新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品及酵頭中酵母菌的分離鑒定

王冠群， 韓培杰， 楊文菊， 王新宇， 許 倩， 朱麗霞*

（1.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；3.新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊830004）

新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品及酵頭中酵母菌的分離鑒定

王冠群1， 韓培杰2， 楊文菊3， 王新宇1， 許 倩1， 朱麗霞*1

（1.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；3.新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊830004）

研究了新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的酵母菌菌群結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性。采用YPD富集培養(yǎng)后稀釋涂布的方法，從12個(gè)地區(qū)161份樣品中分離得到472株酵母菌，通過(guò)YPD菌落形態(tài)、WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基聚類分析為16類，挑選不同表型的代表菌株11株進(jìn)行5.8S-ITS區(qū)和26S D1/D2區(qū)測(cè)序，通過(guò)國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)分析鑒定菌種。從分離到的472株酵母菌中，共鑒定出6個(gè)屬8個(gè)種，其中包括 263株 Saccharomyces cerevisiae，156株 Issatchenkia orientalis，10株 Torulaspora delbrueckii，9 株 Pichia fermentans，21 株 Saccharomyces unisporus，7 株 Metschnikowia pulcherrima，4株P(guān)ichia membranifaciens，2株Clavispora lusitaniae，地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌東方伊薩酵母和釀酒酵母。不同基物與不同地區(qū)的菌群結(jié)構(gòu)明顯不同。上述結(jié)果表明新疆的酵母資源具有豐富多樣，本研究初次全面地對(duì)新疆傳統(tǒng)食品的酵母菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為新疆傳統(tǒng)食品微生物資源的開發(fā)利用，與傳統(tǒng)食品的質(zhì)量控制等奠定了基礎(chǔ)。

酵母菌；5.8S-ITS；26SrDNA；分離鑒定

新疆地區(qū)具有許多傳統(tǒng)發(fā)酵的食品例如馕、馬奶酒、以及地區(qū)特色酒。這些食品具有非常古老的文化歷史，隨著文化交流的不斷深入，新疆的傳統(tǒng)發(fā)酵食品受到了內(nèi)地以及國(guó)外的重視與歡迎。但是這些食品涉及的酵母菌的種類、群落結(jié)構(gòu)尚缺乏總體分析，通過(guò)對(duì)這些發(fā)酵食品的酵母菌群落結(jié)構(gòu)分析可以研究新疆發(fā)酵飲食文化的歷史傳播途徑以及對(duì)新疆酵母菌的群落分布有系統(tǒng)的了解。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中酵母菌資源的收集、分類鑒定和生物學(xué)特性的研究是其開發(fā)利用的基礎(chǔ)。雖然我國(guó)保藏中心建立的比較早，但對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中酵母菌種的收集以及保存還不足，尤其隨著活性干酵母的快速和廣泛使用，地方特色發(fā)酵食品的傳統(tǒng)技藝隨之改變或消失，使得本土特色酵母資源保護(hù)和開發(fā)利用凸顯其重要性和緊迫性。

酵母菌的分類比較復(fù)雜，雖然已知的酵母種屬超過(guò) 1 000種[1]，但普遍認(rèn)為這些菌種只占了所有酵母種屬的1%。在過(guò)去的研究中對(duì)酵母種屬的區(qū)分，主要根據(jù)它們的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性進(jìn)行區(qū)分。隨著對(duì)酵母基因組的不斷認(rèn)識(shí)和深入，26S D1/D2、5.8S-ITS等序列分析方法在酵母菌的鑒定方法中逐漸顯示出了很大的優(yōu)勢(shì)[2-3]。將酵母菌的表型特征與基因型特征結(jié)合起來(lái)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中酵母菌的分離鑒定，對(duì)以后其他的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中酵母菌的分析具有重要的參考意義，同時(shí)這也有利于深入準(zhǔn)確地了解酵母菌種資源在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的分布并對(duì)此進(jìn)行科學(xué)的有效利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

