菠蘿AcNINV家族全基因組分離及表達(dá)分析

吳建陽　陳妹　姚艷麗　張秀梅

摘? ? 要：【目的】鑒定出菠蘿NINV家族全基因組成員，初步闡明NINV基因與蔗糖代謝的關(guān)系?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W(xué)方法鑒定并分析菠蘿NINV家族全基因組成員，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其表達(dá)特性，利用HPLC對(duì)蔗糖含量進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】在菠蘿中共鑒定出6個(gè)NINV基因，分布于5條不同染色體上，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，該基因家族啟動(dòng)子區(qū)域光反應(yīng)元件數(shù)量最多。AcNINV外顯子數(shù)量介于4～6個(gè)之間，其中AcNINV3、6外顯子的數(shù)量為6個(gè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因都分布于葉綠體，屬于α亞族；AcNINV1、2、4、5外顯子的數(shù)量為4個(gè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因都分布于質(zhì)膜，屬于β亞族。在果柄、果皮、果心中表達(dá)量最高的是AcNINV2基因，在果肉中表達(dá)量最高的是AcNINV6基因。蔗糖含量隨著菠蘿果實(shí)成熟呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，而AcNINV4基因在菠蘿果實(shí)成熟過程中呈下調(diào)表達(dá)?！窘Y(jié)論】AcNINV4可能是催化果實(shí)蔗糖降解的水解酶基因。

關(guān)鍵詞：菠蘿（Ananas comosus）；蔗糖含量；堿性/中性轉(zhuǎn)化酶；基因家族；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2024）04-0598-13

Genome-wide identification and expression analysis of AcNINV family in pineapple

WU Jianyang1， 2， CHEN Mei3， 4， YAO Yanli3， 4， ZHANG Xiumei3， 4*

（1Zhanjiang Preschool Education College， Zhanjiang 524037， Guangdong， China; 2Basic Education College of Lingnan Normal University， Zhanjiang 524037， Guangdong， China; 3South Subtropical Crop Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science （CATAS）/Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang 524091， Guangdong， China; 4National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding， Sanya 572024， Hainan， China）

Abstract： 【Objective】 Sucrose plays a crucial role in plant growth and development. The alkaline/neutral invertase （NINV） proteins irreversibly cleave sucrose into fructose and glucose. To date， the genome-wide identification， characterization， and expression profile analysis of the NINV gene families have been reported in many species but not in pineapple. 【Methods】 Genome sequence and annotation data were acquired from the pineapple genome database through the blastp against protein database and the tblastn against genome databases using the query sequences of Arabidopsis thaliana NINV proteins to identify the potential members of the NINV gene families in pineapple. The physicochemical characteristics， including molecular weight （MW）， theoretical isoelectric points （pI）， and instability index were obtained using the ExPASy tool. The CDS sequence and protein length were acquired from the pineapple genome database. The synteny analysis between different species and exon/intron structures were visualized using the TBtools. The conserved motifs of the AcNINV gene families were analyzed using the online MEME tool. The phylogenetic tree was constructed using the MEGA 5.0 through the neighbor-joining approach. The total RNA was isolated in accordance with the method described by Wu et al. RT-qPCR was performed using the LightCycler480 Ⅱ System （Roche， Switzerland） and the DyNAmo Flash SYBR Green qPCR kit （Thermo， USA）. RT-qPCR was performed in a total volume of 10 μL， which contained 1 μL diluted cDNAs and 5 ?L SYBR Green PCR Master Mix， and the primer final concentration was 250 nmol·L-1. The sucrose content was determined by HPLC. 【Results】 In this study， six NINV genes （AcNINV1-6） were identified. The six AcNINV genes were distributed on five different chromosomes （LG1， LG3， LG14， LG17， LG21）. There were two genes on LG21： AcNINV5 and AcNINV6， while another AcNINV gene on the other chromosomes. AcNINV proteins had a length of 556-673 aa and MW between 63.03 and 74.80 ku. Only one collinear NINV gene pair between pineapple and A. thaliana， and eight collinear NINV gene pairs between pineapple and Oryza sativa were identified. The number of exons in the AcNINV ranged from 4 to 6， and the number of introns ranged from 3 to 5. The AcNINV1， 2， 4， 5 possessed 4 exons and 3 introns， the AcNINV3 and AcNINV6 had 6 exons and 5 introns. A total of 10 conserved motifs were predicted in the AcNINV genes. Among them， the AcNINV1， 2， 4， 5 contained 10 conserved motifs， but the AcNINV3， 6 only had 9 conserved motifs and lacked motif10. A phylogenetic tree was constructed by combining six AcNINV genes from pineapple with the amino acid sequences of the NINV gene family from three species， including Arabidopsis， rice， and cassava. Six AcNINV genes were clustered into two subfamilies， i.e.， α and β. The AcNINV1， 2， 4， 5 belonged to clade β， the AcNINV3 and AcNINV6 belonged to clade α. The promoter cis-elements of the AcNINVs were examined using the Plant-CARE database. There were many cis-elements involved in light （MRE， ATC-motif， Box 4， L-box， GATA-motif， G-box， GT1-motif， TCCC-motif， 3-AF1 binding site， LAMP-element， Sp1， TCT-motif， GA-motif， chs-CMA1a， AT1-motif， AE-box）， stress （TC-rich repeats， LTR， ARE， GC-motif） and hormones （ABRE， TGA-element， AuxRR-core， P-box， O2-site， TATC-box， TCA-element， TCA-element， CGTCA-motif， TGACG-motif） in the promoter region. The number of light responsive elements were the largest group， followed by the hormone responsive elements， stress responsive elements. The AcNINV5 had the most cis-elements in light response and hormone response. The AcNINV1 had the most cis-elements in stress response. The sucrose content increased first and then decreased. The sucrose content remained constant on the 20th-40th days after anthesis （DAA）. Afterwards， the sucrose content extensively increased from 40 DAA to 80 DAA and reached the highest value on the 80 DAA， which was 126-fold higher than that at 20 DAA. The sucrose content from 80th DAA to 100th DAA extensively decreased but was still 12-fold higher than that on 20th DAA. The expression of the six AcNINV genes was studied using RT-qPCR during fruit development in pineapple. The expression was significant different among the different AcNINV gene members. The expression of the six AcNINV genes were presented three types. The first type was upregulated， such as the AcNINV2， 3， 6. The second type was downregulated first and then upregulate， but the amplitude of change was not significant， the AcNINV1， 5 belonged to this type. The third type was downregulated， and the AcNINV4 gene belonged to this type. The expression level of the AcNINV4 gene remained almost unchanged on the 20th-40th DAA， but it rapidly decreased from the 40th DAA to the 100th DAA. On the 20th DAA， the AcNINV4 gene expression was five times more than that of the 100th DAA. Meanwhile， RT-qPCR was used to clarify the expression profile of the AcNINV gene families in the different tissues. The AcNINV1 had the highest expression in the peduncle and the lowest expression in the core. The expression level of the AcNINV2， AcNINV3 and AcNINV6 were highest in the pericarp and lowest in the flesh. The expression level of the AcNINV4 and AcNINV5 was the highest in the peduncle and lowest in the flesh. Furthermore， the AcNINV2 gene had the highest expression in the peduncle， pericarp， and core. While the AcNINV6 gene had the highest expression level in the flesh. 【Conclusion】 A total of six NINV genes （AcNINV1-6） were identified and they were distributed on 5 chromosomes in pineapple. The sucrose content increased with the ripening of pineapple fruit， and the AcNINV4 gene was downregulated during the ripening process of pineapple fruit. Therefore， it was speculated that AcNINV4 may be a hydrolytic enzyme gene that may catalyze the degradation of fruit sucrose.

