百香果（Passiflora edulis）R2R3-MYB基因家族的結(jié)構(gòu)和功能分析

張丹 鄭平 鄧彪 柴改鳳 安昌 鄧考 張文斌 陸宇明 盧翔宇 王小媚 秦源

收稿日期：2023-06-16 接受日期：2023-08-09

基金項目：廣西自然科學基金面上項目（2022GXNSFAA035535）；廣西農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務(wù)專項（桂農(nóng)科2021YT046）；中國博士后科學基金（2022MD713731）；平潭科技研究院科技創(chuàng)新項目（PT2021007，PT2021003）

作者簡介：張丹，女，碩士，研究方向為植物遺傳育種與生殖發(fā)育。E-mail：danzhang202110@163.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：yuanqin@fafu.edu.cn；E-mail：wangxiaomei159@163.com

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230232

摘? ? 要：【目的】探究R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在代謝、發(fā)育等多種生物學過程中發(fā)揮的調(diào)控作用。對百香果R2R3-MYB基因家族進行表達分析并探究其在花果發(fā)育過程中的調(diào)控機制，對深入研究R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在百香果中的生物學作用中具有重要意義?！痉椒ā炕诎傧愎蚪M數(shù)據(jù)，通過HMM搜索對R2R3-MYB家族成員進行篩選鑒定，并利用實時熒光定量PCR分析其在百香果花不同組織中的表達模式?！窘Y(jié)果】從百香果基因組中鑒定出99個R2R3-MYB基因，根據(jù)系統(tǒng)進化分析將其分為36個亞組。99個R2R3-PeMYB基因隨機分布在9條百香果染色體上?；蚝突蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，R2R3-PeMYB在同一亞組中具有相對保守的結(jié)構(gòu)特征。共線性分析表明，片段復制事件促進了百香果R2R3-MYB家族的擴張?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)R2R3-PeMYB基因在百香果花的不同組織的不同發(fā)育階段中表現(xiàn)出差異的表達模式，說明R2R3-PeMYB基因在花不同組織和果實的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，尤其是PeMYB62和PeMYB63在百香果果皮轉(zhuǎn)色期的高表達，說明其可能參與百香果花青素的合成。同時8個R2R3-PeMYB基因在非生物脅迫（冷、熱、鹽和滲透壓）下也表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，說明R2R3-PeMYB基因還受到非生物脅迫的誘導?！窘Y(jié)論】鑒定了99個R2R3-PeMYB基因家族成員，發(fā)現(xiàn)其在百香果花果發(fā)育和脅迫誘導方面發(fā)揮重要作用，為今后研究百香果R2R3-MYB基因在花果發(fā)育中的功能和進化提供了有價值的線索。

關(guān)鍵詞：百香果；R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子；系統(tǒng)發(fā)育分析；花果發(fā)育

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）01-0012-18

Structure and function analysis of R2R3-MYB gene family from passion fruit （Passiflora edulis）

ZHANG Dan1， 2， ZHENG Ping1， 3， DENG Biao2， CHAI Gaifeng1， AN Chang 1， DENG Kao1， ZHANG Wenbin4， LU Yuming2， LU Xiangyu2， WANG Xiaomei1， 2*， QIN Yuan1， 3*

（1College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， Fujian， China; 2Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi， China; 3Haixia Institute of Science and Technology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350000， Fujian， China; 4Fine Variety Breeding Farm in Xinluo District， Longyan 364000， Fujian， China）