新疆各地區(qū)采集的酵頭：面制品的酵頭，且為土法制作，不添加活性干酵母；發(fā)酵型乳制品：包括馬奶酒、酸奶、奶疙瘩等，樣品共計(jì)161份，采自21個(gè)地區(qū)（見表1）。

表1 各地區(qū)采集樣品Table 1 Samples collected from different areas

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配置 富集培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，水10 00 mL，pH自然，121℃15 min。分離及表型歸類培養(yǎng)基：WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（青島日水生物有限公司生產(chǎn)的商業(yè)培養(yǎng)基）80 g，加水定容至1 000 mL，pH自然，121℃15 min。

1.2.2 樣品富集培養(yǎng) 固體樣品1 g左右，液體樣品200 μL接種于 3 mL YPD液體培養(yǎng)基（酵母膏，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%；蛋白胨，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%；葡萄糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%）內(nèi)置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)富集培養(yǎng)7 d。

1.2.3 酵母菌分離 富集的酵母菌液用無(wú)菌水稀釋10-4倍吸取100 μL接種于WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并挑取單菌落進(jìn)行純化保藏，備用。

1.2.4 酵母菌的分子鑒定 DNA的提取采用凍融法[4]，5.8S-ITS區(qū)和26S D1/D2 PCR擴(kuò)增條件及系統(tǒng)發(fā)育分析按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，將PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行有效分析[5-6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的初步分類結(jié)果

實(shí)驗(yàn)分離株通過(guò)WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基菌落表型觀察與Cavazza et al的描述[7-8]對(duì)比分析（見表2和圖1），其中表形1、2、4、6、7、10、11只能確定為畢赤屬酵母，表型3、8為釀酒酵母，表型5、9為類釀酒酵母，表型13為梅奇酵母，表型15為膜璞畢赤酵母，表型12、14、16在文獻(xiàn)中未提及。

將169份樣品富集培養(yǎng)后，利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行分離，共得到472個(gè)菌種，根據(jù)各地區(qū)分離出的酵母菌在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落表型進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)可將菌種分為16種表型，其中表型1、表型3以及表型8廣泛存在于21個(gè)地區(qū)內(nèi)（見圖2）塔城-布爾津地區(qū)中的酵母菌菌落形態(tài)最多，有12種；阿瓦提和喀什地區(qū)的酵母菌菌落形態(tài)最少僅有一種（見圖2）。

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析和分類

(1)不同底質(zhì)對(duì)沉水植物的生長(zhǎng)有顯著性差異。根據(jù)單因素方差分析得出的結(jié)果，F(xiàn)均大于Fcrit，表明同種植物不同底質(zhì)下在生物量、株高、根長(zhǎng)和根系活力上存在顯著差異。就根系活力反應(yīng)來(lái)看，根系活力與株高的相關(guān)性R2=0.7252，根系活力與根長(zhǎng)的相關(guān)性R2=0.7064，說(shuō)明根系活力與株高和根長(zhǎng)顯著相關(guān)。且3種植物在泥灘中都有較好的生長(zhǎng)，說(shuō)明高營(yíng)養(yǎng)底質(zhì)有利于沉水植物生長(zhǎng)。黑藻的長(zhǎng)勢(shì)顯著優(yōu)于其它兩種沉水植物，馬來(lái)眼子菜更適合在草洲這類硬質(zhì)土壤生長(zhǎng)，苦草適應(yīng)性較好，與黑藻相似在3種底質(zhì)均有較好生長(zhǎng)，且冬季耐寒能力較強(qiáng)。

