長(zhǎng)枝木霉代謝物對(duì)極細(xì)鏈格孢產(chǎn)毒抑制機(jī)制解析

邵學(xué)輝 張樹武 徐秉良

收稿日期：2023-09-15 接受日期：2023-11-23

基金項(xiàng)目：甘肅省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（23YFNA0020）；甘肅省科技重大專項(xiàng)（22ZD6NA045）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)“伏羲杰出人才培育計(jì)劃”項(xiàng)目（Gaufx-03J03）；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021-1-39）

作者簡(jiǎn)介：邵學(xué)輝，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橘Y源利用與植物保護(hù)。E-mail：1030372086@qq.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：xubl@gsau.edu.cn；E-mail：zhangsw704@126.com

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230369

摘? ? 要：【目的】明確長(zhǎng)枝木霉（SC5）代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢（ABL2）產(chǎn)毒抑制機(jī)制?！痉椒ā恳愿皇刻O果的葉片為供試材料，通過生長(zhǎng)速率法、LC-MS和RT-qPCR技術(shù)測(cè)定了SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落生長(zhǎng)、6種非寄主選擇性毒素產(chǎn)生及產(chǎn)毒相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用?！窘Y(jié)果】質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落生長(zhǎng)和致病力具有顯著的抑制作用，第6天時(shí)抑制率分別為38.08%和76.96%；同時(shí)，0.5 mg·mL-1 SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌株產(chǎn)生的非寄主選擇性毒素TEN、ALT和TeA均具有顯著抑制作用，其中處理2 d后對(duì)毒素的抑制作用最顯著，其含量分別降低69.39%、98.51%和48.99%，并且其合成相關(guān)基因TES、TES（1）、PksA和PksJ的表達(dá)量顯著下調(diào)，分別降低89.02%、98.20%、46.49%和40.13%，但是對(duì)ABL2菌株非寄主選擇性毒素ATX-I含量和參與編碼其合成的PksF基因表達(dá)量具有提升作用?！窘Y(jié)論】質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌株生長(zhǎng)和致病力具有抑制作用，可能通過調(diào)控ABL2菌株TES、TES（1）、PksA和PksJ基因下調(diào)表達(dá)，進(jìn)而降低TEN、ALT和TeA的毒素的產(chǎn)生量及致病力。

關(guān)鍵詞：蘋果葉片；極細(xì)鏈格孢；長(zhǎng)枝木霉；毒素；基因表達(dá)；生物防治

中圖分類號(hào)：S661.1? S436.661 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2024）01-0133-10

Identification and mechanism of Trichoderma longibrachiatum metabolites in inhibiting the Alternaria tenuissima toxin production

SHAO Xuehui， ZHANG Shuwu*， XU Bingliang*

（College of Plant Protection， Gansu Agricultural University/Engineering Laboratory for Biological Control of Crop Diseases and Pests， Lanzhou， 730070， Gansu， China）