Key words： Pineapple （Ananas comosus）; Sucrose content; Alkaline/neutral invertase; Gene family; Gene expression

菠蘿（Ananas comosus）是鳳梨科的草本植物[1]，是我國(guó)重要的熱帶水果，中國(guó)是世界十大菠蘿生產(chǎn)國(guó)之一。在中國(guó)種植菠蘿的主要省份包括廣東、廣西、海南、云南和福建。2018年，中國(guó)菠蘿產(chǎn)量為162萬t[2]。

蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物[3]，蔗糖的含量直接影響果實(shí)的品質(zhì)和風(fēng)味。蔗糖轉(zhuǎn)化酶是水解蛋白酶，定向水解蔗糖生成果糖和葡萄糖[4]，依據(jù)其在植物細(xì)胞內(nèi)的位置可分為胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和液泡轉(zhuǎn)化酶；依據(jù)其最佳pH 值的不同，液泡轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶又被稱為酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase，AIN），胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶則被稱為堿性/中性轉(zhuǎn)化酶（alkaline/neutral invertase，NINV）[5]。AIN不僅可以水解蔗糖，還能水解其他含β-果糖的寡糖，比如水蘇糖、核糖，但NINV卻專一性地催化蔗糖[4]。由于NINV不穩(wěn)定、易失活，因此對(duì)它的研究報(bào)道不多，生理功能知之甚少[6]，但近些年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，關(guān)于NINV的研究越來越多。

NINV在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有至關(guān)重要的作用，特別是在生殖器和根系的發(fā)育中；在成熟組織中，由于AIN活性低，因此NINV對(duì)蔗糖的分解更為關(guān)鍵[7]。在杏果實(shí)發(fā)育過程中NINV活性與蔗糖的積累呈顯著負(fù)相關(guān)[8]，在草莓果實(shí)發(fā)育過程中也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)論[9]。另外，NINV通過分解蔗糖，激活糖信號(hào)通路和改變滲透勢(shì)進(jìn)而參與植物脅迫防御[10]。

NINV基因首次從大豆下胚軸中分離獲得[11]，NINV由多基因家族編碼，辣椒中有7個(gè)成員[12]，水稻[13]、茶樹[10]、柑橘[14]中有8個(gè)成員，擬南芥[15]和鐵皮石斛[16]中有9個(gè)成員，木薯中有11個(gè)成員[17]，蘋果中有12個(gè)成員[18]，毛果楊中有16個(gè)成員[19]，但在菠蘿中至今還未有NINV基因家族的報(bào)道。筆者借助于菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫，首先全面鑒定出NINV基因家族成員，再分析不同成員在菠蘿果實(shí)成熟過程中的表達(dá)特性，以此初步闡明NINV基因與蔗糖代謝的關(guān)系。本研究結(jié)果豐富了NINV基因在調(diào)控菠蘿蔗糖中的研究?jī)?nèi)容，并將為利用分子生物學(xué)手段培育菠蘿新品種提供重要理論支撐。

1 材料和方法

1.1 植物材料

菠蘿（Ananas comosus ‘Comte de paris）于2019年1—4月采摘于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所菠蘿種資資源庫。共選擇150株長(zhǎng)勢(shì)一致的菠蘿植株進(jìn)行掛牌，從謝花后（days after anthesis，DAA）20 d到果實(shí)成熟期間每10 d隨機(jī)采取9個(gè)大小一致的果實(shí)。將9個(gè)果實(shí)分為3組，每組為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分離后的果肉用于基因表達(dá)分析。另外，選取9株長(zhǎng)勢(shì)一致的成熟菠蘿進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析。樣品在田間收獲后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，并進(jìn)行果肉、葉基、葉柄、果皮、果心的分離，分離的組織放入液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱。