2.2.1 5.8S-ITS區(qū)序列分析結(jié)果 對(duì)在新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出的472株酵母菌，挑選出的16株不同表型菌株的ITSrDNA區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定分析，結(jié)果得到：表型1、7、10、11的菌鑒定為I.orientalis；表型2、4、6的菌鑒定為P.fermentans，但與模式菌的相似度不等，種間可能存有較大的差異；表型3、8、9鑒定為S.cerevisiae，但表型3和表型8與模式株的相似度為98%，說(shuō)明這兩類型與表型8（或模式株）在遺傳基因上可能有較大的變異；表型5鑒定為T. delbrueckii；表型12、14鑒定為K.aerobia，但與模式菌比對(duì)，相似性僅為93%，需要進(jìn)一步利用其他方法進(jìn)行鑒定；表型13鑒定為M.Chrysoperlae，與模式菌相似度小于99%；表型15鑒定為P. membranifaciens；表型16鑒定為C.lusitaniae。16中有 4 株 I.orientalis，3 株 P.fermentans，3 株 S. cerevisiae、1株 T.delbrueckii、2株 K.aerobia、1株M.Chrysoperlae、1 株 P.membranifaciens、1 株 C. lusitaniae，共7個(gè)屬8個(gè)種（見圖3）。

表2 WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)類型及其描述Table 2 Types and description of yeast growing on the WL agar

圖1 不同表型在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)圖片F(xiàn)ig.1 Pictures of different phenotypes on WL medium

圖2 不同表型酵母菌在各地區(qū)的分布Fig.2 Distribution of different yeast phenotypes in various regions

圖3 基于5.8S-ITS rDNA區(qū)域序列和NJ法不同表型酵母菌和相關(guān)酵母模式菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of different phenotypes isolates and related model strains based on 5.8S-ITS rDNA region sequences and the NJ method

2.2.2 26S區(qū)序列分析結(jié)果 對(duì)在新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中挑選出的16株不同表型菌株的26SrDNA D1/ D2區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定 （1-26S～16-26S編號(hào)，與上述1-ITS～2-ITS一一對(duì)應(yīng)），根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析，得到：表型1、7、10、11的菌鑒定為P.kudriavzevii；表型2、4、6鑒定為P.fermentans；表型3、8、9鑒定為S. cerevisiae；表型5鑒定為T.delbrueckii；表型12、14鑒定為S.unisporus；表型13鑒定為M.pulcherrima；表型15鑒定為P.membranifac、表型16鑒定為C. lusitaniae。 在 16株代表菌種中有 4株 P. kudriavzevii，3株 P.fermentans，3株 S.cerevisiae，1株 T.delbrueckii，2 株 S.unisporus，1 株 M. pulcherrima，1 株 P. membranifaciens，1 株 C. lusitaniae，共6個(gè)屬8個(gè)種。所有的分離菌株與對(duì)應(yīng)的模式菌株的同源性均在99%以上，并與之聚在一起，這證明酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析結(jié)果的準(zhǔn)確性 （見圖4）。26S rDNA D1/D2區(qū)域與5.8 S-ITS區(qū)域測(cè)序的結(jié)果對(duì)比分析都能很好的鑒定出種，但5.8 S-ITS區(qū)域?qū)ΨN內(nèi)差異性更為敏感。

2.3 各地方菌種分布分析

在所有的分離菌株結(jié)果統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，所有鑒定種在酵頭和發(fā)酵乳制品中均發(fā)現(xiàn)（見表3），但分離于酵頭的S.cerevisiae株數(shù)明顯多于乳制品中，說(shuō)明酵頭更容易保存釀酒酵母；除去M.pulcherrima和C.lusitaniae，其余非釀酒酵母的分離株數(shù)來(lái)自乳制品中的明顯多于來(lái)自酵頭的，其中東方伊薩酵母在非釀酒酵母中所占比例最高，分別在酵頭和乳制品中分別占76.34%、73.27%；葡萄牙棒孢酵母在非釀酒酵母中所占比例最低分別，在酵頭和乳制品中分別占1.08%、0.86%，上述說(shuō)明非釀酒酵母在乳制品更容易滋生與繁殖（見表4）。