Abstract： 【Objective】 Alternaria spp. can cause a variety of apple leaf diseases， which occur in all major apple producing areas in the world. It can lead to brown disease spots in apple leaves and even result in early defoliation， which seriously affects the development of apple industry and causes huge economic losses. Apple leaf blight caused by Alternaria tenuissima was found for the first time in apple producing areas of Gansu province. This fungus can damage apple leaves and petioles， causing leaves to die and fall off. A. alternata mainly damages plants by producing Alternaria toxins. The Alternaria toxins that have been found can be divided into five categories， i. e， diphenyl-α-pyrones and their derivatives， perylenequinones and their derivatives， tetraamino acids and their derivatives， long-chain amino polyols of glycerol tricarboxylate compounds， and hybrid structures. All of them have obvious toxicity， which can cause serious harm to plants and endanger the food safety of agricultural products. At present， chemical control is still the main means to prevent and control the diseases caused by Alternaria fungi. However， due to the influence of Alternaria resistance and environmental pollution， it is of great significance to find a series of biocontrol agents with higher controlling effect on Alternaria. Biocontrol of Trichoderma is safer and greener than the traditional chemical control methods. Trichoderma metabolites are also good antifungal substances， with broad-spectrum and efficient antibacterial activity， inhibiting the growth and metabolism of pathogenic fungi. The growth and metabolism of A. tenuissima ABL2 strain were inhibited by Trichoderma longibrachiatum SC5 metabolites. The content of non-host selective toxins in the metabolites of A. tenuissima ABL2 strain and the relative expression of genes related to the synthesis of A. tenuissima toxin were determined. The inhibition mechanism of T. longibrachiatum SC5 metabolites on A. tenuissima ABL2 strain production was clarified. The aim was to provide a reference and theoretical basis for the prevention and control of apple leaf blight caused by A. tenuissima. 【Methods】 T. longibrachiatum SC5 and A. tenuissima ABL2 strains were cultured on PDA medium for 7 days. The PDB liquid medium was made， and the SC5 strain was cultured on the medium for 15 days. The fermentation broth was filtered with filter paper and the broth was retained. The liquid was added with 3-fold-volume-ethyl acetate and oscillated for 1 hour. After standing extraction， the organic phase was evaporated in a rotary evaporator， and 1 ml of methanol was added to dissolve and evaporate. The SC5 metabolites were made into an orginal liquid with a concentration of 200.00 mg·mL-1， and added to the PDA medium to make a drug-containing medium with different concentrations of SC5 metabolites （0.01， 0.05， 0.10， 0.25， 0.50， 1.00 and 2.00 mg·mL-1）. The ABL2 strain was inoculated on the drug-containing medium and cultured for 24 hours in a light incubator. The diameter of ABL2 colonies was measured and the colony inhibition rate was calculated on the 2， 4， 6， 8 and 10 days by cross method. On the 6th day， 5 mycelial plugs were prepared with a sterile puncher and placed in a 10 mL of EP tube， with 3 replicates per concentration. After adding 8 mL of ethyl acetate， ultrasonic oscillation was performed for 1.5 hours， centrifuged and filtered. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness， 1 mL of methanol was added to dissolve it， and 5 mm circular sterile filter paper was placed in it for later use. Inoculate healthy leaves after disinfection and rinsing using stab inoculation method. A circular filter paper soaked in ABL2 metabolites was placed at each wound， and placed in an artificial climate box for moisturizing culture for 7 days. The lesion size was measured and the pathogenic activity of the metabolites was calculated. The optimal inhibitory concentration of SC5 metabolites on the growth of ABL2 strain was screened. The total RNA and the metabolites of ABL2 strain growing in the optimal concentration of drug-containing medium was extracted on 2， 4， 6， 8 and 10 days， and the quantitative standard curves of six non-host-selective toxins were made respectively. Six toxin-producing related gene primers were designed and verified for specificity. Liquid Chromatograph Mass Spectrometer and Real Time Quantitative PCR were used to determine the content of toxins in ABL2 metabolites and the relative expression of toxin-producing related genes. 【Results】 The crude extract of SC5 metabolism at a concentration of 0.5 mg·mL-1 had a significant inhibitory effect on the growth and pathogenicity of ABL2， and the inhibition rates were 38.08% and 76.96% on the 6th day， respectively. 0.5 mg·mL-1 SC5 metabolic crude extract had a significant inhibitory effect on the non-host selective toxins TEN， ALT and TeA produced by ABL2 strain. The inhibitory effect was the most significant after 2 days treatment， and its content was reduced by 69.39%， 98.51% and 48.99%， respectively. The expression levels of TES， TES （1）， PksA and PksJ were significantly down-regulated by 89.02%， 98.20%， 46.49% and 40.13%， respectively. However， the content of non-host selective toxin ATX-I of ABL2 strain and the expression of PksF gene involved in its synthesis increased. 【Conclusion】 The SC5 metabolites of T. longibrachiatum at a concentration of 0.5 mg·mL-1 had an inhibitory effect on the growth and pathogenicity of A. tenuissima ABL2 strain. It could reduce and inhibit the content of TEN， ALT and TeA by down-regulating the expression of TES， TES （1）， PksA and PksJ genes in ABL2 strain， thereby reducing its pathogenicity. This study can provide a theoretical basis for the biological control of ABL2 strain.