1.2 菠蘿AcNINV基因家族的鑒定

從TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）中下載擬南芥所有NINV基因序列，利用擬南芥NINV基因序列在菠蘿基因組（http：//pineapple.angiosperms.org/pineapple/html/index.html）[20]中進(jìn)行Blast序列比對(duì)，再利用SMART在線軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)所有序列進(jìn)行驗(yàn)證，從而獲得菠蘿AcNINV基因家族所有成員序列。

1.3 序列分析

利用ExPASy工具（https：//web.expasy.org/protparam/）獲得AcNINV基因家族成員分子質(zhì)量（MW）、理論pI、親水性總平均值（GRAVY）和不穩(wěn)定指數(shù)，從菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫中獲得CDS序列、蛋白質(zhì)長(zhǎng)度等指標(biāo)，利用TBtools[21]繪制AcNINV基因家族在染色體上的定位和分布圖。AcNINV蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件進(jìn)行分析。基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)利用CELLO：Subcellular Localization Predictive System（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）在線軟件進(jìn)行分析。利用TBtools[21]進(jìn)行不同物種間AcNINV基因共線性分析。

1.4 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)利用TBtools可視化分析[21]。利用MEME在線工具（http：//meme-suite.org/tools/meme）和TBtools對(duì)AcNINV基因家族的保守基序進(jìn)行分析和可視化，最大基序數(shù)設(shè)置為10。

1.5 菠蘿AcNINV基因系統(tǒng)發(fā)育分析

使用ClustalX和MEGA-5.0采用鄰接（NJ）方法構(gòu)建AcNINV基因與其他物種NINV基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用TBtools提取起始密碼子（ATG）上游2000 bp的基因序列，然后利用PlantCARE在線軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)各個(gè)基因的順式作用元件，再利用TBtools繪制順式作用元件圖。

1.7 蔗糖含量的測(cè)量

根據(jù)Zhang等[22]的方法采用高效液相色譜法（HPLC）提取并測(cè)定蔗糖含量。反應(yīng)條件為：柱溫35 ℃，流動(dòng)相為乙腈和蒸餾水，體積比7∶3，流速1 mL·min-1。

1.8 RNA提取、質(zhì)量控制和cDNA合成

采用Wu等[23]的方法分離總RNA，用DNaseⅠ（TaKaRa，Otsu，Japan）去除DNA污染。安捷倫2100生物分析儀（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）用于檢測(cè)RNA的數(shù)量和質(zhì)量。用M-MLV cDNA合成試劑盒（Promega）合成第一鏈cDNA。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

在LightCycler480 Ⅱ （Roche， Switzerland）上使用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR kit （Thermo，USA）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1）。RT-qPCR反應(yīng)總體積為10 μL：1 μL稀釋cDNA、5 μL SYBR Green PCR Master Mix、引物最終濃度為250 nmol·L-1，以AcActin（HQ148720）作為內(nèi)參基因[24]。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，然后在95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)都設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，候選基因的相對(duì)表達(dá)水平用2?ΔΔCT方法進(jìn)行分析[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿AcNINV基因家族的鑒定及特性分析

從菠蘿基因組中分離出6個(gè)AcNINV基因家族成員，分別命名為AcNINV1～6。AcNINV蛋白的長(zhǎng)度為556～673 aa，分子質(zhì)量（MW）在63.03～74.80 ku之間變化，理論等電點(diǎn)為5.68～6.35，不穩(wěn)定指數(shù)大于40，親水性數(shù)值小于0。對(duì)這些AcNINV基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)AcNINV3和AcNINV6分布于葉綠體上，其余家族成員都分布于質(zhì)膜上（表2）。

2.2 菠蘿AcNINV蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA在線分析工具預(yù)測(cè)菠蘿AcNINV蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)（表3），菠蘿AcNINV基因家族均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈等4種構(gòu)型，但各部分所占比例明顯不同。菠蘿AcNINV基因家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，其次為延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角所占比例最低。

2.3 菠蘿AcNINV基因家族染色體定位分析

利用TBtools軟件繪制基因在染色體上的位置（圖1），6個(gè)AcNINV基因分別定位于5條不同的染色體（LG）上。其中LG21上有2個(gè)基因（AcNINV5和AcNINV6），其余染色體上都只有1個(gè)AcNINV基因。

2.4 菠蘿AcNINV基因共線性分析

為了探明AcNINV基因的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了菠蘿與擬南芥、水稻的共線性圖譜，從圖2中可以看出菠蘿AcNINV基因與擬南芥中僅有一對(duì)基因（AT3G05820.1與Aco006374.1）有共線性關(guān)系，但與水稻有8對(duì)基因（LOC_Os02g32730.1與Aco007782.1、LOC_Os04g3-

3490.1與Aco007782.1、LOC_Os02g34560.1與Aco007893.1、LOC_Os04g35280.1與Aco007893.1、LOC_Os04g35280.1與Aco003240.1、LOC_Os02g3-

4560.1與Aco003240.1、LOC_Os11g07440.1與Aco003240.1、LOC_Os04g35280.1與Aco011221.1）有共線性關(guān)系。

2.5 菠蘿AcNINV基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

對(duì)已鑒定的AcNINV基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AcNINV外顯子數(shù)量介于4到6個(gè)之間，其中AcNINV3和AcNINV6基因外顯子數(shù)量都是6個(gè)，其余基因外顯子都為4個(gè)；內(nèi)含子數(shù)量介于3到5個(gè)之間，其中AcNINV3和AcNINV6基因內(nèi)含子數(shù)量最高為5個(gè)，其余基因內(nèi)含子數(shù)量為3個(gè)（圖3）。利用MEME進(jìn)行保守基序分析，在6個(gè)AcNINV基因中共預(yù)測(cè)了10個(gè)保守基序。其中AcNINV1、2、4、5均含有10個(gè)保守基序，但AcNINV3、6只有9個(gè)保守基序，缺少了motif 10。