I.orientalis和S.cerevisiae廣泛分布在各地區(qū)的乳制品及酵頭中；T.delbrueckii僅分布在伊犁和塔城地區(qū)的乳制品及酵頭中；S.unisporus分布在伊犁和沙灣地區(qū)的乳制品中、塔城和木壘地區(qū)的乳制品及酵頭中；P.fermentans分布在伊犁和沙灣地區(qū)的乳制品中，塔城地區(qū)的乳制品及酵頭中，阿克蘇地區(qū)酵頭中；M.pulcherrima分布在塔城地區(qū)的乳制品及酵頭中，木壘地區(qū)的乳制品中、巴里坤和阿克蘇地區(qū)的酵頭中；P.membranifaciens和C.lusitaniae分布在塔城地區(qū)的乳制品中和巴里坤地區(qū)地區(qū)的酵頭中。8種酵母菌在發(fā)酵型乳制品和酵頭中均有分布，但在乳制品中的各種非釀酒酵母菌占非釀酒酵母的比例高于酵頭。這說(shuō)明乳制品可以比酵頭提供非釀酒酵母菌的生長(zhǎng)環(huán)境。上述表明不同基物和不同地點(diǎn)的酵母菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯的差異。

圖4 不同表型的酵母菌26SrDNA D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of different phenotypes isolates and related model strains based on 26SrDNA D1/D2 region sequences and the NJ method

表3 不同酵母菌在不同基物中的分布Table 3 Distribution of isolates in different isolated substances

表4 不同菌種在各地區(qū)的分離菌株中的分布Table 4 Distribution of different yeast species in each region

續(xù)表4

3 討論

新疆為多民族聚集地，連接西歐與東亞的特殊地理位置，使其食俗文化具有明顯的地域性、多元性、隨著各類文明的傳播而表現(xiàn)出強(qiáng)的融合性。最能體現(xiàn)這些新疆地域食俗文化特征的為新疆酵面食品及發(fā)酵乳制品。例如，馕作為適應(yīng)自然條件和人類社會(huì)需要的 “生態(tài)食物”，起源于新疆南部地區(qū)，是新疆綠洲農(nóng)耕土著民族發(fā)明創(chuàng)造并適應(yīng)當(dāng)?shù)馗珊瞪儆隁夂驐l件的產(chǎn)物，在新疆南部回鶻化、伊斯蘭化的過(guò)程中以及維吾爾族的演變過(guò)程中，馕形成地方特色食俗文化的核心[9]，馕亦為伊朗、巴基斯坦、印度、伊拉克、埃及等阿拉伯國(guó)家的主食之一，其形成過(guò)程是否也是自適應(yīng)性產(chǎn)物，未有具體的文獻(xiàn)參考，但隨著絲路文明的傳播，馕在上述地域和國(guó)家之間進(jìn)行傳播。在中國(guó)，酵面食品在商周已經(jīng)存在，隨著小麥粉工藝的成熟，尤其絹篩的發(fā)明，在西漢時(shí)期，類似饅頭一類的食品也已經(jīng)具備條件，隨著絲路文明的傳播而不斷發(fā)揚(yáng)光大[10]。新疆傳統(tǒng)自然發(fā)酵乳制品當(dāng)?shù)仫嬍趁袼椎闹饕M成部分，沿襲著邊疆游牧民族地區(qū)乳制品發(fā)酵技術(shù)脈絡(luò)，同時(shí)對(duì)中原地區(qū)乳制品發(fā)酵技術(shù)具有重要的影響[11]。

上述依托于馕、饅頭、傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的食俗文化的起源與傳播，主要籍于相關(guān)古文籍或出土文物的考究，但缺乏自然科學(xué)的支撐。作者以分離自傳統(tǒng)制作酸奶、馬奶酒、奶疙瘩及制馕酵頭中的酵母菌為研究對(duì)象，并對(duì)這些發(fā)酵食品的酵母菌群落結(jié)構(gòu)分析，對(duì)于研究新疆發(fā)酵飲食文化的歷史傳播途徑以及進(jìn)行科學(xué)的有效利用奠定基礎(chǔ)，為新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究和發(fā)展提供一定的依據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)