Key words： Fuji apple leaves; Alternaria tenuissima; Trichoderma longibrachiatum; Toxin; Gene expression; Biological control

植物病原鏈格孢（Alternaria spp.）引起的蘋果病害，在世界各大產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[1]。如蘋果鏈格孢?；停ˋ. alternata f. sp. mail）引起的蘋果斑點(diǎn)落葉病，主要危害蘋果葉片，使葉部出現(xiàn)褐色病斑，最終導(dǎo)致提前落葉[2]。同時(shí)，也可危害嫩枝和果實(shí)，導(dǎo)致樹勢(shì)衰弱，影響花芽形成和果實(shí)正常生長(zhǎng)[3]。但是，近年來筆者課題組在甘肅省蘋果產(chǎn)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)由極細(xì)鏈格孢（A. tenuissima）引起的蘋果葉枯病，發(fā)生后嚴(yán)重導(dǎo)致蘋果葉片枯死脫落。據(jù)報(bào)道，鏈格孢菌可通過產(chǎn)生鏈格孢毒素危害植物。已發(fā)現(xiàn)的鏈格孢毒素可分為5類，分別為二苯-α-吡喃酮類及其衍生物、苝醌類及其衍生物、四氨基酸及其衍生物、長(zhǎng)鏈氨基多元醇的丙三羧酸酯類化合物、混雜多樣結(jié)構(gòu)[4-5]。目前，研究最多的鏈格孢毒素有交鏈孢酚（AOH：Alternariol）、交鏈孢單甲醚（AME：Alternariol monomethyl ether）、交鏈孢烯（ALT：Altenuene）、交鏈孢毒素（ATX-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ：Altertoxin）、騰毒素（TEN：Tentoxin）、細(xì)交鏈孢菌酮酸（TeA：Tenuazonic Acid），其不僅對(duì)植物產(chǎn)生嚴(yán)重危害[6-7]，而且危及農(nóng)產(chǎn)品食品安全[8-9]。同時(shí)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢毒素的生物合成受相關(guān)基因調(diào)控。Wenderoth等[10]鑒定了AOH、AME生物合成相關(guān)的基因簇PksI、omtI、moxI、aohR、sdrI、doxI并確定其功能；Liu等[11]發(fā)現(xiàn)聚酮合酶基因Pks參與鏈格孢代謝途徑且參與次生代謝物的合成，進(jìn)而影響鏈格孢毒素含量；Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證了TES和TES（1）基因是鏈格孢合成TEN毒素所需的兩個(gè)基因簇。目前，化學(xué)防治依舊是防控鏈格孢屬真菌引起的病害的主要手段[13]，但是長(zhǎng)期大量使用可導(dǎo)致鏈格孢菌抗藥性產(chǎn)生和污染環(huán)境[14]，因此，尋找一類對(duì)鏈格孢具有較好防治效果的生防制劑對(duì)該病害的防控具有重要意義。

木霉作為一種優(yōu)良的生防菌，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的病害防治[15]。前期Abdel-Lateff等[16]從長(zhǎng)枝木霉代謝物中分離出一種吡喃酮衍生物，發(fā)現(xiàn)其具有清除自由基、抗氧化、抑菌活性；Mironenka等[17]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉（Trichoderma harzianum）代謝物可抑制黃色鐮孢菌產(chǎn)孢，同時(shí)減少其色素和主要毒素的含量。但是，目前有關(guān)木霉代謝物對(duì)極細(xì)鏈格孢產(chǎn)毒抑制機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，筆者在本試驗(yàn)中評(píng)價(jià)了長(zhǎng)枝木霉代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢的抑菌效果和毒素產(chǎn)生的影響，旨在為防治鏈格孢引起的蘋果葉枯病提供參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 極細(xì)鏈格孢（A. tenuissima）ABL2（序列號(hào)：MZ222271）和長(zhǎng)枝木霉（T. longibrachiatum）SC5（序列號(hào)：ON786721）菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.1.2 供試葉片 供試葉片采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果種植園，品種為富士。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液與試劑 鏈格孢毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（AOH、AME、ALT、TEN、TeA、ATX-Ⅰ）購(gòu)自青島普瑞邦生物工程有限公司；乙酸乙酯（分析純）、甲酸（色譜純）、乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；TRNzol Universal 總RNA提取試劑購(gòu)自TIANGEN公司；cDNA合成試劑盒、RT-qPCR試劑盒和DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa Bio公司；上下游引物由北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成。