2.6 菠蘿AcNINV基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了更好地闡明菠蘿AcNINV基因家族之間的進(jìn)化關(guān)系，將菠蘿6個(gè)AcNINV基因與擬南芥、水稻、木薯等4個(gè)物種的NINV基因家族氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。菠蘿6個(gè)AcNINV基因被聚類到α和β兩個(gè)亞族，其中AcNINV1、2、4、5屬于β亞族，AcNINV3、6屬于α亞族（圖4）。

2.7 菠蘿AcNINV基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了探析菠蘿NINV基因是如何被調(diào)控表達(dá)的，利用Plant-CARE預(yù)測(cè)了目的基因上游2000 bp順式作用元件。結(jié)果（圖5）表明，光反應(yīng)元件（MRE、ATC-motif、Box 4、L-box、GATA-motif、G-box、GT1-motif、TCCC-motif、3-AF1 binding site、LAMP-element、Sp1、TCT-motif、GA-motif、chs-CMA1a、AT1-motif、AE-box）的數(shù)量最多，其次是激素反應(yīng)元件（ABRE、TGA-element、AuxRR-core、P-box、O2-site、TATC-box、TCA-element、TCA-element、 CGTCA-motif、TGACG-motif）和逆境反應(yīng)元件（TC-rich repeats、LTR、ARE、GC-motif）。其中AcNINV5所含順式作用元件數(shù)量最多，AcNINV2所含順式作用元件數(shù)量最少。

2.8 菠蘿果實(shí)發(fā)育過程中蔗糖含量的變化

在菠蘿果實(shí)發(fā)育過程中，蔗糖含量呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖6）。從20～40 DAA，蔗糖含量保持不變；此后，從50～80 DAA蔗糖含量急劇增加，并在80 DAA達(dá)到最高值，為20 DAA的126倍；從80～100 DAA急劇下降，但最終蔗糖含量仍比20 DAA高12倍[1]。正是由于蔗糖含量隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育而增加，因此果實(shí)的甜度會(huì)隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育而提高。

2.9 菠蘿果實(shí)發(fā)育過程中AcNINV基因家族的表達(dá)分析

利用RT-qPCR技術(shù)研究了6個(gè)AcNINV基因在菠蘿果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)模式（圖7），不同AcNINV基因成員其表達(dá)差異巨大。6個(gè)AcNINV基因在菠蘿果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)呈現(xiàn)出3種類型，第一種為上調(diào)表達(dá)，AcNINV2、3、6等3個(gè)基因?qū)儆谶@種類型；第二種為先下調(diào)再上調(diào)表達(dá)，但變化幅度不大，AcNINV1、5等2個(gè)基因?qū)儆谶@種類型；第三種為顯著下調(diào)表達(dá)，AcNINV4基因?qū)儆谶@種類型。AcNINV4基因在20～40 DAA的表達(dá)量幾乎沒變化，但從40 DAA開始迅速下降，并持續(xù)到100 DAA，該基因在20 DAA的表達(dá)量是100 DAA的5倍。

2.10 AcNINV基因在不同組織中的表達(dá)分析

為了闡明AcNINV基因不同家族成員的表達(dá)特性，利用RT-qPCR分析了不同組織的表達(dá)量，從圖8可以看出，不同家族成員的表達(dá)特性不同，AcNINV1在果柄中的表達(dá)量最高，在果心中最低；AcNINV2、3、6在果皮中的表達(dá)量最高，在果肉中最低；AcNINV4、5在果柄中的表達(dá)量最高，在果肉中最低。綜合AcNINV基因家族在不同組織中的表達(dá)特性發(fā)現(xiàn)，在果柄、果皮、果心中表達(dá)量最高的是AcNINV2基因，在果肉中表達(dá)量最高的是AcNINV6基因。

3 討 論

蔗糖、果糖和葡萄糖是菠蘿果實(shí)中的主要糖類[26]，在本研究中蔗糖含量隨果實(shí)發(fā)育而增加，這一結(jié)果和筆者課題組之前的結(jié)論一致[27]。筆者在本研究的菠蘿中共鑒定出6個(gè)AcNINV基因成員，AcNINV蛋白的長(zhǎng)度為556～673 aa，分子質(zhì)量（MW）在63.03～74.80 ku之間變化，理論等電點(diǎn)為5.68～6.35，6個(gè)AcNINV基因位于5條染色體上?；蚬簿€性分析發(fā)現(xiàn)菠蘿與水稻NINV基因的共線性基因?qū)τ?對(duì)，但菠蘿與擬南芥的共線性基因?qū)χ挥?對(duì)。

NINV基因家族根據(jù)進(jìn)化關(guān)系可以分為α和β亞族，其中α亞族定位在細(xì)胞核、葉綠體和線粒體上，β亞族定位在細(xì)胞溶質(zhì)上[28-30]。另外，兩個(gè)亞族成員的主要區(qū)別在于外顯子/內(nèi)含子數(shù)量不同，α亞族有6個(gè)外顯子，β亞族只有4個(gè)外顯子[17，19，31]。在辣椒中CaNINV基因外顯子數(shù)量介于3到6個(gè)之間，CaNINV1、2、3基因均有6個(gè)外顯子，屬于α亞族，CaNINV4、5、6基因均有4個(gè)外顯子，屬于β亞族[12]。木薯11個(gè)MeNINV基因外顯子數(shù)量介于4到6個(gè)之間，其中MeNINV1、6、7、8、9、10屬于α亞族，MeNINV2、3、4、5和nINV1屬于β亞族[17]。研究表明，AcNINV外顯子數(shù)量介于4到6個(gè)之間，內(nèi)含子數(shù)量介于3到5個(gè)之間，其中AcNINV3、6外顯子的數(shù)量為6個(gè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因都分布于葉綠體上，屬于α亞族；AcNINV1、2、4、5外顯子的數(shù)量為4個(gè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因都分布于質(zhì)膜上，屬于β亞族。這些結(jié)果與前人的結(jié)論一致。