作者在新疆省內(nèi)的21個(gè)地區(qū)采集的161個(gè)樣本中共分離得到472株酵母菌，通過(guò)WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的初步鑒定、26SrDNADl/D2區(qū)域序列鑒定、5.8S-ITS區(qū)域序列鑒定以及代表菌株系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)所分離到的菌株進(jìn)行了較系統(tǒng)的分類鑒定研究和多樣性分析。結(jié)論如下：所有菌株經(jīng)鑒定為6個(gè)屬8個(gè)種。分別為I.orientalis（東方伊薩酵母），P. fermentans（畢赤發(fā)酵酵母），S.cerevisiae（釀酒酵母），T.delbrueckii（戴爾凱氏有孢圓酵母），S. unisporus（單孢酵母），M.pulcherrima（美極梅奇酵母），P.membranifaciens（膜醭畢赤酵母），C. lusitaniae（葡萄牙棒孢酵母）。優(yōu)勢(shì)種為東方伊薩酵母、畢赤發(fā)酵酵母、釀酒酵母。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表型歸類針對(duì)酵母菌分類只能進(jìn)行較為簡(jiǎn)單的分類為釀酒酵母、梅奇酵母、畢赤酵母。其他類型酵母都不能進(jìn)行鑒定。對(duì)釀酒酵母和戴爾凱氏有孢圓酵母不能進(jìn)行分辨。同時(shí)對(duì)于畢赤酵母屬中的東方伊薩酵母、畢赤發(fā)酵酵母以及膜醭畢赤酵母也不能進(jìn)行分別。26S rDNA D1/D2區(qū)域與5.8 S-ITS區(qū)域測(cè)序的結(jié)果對(duì)比分析都能很好的鑒定出種，但5.8 S-ITS區(qū)域?qū)ΨN內(nèi)差異性更為敏感。

16種中8種酵母菌在發(fā)酵型乳制品和酵頭中均有分布，在乳制品中的占非釀酒酵母的比例高于酵頭。不同基物和不同地點(diǎn)的酵母菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯的差異。

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Isolation and Identification of Yeasts from the Traditional Fermented Dairy Products and Fermented Flour Starters in Xinjiang

WANG Guanqun1， HAN Peiji2， YANG Wenju3， WANG Xingyu1， XU Qian1， ZHU Lixia*1
(1.Xinjiang Production&Construction Group Key Laboratory of Agricultural Products Processing in Xinjiang South，Alar 843300，China；2.State Key Laboratory of Mycology，Beijing 100101，China；3.Xinjiang Product Quality Supervision and Inspection Institute，Urumchim 830004，China）

In the study，the local yeast community from the traditional fermented foods（Qiaotou and horse milk wine）in Xinjiang was analyzed.The total 472 yeast isolates of 161 samples were collected from 21 different regions using the methods of YPD enrichment culture，dilution and spread-culture，and were grouped into 16 different culture types by the WL colony morphology. Eleven strains representing different WL types were sequenced with 5.8S-ITS region and 26S D1/D2 region primers，and blasted in the International Nucleotide Sequence Database to identify them into 6 genus and 8 species.Results showed that among the 472 yeast isolates，there were 263Saccharomyces cerevisiae strains，156 Issatchenkia orientalis，10 Torulaspora delbrueckii，9 Pichia fermentans，21 Saccharomyces unisporus，7 Metschnikowia pulcherrima，4 Pichia membranifaciens and 2 Clavispora lusitaniae.It was obvious that Saccharomyces sp.and Issatchenkia sp.were dominant in the traditional yeast community and rich diversities occurred in different regions and different isolated substances.This study was the first time to show the yeast community in the traditional foods from the extensive sampled regions and would encourage further utilization of the potential yeast strains and provide a good reference for the quality of traditional fermented foods in Xinjiang.

yeast community，5.8S-ITS，26SrDNA，identification

TS 261.1

A

1673—1689（2015）07—0691—08

2015-01-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260393；13060023）；真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2014）；兵團(tuán)工業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2014BA026）。

*通信作者：朱麗霞（1975—），女，新疆昌吉人，副教授，主要從事食品微生物及傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究。E-mail：judyzhu1@sina.com