1.2 方法

1.2.1 長(zhǎng)枝木霉SC5和極細(xì)鏈格孢ABL2菌株活化 將低溫保存的SC5和ABL2菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)7 d后，并再次制取菌餅接種于新的PDA培養(yǎng)基活化備用。

1.2.2 長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗提物制備 SC5代謝粗提物制備參照Liu等[18]的方法并稍作修改。利用無菌打孔器制取活化3 d且直徑為5 mm的SC5菌餅，并接種于200 mL PDB培養(yǎng)基（3個(gè)菌餅），然后置于光照、28 ℃、150 r·min-1的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)15 d后，利用中速定性濾紙抽濾去除菌絲，并將濾液經(jīng)4 ℃、10 000 r·min-1離心30 min后，利用3倍體積的乙酸乙酯充分振蕩并萃取。將乙酸乙酯相置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干濃縮并經(jīng)1 mL甲醇溶解和0.22 μm濾器過濾，再次濃縮獲得SC5代謝粗提物。

1.2.3 長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢ABL2生長(zhǎng)的抑制作用 將濃縮后的SC5代謝粗提物利用甲醇配制質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1母液。同時(shí)，分別取1.000、0.500、0.250、0.125、0.050、0.025和0.005 mL的母液用甲醇制成1 mL的工作液，并加入99 mL滅菌后待凝固的PDA中，制得含SC5代謝粗提物質(zhì)量濃度為2.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05和0.01 mg·mL-1含藥培養(yǎng)基，以加入1 mL甲醇的培養(yǎng)基作為對(duì)照。然后，將直徑為5 mm的ABL2菌餅接種于不同濃度含藥培養(yǎng)基中央，并置于溫度為25 ℃全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理和對(duì)照均設(shè)10次重復(fù)，分別在接種培養(yǎng)第2、4、6、8和10 d時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算SC5代謝粗提物對(duì)ABL2生長(zhǎng)抑制率。

[生長(zhǎng)抑制率/%=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑-5 mm×100]。

1.2.4 長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢ABL2致病力的影響 將1.2.3中經(jīng)不同濃度SC5代謝粗提物和甲醇處理培養(yǎng)6 d時(shí)的ABL2菌株作為供試處理菌株和對(duì)照菌株，參照Desrochers等[19]的方法提取ABL2菌株代謝產(chǎn)物，并測(cè)定其致病力。利用直徑為7 mm打孔器制取5個(gè)不同濃度處理菌株和對(duì)照菌株菌餅，并分別置于10 mL EP管中，每個(gè)處理3次重復(fù)。然后，分別加入8 mL乙酸乙酯，并經(jīng)渦旋振蕩和超聲提取后離心（8000 r·min-1）去除菌餅、菌絲。待靜置1 h后將乙酸乙酯相置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干濃縮并經(jīng)1 mL甲醇溶解和0.22 μm濾器過濾，收集獲得不同濃度處理菌株和對(duì)照菌株代謝產(chǎn)物。然后，將無菌濾紙片（直徑5 mm）置于不同濃度處理菌株和對(duì)照菌株代謝產(chǎn)物浸泡1 h，制備含有ABL2代謝產(chǎn)物的濾紙片備用。利用75%乙醇將健康的蘋果葉片消毒后，經(jīng)無菌水清洗3次，然后，利用吸水紙吸干葉片表面水分，采用針刺接種法刺破葉片表面，并將含有不同濃度處理菌株和對(duì)照菌株ABL2代謝產(chǎn)物（陽性對(duì)照）的濾紙片接種于刺傷部位，試驗(yàn)以1 mL甲醇浸泡等時(shí)間的濾紙片作為陰性對(duì)照，每組5個(gè)重復(fù)。接種后置于人工氣候箱，于第5天時(shí)利用十字交叉法測(cè)量其病斑大小。