啟動(dòng)子分析表明，AcNINV家族的啟動(dòng)子區(qū)域含有激素反應(yīng)元件、逆境反應(yīng)元件和光反應(yīng)元件。在毛白楊[32]和西瓜、甜瓜[33]中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。且本研究發(fā)現(xiàn)，在眾多反應(yīng)元件中光反應(yīng)元件數(shù)量最多，據(jù)此推測(cè)光照條件能顯著調(diào)控NINV基因的表達(dá)，進(jìn)而影響NINV酶活性，最終影響蔗糖的含量，這也能解釋為什么同一品種的菠蘿在不同季節(jié)收獲其果實(shí)糖積累的類型不同[34]。

NINV基因具有組織表達(dá)特異性[7]。Shen等[12]分析了辣椒7個(gè)基因家族成員在根、莖、葉、花芽、花、果實(shí)發(fā)育9個(gè)階段的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)CaNINV1和CaNINV6在所有組織中的表達(dá)量都較低，且未檢測(cè)到CaNINV7表達(dá)。CaNINV4主要在根中表達(dá)，在果實(shí)僅有微弱表達(dá)。CaNINV2和CaNINV3在果實(shí)中的表達(dá)量高于其他組織。CaNINV5在所有組織中的表達(dá)量都是最高的。在鐵皮石斛5個(gè)NI基因中，在根中表達(dá)量高的為DoNI1和DoNI3，在花中表達(dá)量高的為DoNI4和DoNI5，在莖中表達(dá)量高的為DoNI2[35]。在木薯中，MeNINV5在雄花中特異性表達(dá)，在葉片、雌花和果實(shí)中僅微弱表達(dá)，且在其他器官中未檢測(cè)到；MeNINV1、4、7的表達(dá)模式相似，在莖、雄花和雌花中均有表達(dá)；MeNINV6、10主要在葉、莖、雄花和雌花中表達(dá)；MeNINV2、3和5在雄花中的表達(dá)量高于其他組織；MeNINV8在花中顯著表達(dá)，在塊莖根中僅微弱表達(dá)；MeNINV9在雌花中顯著表達(dá)[17]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，在6個(gè)AcNINV基因中，在果柄、果皮、果心中表達(dá)量最高的是AcNINV2基因，在果肉中表達(dá)量最高的是AcNINV6基因。推測(cè)這兩個(gè)基因可能在植物器官生長(zhǎng)中起到重要作用，因?yàn)榍叭搜芯堪l(fā)現(xiàn)在擬南芥中，At-A/N-Inv G基因影響側(cè)根的生長(zhǎng)[29]；同時(shí)敲除At-A/N-Inv G和At-A/N-Inv I基因植株生長(zhǎng)緩慢，矮化，根的伸長(zhǎng)區(qū)生長(zhǎng)緩慢[36]；At-A/N-Inv C基因影響莖的伸長(zhǎng)、花芽的分化[37-38]；A/N-Inv H敲除突變體開花時(shí)間推遲、植株莖的伸長(zhǎng)減弱[39]。百脈根NINV基因Ljinv1-1、Ljinv1-2、Ljinv1-3缺失導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢，根部受損，影響花芽和小孢子分化[30，40]。敲除水稻OsCYT-INV1基因，水稻根系變短，開花延緩[41]。

同時(shí)前人研究表明NINV在蔗糖代謝中發(fā)揮重要作用[42]，橡膠樹乳管中HbNIN2參與蔗糖代謝，從而影響乳膠產(chǎn)量[42]，橡膠HbNINa基因通過調(diào)控蔗糖代謝，進(jìn)而在葉片發(fā)育過程中起到重要作用[43]。番茄果實(shí)SlCIN3基因在轉(zhuǎn)色期和紅熟期的表達(dá)量是綠熟期的4～5倍，據(jù)此推測(cè)該基因可能是番茄果實(shí)后期己糖代謝的關(guān)鍵基因[44]。楊寧等[32]將PtoNIN1過表達(dá)到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)提高了轉(zhuǎn)基因植株角果、莖、蓮座葉的鮮質(zhì)量，且促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株蔗糖的代謝。鐵皮石斛中DcNI4基因不可逆地將蔗糖分解為果糖和葡萄糖[16]，NI的表達(dá)與葡萄果皮、果肉中葡萄糖和果糖的含量變化呈正相關(guān)[45]。在柑橘中研究發(fā)現(xiàn)，CitNI5可能參與了蔗糖代謝的調(diào)控，且該基因與果實(shí)蔗糖含量變化呈負(fù)相關(guān)[14]。Joubert等[46]利用RNAi技術(shù)，將NI基因轉(zhuǎn)入甘蔗，發(fā)現(xiàn)NI活性顯著下降，而蔗糖含量顯著上升。筆者研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)AcNINV基因在菠蘿果實(shí)發(fā)育過程中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)特性，AcNINV2、3、6等3個(gè)基因?yàn)樯险{(diào)表達(dá)；AcNINV1、5等2個(gè)基因?yàn)橄认抡{(diào)再上調(diào)表達(dá)，但變化幅度不大；AcNINV4基因表現(xiàn)為顯著下調(diào)，且從20～40 DAA，蔗糖含量基本保持不變，AcNINV4基因的表達(dá)量也基本保持不變；從40～80 DAA，蔗糖含量持續(xù)增加，AcNINV4基因的表達(dá)量呈先顯著下降之后再有所回升的變化趨勢(shì)；從80～100 DAA，蔗糖含量顯著下降，AcNINV4基因的表達(dá)量稍有下降。綜上所述，推測(cè)AcNINV4可能是催化果實(shí)蔗糖降解的水解酶基因。

