪飛構(gòu)建的供試品溶液制備方法簡單易行，大大節(jié)約了時間成本［19］。以改良后的色譜條件考察了70%乙醇溶液、100%乙醇溶液作為溶劑的提取效果，結(jié)果表明，70%乙醇溶液作為溶劑時，檢測到待測成份的含量較高，雜峰較少；另外也考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液流動相體系洗脫效果，結(jié)果顯示乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相時，甘草苷分離效果較好且峰形對稱。

本研究成功建立了參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和甘草苷的檢測方法，且方法簡單快捷、專屬性強(qiáng)、精密度、重復(fù)性良好，將為確立和進(jìn)一步完善參苓白術(shù)散中相關(guān)成分的定量分析及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］趙薇，姜華，楊景明，等.參苓白術(shù)散質(zhì)量控制方法實驗研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，11（17）：27-28.

［2］WANG X，YANG Q，ZHOU X，et al. Shenling Baizhu Powder Inhibits RV-SA11-Induced Inflammation and Rotavirus Enteritis via TLR4/MyD88/NF-κB Signaling Pathway［J］. Frontiers in Pharmacology，2021（12）：642685.

［3］邵維在，段治尚，萬德生，等.參苓白術(shù)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.大理大學(xué)學(xué)報，2016，1（2）：5-9.

［4］宋春景.參苓白術(shù)散治療脾虛濕盛型泄瀉臨床觀察［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2022，20（6）：93-95.

［5］魏永生.參苓白術(shù)散治療脾虛濕阻型腹瀉型腸易激綜合征患者的療效及復(fù)發(fā)率分析［J］.青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2021，53（6）：415-419.

［6］王小娟.參苓白術(shù)散加減治療肺脾氣虛證慢性鼻竇炎的效果和對患者臨床癥狀的改善評價［J］.中國醫(yī)學(xué)文摘（耳鼻咽喉科學(xué)），2021，36（6）：72-73.

［7］夏慧敏，陳志祥，張華.張華運(yùn)用參苓白術(shù)散加減治療慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期經(jīng)驗介紹［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2021，11（23）：108-111.

［8］丁逸雪，徐繼校，吳威，等.HPLC法同時測定白術(shù)中4種倍半萜［J］.中成藥，2020，42（4）：927-931.

［9］高紅寧，潘雨柔，殷奕，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地麩炒白術(shù)中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2021，28（3）：4-7.

［10］馬曼，雷明珠.HPLC-CAD法測定小建中片中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、異甘草苷、桂皮酸、桂皮醛和甘草酸［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2022，37（3）：503-507.

［11］葉文文，邵毅，胡潤淮. 不同產(chǎn)地與類型白術(shù)質(zhì)量比較研究［C］//第十二次中藥鑒定學(xué)術(shù)會議暨中藥資源保護(hù)與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展國際學(xué)術(shù)交流會論文集，2013：95-100.

［12］楊瑞，李文東，馬永生，等.不同基原甘草的分子鑒定及市售甘草藥材的質(zhì)量評價［J］.藥學(xué)學(xué)報，2017，52（2）：318-326.

［13］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（二部）［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2020：88-89.

［14］劉艷平，曾慶真.高效液相法在中藥檢驗的應(yīng)用［J］.世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（21）：149.

［15］丁濤.參苓白術(shù)散中人參皂苷的含量測定［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012，18（10）：1134-1135.

［16］王悅，王婭玲，鄒婧，等.參苓白術(shù)散中甘草黃酮和人參皂苷測定及抗氧化實驗［J］.當(dāng)代化工，2020，49（7）：1301-1304.

［17］曹淑麗，趙春杰，蔡麗俠，等.UPLC法同時測定參苓白術(shù)散中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和異歐前胡素的含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2018，35（7）：568-573.

［18］王萌萌，王京輝，傅欣彤，等.氣相色譜法測定參苓白術(shù)散中樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯含量［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（12）：56-58.

［19］靳雪飛，何云嬌，張杰，等.HPLC法同時測定甘草中3種成分［J］.中成藥，2020，42（10）：2786-2788.

（收稿日期：2023-06-12 編輯：陶希睿）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFD1602203）；甘肅省科技計劃項目（21CX6NA126）；蘭州市科技計劃項目（2019-4-1）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS- ASTIP-2015-LIHPS-06）

作者簡介：劉旭明（1996—），男，漢族，碩士，研究方向為中獸醫(yī)學(xué)。E-mail：Lxm_plasmid@163.com

通信作者：王貴波（1982—）男，漢族，碩士，副研究員，研究方向為中獸醫(yī)學(xué)。E-mail：wangguibo2005@163.com