1.2.5 長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢ABL2毒素含量的影響 將SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落和致病力抑制最佳濃度作為供試濃度，測(cè)定SC5代謝粗提物對(duì)ABL2毒素含量的影響。試驗(yàn)以1.2.3 中SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落生長(zhǎng)抑制作用最佳濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)的ABL2菌株作為處理，并以加入等體積甲醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)的ABL2菌株作為對(duì)照，分別于培養(yǎng)2、4、6、8和10 d后制備處理和對(duì)照的菌餅，并參考1.2.4方法提取和制備處理和對(duì)照菌株代謝產(chǎn)物。待制備獲得處理和對(duì)照菌株代謝產(chǎn)物后，利用LC-MS檢測(cè)其AOH、AME、ALT、TEN、TeA和ATX-Ⅰ含量。試驗(yàn)利用甲醇作為溶劑配制不同質(zhì)量濃度（1000、500、250、100、50、25、10、5和1 ng·mL-1）鏈格孢毒素AOH、AME、ALT、TEN、TeA和ATX-Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)溶液，并利用LC-MS測(cè)定后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1、表1）。<＼＼LENOVO-FAN＼fapai＼果樹學(xué)報(bào)＼1期-果樹學(xué)報(bào)-定版＼1-2024-1-學(xué)報(bào)-飛翔＼Image＼image11.png>

然后，利用LC-MS檢測(cè)處理和對(duì)照菌株代謝產(chǎn)物AOH、AME、ALT、TEN、TeA和ATX-Ⅰ含量。超高效液相色譜條件為：Agilent 1290超高效液相色譜儀配備Elipse Plus C18 （規(guī)格1.8 μm，2.1 mm×150 mm）色譜柱；柱溫設(shè)置為30 ℃；流動(dòng)相A為0.2%的甲酸水，B 為加入0.2%氨水的乙腈；進(jìn)樣量為5 μL；流速設(shè)置0.3 mL·min-1（表2）；質(zhì)譜條件為：Agilent 6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器配備電噴霧離子源，采用正離子模式（ESI+）；掃描范圍（m·z-1）設(shè)置為100～900；錐孔電壓分別設(shè)置為80、95 eV：碰撞電壓為15、25、35 eV；NMR數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)模式；錐孔氣流150 L·h-1；離子源溫度350 ℃；噴霧電壓7500 V（表3）。同時(shí)，利用Agilent MassHunter Quantitative Analysis（For QQQ）分析并計(jì)算處理和對(duì)照菌株代謝產(chǎn)物AOH、AME、ALT、TEN、TeA和ATX-Ⅰ含量。

1.2.6 長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢ABL2毒素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響 （1）樣品采集及總RNA的提取和cDNA第一鏈合成。將SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落和致病力抑制最佳濃度作為供試濃度，測(cè)定SC5代謝粗提物對(duì)ABL2毒素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)以1.2.3中SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落生長(zhǎng)抑制作用最佳濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)的ABL2菌株作為處理，并以加入等體積甲醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)的ABL2菌株作為對(duì)照，待處理2、4、6、8和10 d后收集處理和對(duì)照ABL2菌株菌絲。菌絲處理方法參照鄭朋飛等[20]的，將處理和對(duì)照菌絲置于液氮中并充分研磨破碎，每個(gè)處理和對(duì)照均3個(gè)重復(fù)。然后，根據(jù)TRNzol Universal 總RNA提取試劑說明書提取RNA，并進(jìn)行濃度及A260/A280 比值測(cè)定。利用PrimeScript? RT reagent Kit （Perfect Real Time） 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成處理和對(duì)照樣品cDNA第一鏈。

（2）ABL2毒素合成相關(guān)基因表達(dá)量分析。試驗(yàn)以處理2、4、6、8和10 d后的處理和對(duì)照ABL2菌株菌絲cDNA第一鏈為模板，利用TB Green? Premix Ex Taq? （Tli RNaseH Plus）試劑盒測(cè)定SC5代謝粗提物對(duì)ABL2毒素合成相關(guān)基因[PksJ、PksA、PksI、PksF、TES、TES（1）]表達(dá)的影響，以BenA作為內(nèi)參基因，并利用2-??Ct法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表4。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MS office Excel 2021和IBM SPSS Statistics 27軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并運(yùn)用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，利用OriginPro 2021作圖并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢ABL2生長(zhǎng)的抑制作用

SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落的抑制作用隨著代謝粗提物濃度的增加而逐漸增強(qiáng)（圖2）。與對(duì)照（圖2-A）相比，經(jīng)質(zhì)量濃度為2.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05和0.01 mg·mL-1的SC5代謝粗提物處理6 d的ABL2菌落直徑顯著小于對(duì)照（圖2-B～H），且不同質(zhì)量濃度之間存在顯著差異。如表5所示，當(dāng)培養(yǎng)2 d時(shí)，質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落生長(zhǎng)抑制率達(dá)到最大值，為90.42%，當(dāng)SC5代謝粗提物質(zhì)量濃度大于0.05 mg·mL-1時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，抑制率趨于平穩(wěn)。

2.2 長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢ABL2致病力的影響

結(jié)果如圖3所示，經(jīng)不同濃度的SC5代謝粗提物處理后的ABL2代謝產(chǎn)物致病力隨著濃度的增加而減弱。接種葉片5 d后，經(jīng)質(zhì)量濃度為0.01～0.25 mg·mL-1（圖3-A、B）SC5代謝粗提物處理后的ABL2代謝產(chǎn)物的致病力呈降低趨勢(shì)，與其他處理相比，經(jīng)質(zhì)量濃度為0.50～2.00 mg·mL-1 （圖3-A、B）SC5代謝粗提物處理后的ABL2代謝產(chǎn)物致病力顯著降低，與陽性對(duì)照相比分別降低了76.96%、81.94%和80.95%。

2.3 長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗提物對(duì)極細(xì)鏈格孢ABL2毒素產(chǎn)生的影響

結(jié)果表明（圖4），SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌株ALT、AME、AOH、TeA、ATX-I和TEN毒素含量具有顯著的影響，并且不同時(shí)間段的毒素含量存在明顯差異。與對(duì)照相比，處理2～8 d后，SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌株ALT（圖4-A）和TEN（圖4-D）毒素含量具有顯著的抑制作用，其處理時(shí)間段內(nèi)平均含量分別較對(duì)照降低59.74%和84.41%。然而，處理2～8 d后，SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌株AME（圖4-B）、AOH（圖4-C）、TeA（圖4-E）和ATX-I（圖4-F）毒素含量具有不同程度的影響，其中在處理2 d后均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但是隨著處理時(shí)間的增加，其抑制作用不顯著，與對(duì)照相比，處理時(shí)間段內(nèi)TeA含量整體呈降低趨勢(shì)，ATX-I含量整體呈上升趨勢(shì)，AOH和AME含量在處理6～8 d時(shí)顯著高于對(duì)照。

2.4 產(chǎn)毒相關(guān)基因表達(dá)分析

結(jié)果表明（圖5），SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌株產(chǎn)毒相關(guān)基因TES、TES（1）、PksJ、PksA、PksF和PksI表達(dá)具有顯著的影響，并且不同時(shí)間段的表達(dá)存在顯著差異。與對(duì)照相比，處理2～10 d，SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌株TES（圖5-A）、TES（1）（圖5-B）、PksA（圖5-D）和PksI（圖5-F）基因表達(dá)量具有顯著的抑制作用，其處理時(shí)間段內(nèi)平均表達(dá)量較對(duì)照降低了61.35%、65.83%、56.94%和65.19%。然而，處理2～10 d，SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌株P(guān)ksJ（圖5-C）和PksF（圖5-E）基因表達(dá)量具有不同程度的影響，其中在處理2～4 d時(shí)對(duì)PksF表現(xiàn)出一定的抑制作用，但隨著處理時(shí)間的增加，抑制作用變?yōu)榇龠M(jìn)作用，而在處理2～8 d時(shí)對(duì)PksJ表現(xiàn)出一定的抑制作用，但在處理10 d后卻由抑制變?yōu)榇龠M(jìn)。