4 結(jié) 論

筆者在菠蘿中共鑒定出6個(gè)NINV基因，分布于5條不同染色體上，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，該基因家族啟動(dòng)子區(qū)域光反應(yīng)元件數(shù)量最多。AcNINV3、6外顯子的數(shù)量為6個(gè)，分布于葉綠體上，屬于α亞族；AcNINV1、2、4、5外顯子的數(shù)量為4個(gè)，分布于質(zhì)膜上，屬于β亞族。在果柄、果皮、果心中表達(dá)量最高的是AcNINV2基因，在果肉中表達(dá)量最高的是AcNINV6基因。蔗糖含量隨著菠蘿果實(shí)成熟呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，而AcNINV4基因在菠蘿果實(shí)成熟過程中呈下調(diào)表達(dá)，據(jù)此推測(cè)，AcNINV4可能是催化果實(shí)蔗糖降解的水解酶基因。

參考文獻(xiàn)References：

[1] WU J Y，CHEN M，YAO Y L，F(xiàn)U Q，ZHU Z Y，ZHANG X M. Identification，characterisation，and expression profile analysis of the sucrose phosphate synthase gene family in pineapple （Ananas comosus）[J]. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2022，97（2）：201-210.

[2] 袁俊杰，陳文，李志勇，魏霜，馬新華，盧乃會(huì)，楊卓瑜，渭婷玉，龍陽. 湛江關(guān)區(qū)鮮菠蘿產(chǎn)業(yè)發(fā)展及出口對(duì)策探討[J]. 質(zhì)量安全與檢驗(yàn)檢測(cè)，2020，30（5）：107-110.

YUAN Junjie，CHEN Wen，LI Zhiyong，WEI Shuang，MA Xinhua，LU Naihui，YANG Zhuoyu，WEI Tingyu，LONG Yang. Discussion on the development of pineapple industry and its export strategy in Zhanjiang[J]. Quality Safety Inspection and Testing，2020，30（5）：107-110.

[3] PERSIA D，CAI G，DEL CASINO C，F(xiàn)ALERI C，WILLEMSE M T M，CRESTI M. Sucrose synthase is associated with the cell wall of tobacco pollen tubes[J]. Plant Physiology，2008，147（4）：1603-1618.

[4] BASSON C E，GROENEWALD J H，KOSSMANN J，CRONJ? C，BAUER R. Sugar and acid-related quality attributes and enzyme activities in strawberry fruits：Invertase is the main sucrose hydrolysing enzyme[J]. Food Chemistry，2010，121（4）：1156-1162.

[5] 雷鈺欣，曹子千，李紀(jì)璇，劉福慶，張雙，許志茹. 高等植物轉(zhuǎn)化酶的研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2021：1-20. （2021-07-08）[2023-10-20]. DOI：10.13271/j.mpb.022.001242.

LEI Yuxin，CAO Ziqian，LI Jixuan，LIU Fuqing，ZHANG Shuang，XU Zhiru. Research progress of invertase in higher plants[J]. Molecular Plant Breeding，2021：1-20. （2021-07-08）[2023-10-20]. DOI：10.13271/j.mpb.022.001242.

[6] XIANG L，LE ROY K，BOLOURI-MOGHADDAM M R，VANHAECKE M，LAMMENS W，ROLLAND F，VAN DEN ENDE W. Exploring the neutral invertase-oxidative stress defence connection in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（11）：3849-3862.

[7] DAHRO B，WANG F，PENG T，LIU J H. PtrA/NINV，an alkaline/neutral invertase gene of Poncirus trifoliata，confers enhanced tolerance to multiple abiotic stresses by modulating ROS levels and maintaining photosynthetic efficiency[J]. BMC Plant Biology，2016，16：76.

[8] 陳美霞，趙從凱，陳學(xué)森，房師梅，張憲省. 杏果實(shí)發(fā)育過程中糖積累與蔗糖代謝相關(guān)酶的關(guān)系[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2009，26（3）：320-324.

CHEN Meixia，ZHAO Congkai，CHEN Xuesen，F(xiàn)ANG Shimei，ZHANG Xiansheng. Relationship between accumulation of sugar and sucrose-metabolizing enzymes during apricot fruit development[J]. Journal of Fruit Science，2009，26（3）：320-324.

[9] 張玲. 草莓蔗糖代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因?qū)麑?shí)糖分積累的影響機(jī)理[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

ZHANG Ling. The effect of genes for sucrose metabolism and transportion on fruit sugar accumulation in strawberry （Fragaria × ananassa Duch.）[D]. Lanzhou：Gansu Agricultural University，2017.

[10] QIAN W J，YUE C，WANG Y C，CAO H L，LI N N，WANG L，HAO X Y，WANG X C，XIAO B，YANG Y J. Identification of the invertase gene family （INVs） in tea plant and their expression analysis under abiotic stress[J]. Plant Cell Reports，2016，35（11）：2269-2283.

[11] CHEN J Q，BLACK C C. Biochemical and immunological properties of alkaline invertase isolated from sprouting soybean hypocotyls[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，1992，295（1）：61-69.

[12] SHEN L B，YAO Y，HE H，QIN Y L，LIU Z J，LIU W X，QI Z Q，YANG L J，CAO Z M，YANG Y. Genome-wide identification，expression，and functional analysis of the alkaline/neutral invertase gene family in pepper[J]. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（1）：224.

[13] JI X M，VAN DEN ENDE W，VAN LAERE A，CHENG S H，BENNETT J. Structure，evolution，and expression of the two invertase gene families of rice[J]. Journal of Molecular Evolution，2005，60（5）：615-634.

[14] 李恒. 柑橘CitNI5和CitMYB52參與蔗糖代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控初探[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2020.

LI Heng. Preliminary research on transcriptional regulation of citrus CitNI5 and CitMYB52 in sucrose metabolism[D]. Hangzhou：Zhejiang University，2020.

[15] MARUTA T，OTORI K，TABUCHI T，TANABE N，TAMOI M，SHIGEOKA S. New insights into the regulation of greening and carbon-nitrogen balance by sugar metabolism through a plastidic invertase[J]. Plant Signaling & Behavior，2010，5（9）：1131-1133.

[16] 劉晨. 鐵皮石斛多糖代謝途徑關(guān)鍵催化酶中性/堿性轉(zhuǎn)化酶DcNI4的挖掘與功能研究[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2021.

LIU Chen. Mining and functional characterization of key catalase enzyme alkaline/neutral invertase DcNI4 involved in polysaccharide biosynthesis pathway in Dendrobium catenatum[D]. Hangzhou：Zhejiang A & F University，2021.

[17] YAO Y，GENG M T，WU X H，LIU J，LI R M，HU X W，GUO J C. Genome-wide identification，expression，and activity analysis of alkaline/neutral invertase gene family from cassava （Manihot esculenta Crantz）[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2015，33（2）：304-315.

[18] HYUN T K，EOM S H，KIM J S. Genomic analysis and gene structure of the two invertase families in the domesticated apple （Malus × domestica Borkh.）[J]. Plant Omics，2011，4（7）：391-399.

[19] BOCOCK P N，MORSE A M，DERVINIS C，DAVIS J M. Evolution and diversity of invertase genes in Populus trichocarpa[J]. Planta，2008，227（3）：565-576.

[20] MING R，VANBUREN R，WAI C M，TANG H B，SCHATZ M C，BOWERS J E，LYONS E，WANG M L，CHEN J，BIGGERS E，ZHANG J S，HUANG L X，ZHANG L M，MIAO W J，ZHANG J，YE Z Y，MIAO C Y，LIN Z C，WANG H，ZHOU H Y，YIM W C，PRIEST H D，ZHENG C F，WOODHOUSE M，EDGER P P，GUYOT R，GUO H B，GUO H，ZHENG G Y，SINGH R，SHARMA A，MIN X J，ZHENG Y，LEE H Y，GURTOWSKI J，SEDLAZECK F J，HARKESS A，MCKAIN M R，LIAO Z Y，F(xiàn)ANG J P，LIU J，ZHANG X D，ZHANG Q，HU W C，QIN Y，WANG K，CHEN L Y，SHIRLEY N，LIN Y R，LIU L Y，HERNANDEZ A G，WRIGHT C L，BULONE V，TUSKAN G A，HEATH K，ZEE F，MOORE P H，SUNKAR R，LEEBENS-MACK J H，MOCKLER T，BENNETZEN J L，F(xiàn)REELING M，SANKOFF D，PATERSON A H，ZHU X G，YANG X H，SMITH J A C，CUSHMAN J C，PAULL R E，YU Q Y. The pineapple genome and the evolution of CAM photosynthesis[J]. Nature Genetics，2015，47（12）：1435-1442.

[21] CHEN C J，CHEN H，ZHANG Y，THOMAS H R，F(xiàn)RANK M H，HE Y H，XIA R. TBtools：An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

[22] ZHANG M F，LI Z L. A comparison of sugar-accumulating patterns and relative compositions in developing fruits of two oriental melon varieties as determined by HPLC[J]. Food Chemistry，2005，90（4）：785-790.

[23] WU J Y，ZHANG H N，LIU L Q，LI W C，WEI Y Z，SHI S Y. Validation of reference genes for RT-qPCR studies of gene expression in preharvest and postharvest longan fruits under different experimental conditions[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：780.

[24] LI Y H，WU Q S，HUANG X，LIU S H，ZHANG H N，ZHANG Z，SUN G M. Molecular cloning and characterization of four genes encoding ethylene receptors associated with pineapple （Ananas comosus L.） flowering[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：710.

[25] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[26] 張秀梅，杜麗清，謝江輝，陳佳瑛，弓德強(qiáng)，李偉才. 蔗糖代謝相關(guān)酶在卡因菠蘿果實(shí)糖積累中的作用[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2006，23（5）：707-710.

ZHANG Xiumei，DU Liqing，XIE Jianghui，CHEN Jiaying，GONG Deqiang，LI Weicai. Roles of sucrose-metabolizing enzymes in accumulation of sugars in Cayenne pineapple fruit[J]. Journal of Fruit Science，2006，23（5）：707-710.

[27] ZHANG X M，LIU S H，DU L Q，YAO Y L，WU J Y. Activities，transcript levels，and subcellular localizations of sucrose phosphate synthase，sucrose synthase，and neutral invertase and change in sucrose content during fruit development in pineapple （Ananas comosus）[J]. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2019，94（5）：573-579.

[28] 宋莉璐，張荃. 植物中參與活性氧調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)[J]. 生命科學(xué)，2007，19（3）：346-352.

SONG Lilu，ZHANG Quan. Reactive oxygen gene network of plants and its regulation[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences，2007，19（3）：346-352.

[29] LOU Y，GOU J Y，XUE H W. PIP5K9，an Arabidopsis phosphatidylinositol monophosphate kinase，interacts with a cytosolic invertase to negatively regulate sugar-mediated root growth[J]. The Plant Cell，2007，19（1）：163-181.

[30] WINGLER A，ROITSCH T. Metabolic regulation of leaf senescence：Interactions of sugar signalling with biotic and abiotic stress responses[J]. Plant Biology，2008，10（Suppl. 1）：50-62.

[31] FUJII S，HAYASHI T，MIZUNO K. Sucrose synthase is an integral component of the cellulose synthesis machinery[J]. Plant and Cell Physiology，2010，51（2）：294-301.