3 討 論

Liu等[11]發(fā)現(xiàn)鏈格孢代謝途徑中與毒素合成相關(guān)的聚酮合酶Pks基因會(huì)受到肉桂醛的抑制；Yun等[21]證明TAS1可催化異亮氨酸和乙酰輔酶合成TeA；Saha等[22]研究發(fā)現(xiàn)PksJ下調(diào)會(huì)直接抑制AOH和AME的合成，PksB和PksI的下調(diào)并不直接影響AOH和AME的合成，而PksH則通過調(diào)節(jié)PksJ和PksI 的表達(dá)來控制AOH和AME的合成。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)分別編碼一個(gè)非核糖體合成酶和一種細(xì)胞色素P450蛋白的基因TES和TES（1），并進(jìn)一步驗(yàn)證TES和TES（1）參與Tentoxin合成。目前，利用長(zhǎng)枝木霉代謝粗提物抑制極細(xì)鏈格孢產(chǎn)毒的研究尚未報(bào)道。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)0.5 mg·mL-1的SC5代謝粗提物對(duì)ABL2菌落生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的致病力有較好的抑制效果，并通過抑制產(chǎn)毒相關(guān)基因的表達(dá)減少毒素含量。通過分析基因表達(dá)量和毒素含量后發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加PksJ表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)，同時(shí)TeA含量呈下降趨勢(shì)，且在第2天、第4天和第6天時(shí)顯著低于對(duì)照，但在第10天時(shí)PksJ表達(dá)量高于對(duì)照，同時(shí)TeA含量也高于對(duì)照，表明TeA的合成主要受PksJ調(diào)控，這與Liu等[11]的研究結(jié)果一致；而PksA的表達(dá)量先上升后下降，在第6天時(shí)達(dá)到最大值，但均顯著低于對(duì)照，這與TEN毒素含量的變化趨勢(shì)相同，初步推測(cè)PksA參與了TEN毒素的生物合成，同時(shí)PksI表達(dá)量也隨時(shí)間的增加呈上調(diào)趨勢(shì)，但顯著低于對(duì)照，且AOH和AME含量隨時(shí)間變化呈上升趨勢(shì)，在第6天和第8天時(shí)卻顯著高于對(duì)照，表明PksA和PksI共同參與AOH和AME的生物合成，且PksA在第6天時(shí)開始參與調(diào)控TEN毒素的生物合成，這與Liu等[11]的研究結(jié)果一致，但與Saha等[22]的研究結(jié)果略有差異，初步判斷差異的原因是抑菌物質(zhì)和致病菌的不同；TES和TES（1）表達(dá)量與對(duì)照相比顯著降低，同時(shí)TEN含量（ρ）在第6天達(dá)到最大值8.74 ng·mL-1，說明TES、TES（1）主要參與調(diào)控TEN的生物合成，這與Li等[12]等的研究結(jié)果相同；ATX-I含量呈上升趨勢(shì)，在第4天、第6天、第8天和第10天時(shí)均顯著高于對(duì)照，這與PksF表達(dá)情況相似，同時(shí)ALT含量呈上升趨勢(shì)且顯著低于對(duì)照，這與PksI表達(dá)情況相似，但PksF和PksI如何調(diào)控ATX-I和ALT的生物合成還有待研究。結(jié)果表明，SC5代謝粗提物在0.5 mg·mL-1的質(zhì)量濃度下會(huì)抑制ABL2菌落的生長(zhǎng)和非寄主選擇性毒素TEN、ALT和TeA的生物合成，從而減少毒素含量，但有關(guān)SC5代謝粗提物抑制ABL2菌株毒素合成及其相關(guān)基因表達(dá)的分子作用機(jī)制有待深入研究。

4 結(jié) 論

（1）篩選獲得了長(zhǎng)枝木霉SC5代謝粗體物對(duì)極細(xì)鏈格孢ABL2菌株生長(zhǎng)抑制作用及其代謝物質(zhì)致病作用最佳質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1，處理6 d后，其對(duì)ABL2菌落生長(zhǎng)和致病力抑制率分別為38.08%和76.96%。

（2）初步推測(cè)SC5代謝粗提物抑制ABL2菌株產(chǎn)毒的機(jī)制可能通過抑制ABL2菌株生長(zhǎng)同時(shí)抑制其產(chǎn)毒相關(guān)基因如TES、TES（1）、PksA和PksJ基因的表達(dá)，進(jìn)而降低ALT、TEN和TeA毒素含量，削弱ABL2菌株致病力。

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