[32] 楊寧，楊雄，李國(guó)雷，陳仲. 毛白楊堿性/中性轉(zhuǎn)化酶基因PtoNIN1的克隆與功能研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，45（5）：35-46.

YANG Ning，YANG Xiong，LI Guolei，CHEN Zhong. Cloning and functional study of the alkaline/neutral invertase gene PtoNIN1 in Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University，2023，45（5）：35-46.

[33] 熊思亦，張聰聰，馬榮雪，閆星，魏春華，張顯. 西瓜、甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族鑒定及表達(dá)分析[J].分子植物育種，2023，21（12）：3829-3839.

XIONG Siyi，ZHANG Congcong，MA Rongxue，YAN Xing，WEI Chunhua，ZHANG Xian. Identification and expression analysis of invertase gene family in watermelon and melon[J]. Molecular Plant Breeding，2023，21（12）：3829-3839.

[34] 張秀梅，李建國(guó)，竇美安，姚艷麗，杜麗清，孫光明. 不同季節(jié)菠蘿果實(shí)糖積累的差異[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2010，37（11）：1751-1758.

ZHANG Xiumei，LI Jianguo，DOU Meian，YAO Yanli，DU Liqing，SUN Guangming. Difference in sugar accumulation of pineapple fruit harvested in different seasons[J]. Acta Horticulturae Sinica，2010，37（11）：1751-1758.

[35] 苗小榮，牛俊奇，王愛勤，黃維，何龍飛. 鐵皮石斛中性/堿性轉(zhuǎn)化酶家族基因的克隆和表達(dá)分析[J].分子植物育種，2022，20（19）：6362-6370.

MIAO Xiaorong，NIU Junqi，WANG Aiqin，HUANG Wei，HE Longfei. Cloning and expression analysis of neutral/alkaline invertase gene in Dendrobium officinale[J]. Molecular Plant Breeding，2022，20（19）：6362-6370.

[36] BARRATT D H P，DERBYSHIRE P，F(xiàn)INDLAY K，PIKE M，WELLNER N，LUNN J，F(xiàn)EIL R，SIMPSON C，MAULE A J，SMITH A M. Normal growth of Arabidopsis requires cytosolic invertase but not sucrose synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（31）：13124-13129.

[37] TAMOI M，TABUCHI T，DEMURATANI M，OTORI K，TANABE N，MARUTA T，SHIGEOKA S. Point mutation of a plastidic invertase inhibits development of the photosynthetic apparatus and enhances nitrate assimilation in sugar-treated Arabidopsis seedlings[J]. The Journal of Biological Chemistry，2010，285（20）：15399-15407.

[38] BAILEY T L，BODEN M，BUSKE F A，F(xiàn)RITH M，GRANT C E，CLEMENTI L，REN J Y，LI W W，NOBLE W S. MEME SUITE：Tools for motif discovery and searching[J]. Nucleic Acids Research，2009，37（Web Server issue）：W202-W208.

[39] BATTAGLIA M E，MARTIN M V，LECHNER L，MART?NEZ-NO?L G M A，SALERNO G L. The riddle of mitochondrial alkaline/neutral invertases：A novel Arabidopsis isoform mainly present in reproductive tissues and involved in root ROS production[J]. PLoS One，2017，12（9）：e0185286.

[40] WELHAM T，PIKE J，HORST I，F(xiàn)LEMETAKIS E，KATINAKIS P，KANEKO T，SATO S，TABATA S，PERRY J，PARNISKE M，WANG T L. A cytosolic invertase is required for normal growth and cell development in the model legume，Lotus japonicus[J]. Journal of Experimental Botany，2009，60（12）：3353-3365.

[41] JIA L Q，ZHANG B T，MAO C Z，LI J H，WU Y R，WU P，WU Z C. OsCYT-INV1 for alkaline/neutral invertase is involved in root cell development and reproductivity in rice （Oryza sativa L.）[J]. Planta，2008，228（1）：51-59.

[42] LIU S J，LAN J X，ZHOU B H，QIN Y X，ZHOU Y H，XIAO X H，YANG J H，GOU J Q，QI J Y，HUANG Y C，TANG C R. HbNIN2，a cytosolic alkaline/neutral-invertase，is responsible for sucrose catabolism in rubber-producing laticifers of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. New Phytologist，2015，206（2）：709-725.

[43] 肖小虎，戚繼艷，方永軍，曹冰，龍翔宇，唐朝榮. 巴西橡膠樹中堿性轉(zhuǎn)化酶HbNINa基因的克隆和表達(dá)模式分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（7）：1264-1269.

XIAO Xiaohu，QI Jiyan，F(xiàn)ANG Yongjun，CAO Bing，LONG Xiangyu，TANG Chaorong. Cloning and expression analysis of an alkaline/neutral invertase gene in Hevea brasliensis[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，2013，34（7）：1264-1269.

[44] 張瓊瓊. 番茄堿性/中性轉(zhuǎn)化酶SlCIN3基因功能研究[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

ZHANG Qiongqiong. The primary study of an alkaline/neutral invertase SlCIN3 gene function in tomato[D]. Shenyang：Shenyang Agricultural University，2019.

[45] NONIS A，RUPERTI B，PIERASCO A，CANAGUIER A，ADAM-BLONDON A F，DI GASPERO G，VIZZOTTO G. Neutral invertases in grapevine and comparative analysis with Arabidopsis，poplar and rice[J]. Planta，2008，229（1）：129-142.

[46] JOUBERT D，BOSCH S，BOTHA F C，KOSSMANN J，GROENEWALD J H. Down-regulation of neutral invertase activity in sugarcane cell suspension cultures leads to increased sucrose accumulation[J]. South African Journal of Botany，2007，73（2）：293.