Abstract： 【Objective】 The R2R3-MYB transcription factors （TFs） are widely involved in the regulation of various biological processes in plants， including primary and secondary metabolism， growth and development， and response to environmental factors and plant hormones. In this study， the expression of R2R3-MYB gene family in passion fruit was systematically analyzed and its regulatory mechanism during flower and fruit development was explored. 【Methods】 In this study， the hidden Markov Model profile （HMM） of the MYB binding domain （PF00249） was obtained from the Pfam database， which was used as the seed model for the HMMER search of candidate PeMYB genes from the passion fruit genome in TBtools. The redundant sequences were removed manually. The SMART and the NCBI-CDD database were used to cross-check the presence of the MYB domain in candidate sequences. The physicochemical features of the potential MYB protein sequences， including molecular weight， theoretical isoelectric point （pI）， and the number of amino acids were further analyzed using ExPASy. The MYB protein sequences of Arabidopsis were downloaded from the Plant Transcription Factor Database. Based on the alignment of the R2R3-MYB protein sequence of passion fruit and Arabidopsis thaliana， a neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by MEGA. The conserved motifs， gene structure and chromosome location were analyzed with TBtools. We also predicted the putative miRNA target sites of PeMYB genes by the online psRNATarget Server. Eight PeMYB genes clustered with Arabidopsis R2R3-MYB gene members from the above subgroups of phylogenetic trees were selected for qRT-PCR analysis under cold， heat， osmotic， and salt stress. In addition， the candidate PeMYB genes were analyzed by qRT-PCR analysis in the peel of passion fruit at different developmental stages after the pollination. 【Results】 A total of 99 R2R3-MYB genes were identified from passion fruit genome. The lengths of the protein sequences of PeMYB ranged from 113 （PeMYB78） to 1013 （PeMYB39） amino acids， and molecular weight （MWs） varied from 12.89 ku （PeMYB78） to 113.94 ku （PeMYB39）. Moreover， the theoretical pI of PeMYBs was from 4.73 （PeMYB16） to 10.15 （PeMYB76）. According to the topological structure of the phylogenetic tree and the classification of AtMYBs， the 99 R2R3-PeMYBs were divided into 36 groups （P1-P36）. Most subgroups contained the R2R3-MYB members from both passion fruit and Arabidopsis， suggesting that they might be derived from a common ancestor. The structural analysis， including motifs and gene structure， illustrates that the R2R3-PeMYBs in the same subgroup have relative conserved structural features. The result showed that the number of exons varied from 1 to 13 in PeMYB genes. Most R2R3-PeMYB genes （53.3%） had similar distributions of three exons and two introns and a few R2R3-PeMYBs （PeMYB58， PeMYB60， PeMYB82） contained 12 or more exons. Motif 1， motif 2， and motif 3 were located in the N-terminal of almost all R2R3-PeMYB protein sequences， which contain conserved tryptophan residues and are related to R2 and R3 domains. The R2R3-PeMYB genes were randomly distributed on 9 passion fruit chromosomes. Most genes were located at the distal ends of the chromosomes. Chromosome 1 had the maximum number of R2R3-MYB genes （28 genes， 28.3%）， followed by chromosome 6， which had 15 （15.2%） genes. The gene duplication event analysis revealed 37 pairs of segmentally duplicated genes and 7 pairs of tandemly duplicated genes were identified in R2R3-PeMYBs. The six tandem duplication events were on chromosomes 1， 2， 4， 5， and 6 and most segmental duplication events occurred on chromosome 1. Of the 99 genes， 54 （54.5%） produced 37 segmental duplication gene pairs suggesting that segmental duplication events contributed to the expansion of the R2R3-MYB family of passion fruit. Based on transcriptome data and qRT-PCR analysis， it was found that R2R3-PeMYB genes showed different expression patterns in different floral tissues at different developmental stages. Most of the R2R3-MYB genes （eg： PeMYB79 and PeMYB80） were expressed in the early development stage of floral tissues and showed a decreasing trend in the late development stages. A few genes showed high expression patterns throughout the development of different floral tissues. At all stages of ovule development， some R2R3-PeMYB genes， like PeMYB34 and PeMYB39， were highly expressed. In addition， the high expression of PeMYB62 and PeMYB63 in the peel color transformation period of passion fruit indicated that they may be involved in the anthocyanin synthesis pathway of passion fruit. Moreover， PeMYB62 and PeMYB63 genes were the targeted genes of Ped-miR828 family， and miR828 has been reported to be involved in the anthocyanin synthesis pathway. This further indicates that the two genes are likely to play an important role in the anthocyanin synthesis pathway. These results indicated that R2R3-PeMYB genes play an important role in the development of different floral tissues and fruit. At the same time， eight R2R3-PeMYB genes also showed different responses to abiotic stress （cold， heat， salt and osmotic stresses）， these R2R3-PeMYB genes can be significantly regulated by at least two stress treatments. The result indicates that R2R3-PeMYB genes were also induced by various abiotic stress. 【Conclusion】 In this study， 99 R2R3-PeMYB gene family members were identified and found to play an important role in flower and fruit development and stress induction of passion fruit， which provided valuable clues for future research on the function and evolution of R2R3-MYB genes in flower and fruit development.

Key words： Passion fruit; R2R3-MYB transcription factors; Phylogenetic analysis; Flower and fruit development

百香果（Passiflora edulis）是西番蓮科西番蓮屬的一種草質(zhì)藤本植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。百香果營養(yǎng)價值高，果實可供鮮食，也可加工成多種副產(chǎn)品，在鮮果消費和工業(yè)用途中備受青睞[2]。然而，目前國內(nèi)百香果主栽品種均為外來引進品種，種植適應(yīng)性較差，且百香果成花坐果易受到溫度、光照、水分等環(huán)境因素的影響[3]，難以實現(xiàn)豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，種植百香果高效益、高收益的特點未得到體現(xiàn)。因此，探索百香果的花果發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)的調(diào)控機制，對促進百香果的經(jīng)濟效益提升具有重要意義。

MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大和最有特點的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其定義為存在1～4個50～53個氨基酸的MYB重復序列，形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）結(jié)構(gòu)[4]。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域中不完全重復序列的數(shù)目，可以將其分為4個亞家族：1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB，其中R2R3-MYB是植物中最大且研究最深入的MYB轉(zhuǎn)錄因子亞家族[5]。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物各種生物過程的調(diào)節(jié)，包括初級和次級代謝、生長發(fā)育以及對環(huán)境因素和植物激素的應(yīng)答[6-8]。

目前，已經(jīng)有許多研究人員對擬南芥和其他植物中R2R3-MYB基因進行了系統(tǒng)分析，明確了部分R2R3-MYB基因功能。在擬南芥中，若干R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子被確認參與類黃酮的合成[9]，其中AtMYB75/PAP1和AtMYB90/PAP2的過表達可以調(diào)節(jié)花青素的積累[10]。第7亞組中的AtMYB11/PFG1、AtMYB12/PFG1和AtMYB111/PFG可以調(diào)控黃酮醇的合成[11]。此外，不少R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)花和果實的發(fā)育。例如，AtMYB98在參與雌配子體發(fā)育和花粉管引導過程中調(diào)節(jié)輔助細胞分化[12]。在梨中，PbMYB25和PbMYB52可能參與了果實發(fā)育過程中木質(zhì)素生物合成的調(diào)節(jié)[13]。而且，大多數(shù)R2R3-MYB基因在植物對非生物脅迫的應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用[9]。例如，AtMYB2、AtMYB44和AtMYB74增強了植物對鹽脅迫的耐受性[14-16]，而AtMYB73在響應(yīng)鹽脅迫中起負調(diào)控作用[17]。再則，AtMYB96不僅參與植物抗旱，還通過促進CBF（C-repeat binding transcription factors）的表達來抵抗低溫[18]。而其他植物物種的MYB基因，如GhMYB73（Gossypium hirsutum L.）、TaMYB73（Triticum aestivum L.）和StMYB30（Solanum tuberosum L.），在轉(zhuǎn)基因植株中增強了對鹽脅迫的耐受性[19-21]。

作為植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，MYB轉(zhuǎn)錄因子群體的規(guī)模主要歸因于R2R3-MYB亞家族的快速擴張[22]。對不同物種中R2R3-MYB基因的系統(tǒng)鑒定和研究將進一步加深讀者對其進化和功能的理解，這已在許多作物和園藝植物中進行，如玉米、菠蘿、大豆等[23-25]。近期，百香果基因組序列已公布[26-27]，這為鑒定R2R3-MYB基因家族成員并探索其在百香果花果發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的潛在調(diào)控作用提供了良好的契機。

筆者在本研究中共鑒定了99個R2R3-MYB基因，并進行了一系列的系統(tǒng)分析，包括系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因組結(jié)構(gòu)、染色體分布、保守基序和表達模式分析。此外，還進行了qRT-PCR實驗以驗證候選PeMYB基因的表達模式，為進一步研究百香果R2R3-MYB基因家族在花果發(fā)育方面的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 百香果中MYB基因家族的鑒定

百香果（P. edulis）基因組數(shù)據(jù)來自國家基因組數(shù)據(jù)中心（National Genomics Data Center，https：//ngdc.cncb.ac.cn/）。從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）[28]中下載MYB結(jié)合域（PF00249）的隱馬爾科夫模型（Hidden Markov Model profile，HMM）。使用TBtools（v1.098745）中的Simple HMM Search[29]，以PF00249為模型從百香果基因組中搜索出候選PeMYB基因，截止到E值為0.01。對冗余序列進行手動刪除。使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和CDD數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）用于交叉驗證候選序列中MYB結(jié)構(gòu)域的存在。使用ExPASy（https：//www.expasy.org/）進一步分析潛在的MYB蛋白序列的物理化學特征，包括分子質(zhì)量、理論等電點（pI）和氨基酸的數(shù)量等信息。此外，通過在線網(wǎng)站Cell PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測推斷的PeMYB蛋白的亞細胞定位。

1.2 多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

使用DNAMAN軟件可視化R2和R3 MYB重復序列的分布，使用WebLogo生成保守基序Logos（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）。從Plant TFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/index.php）[30]中下載擬南芥MYB蛋白序列。使用MEGA（version 11.0）中的MUCLE對百香果R2R3-PeMYB蛋白和擬南芥R2R3-MYB蛋白序列進行多序列比對。根據(jù)百香果和擬南芥的R2R3-MYB蛋白序列的比對，用MEGA（version 11.0）采用Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用在線網(wǎng)站Evolview v2 （https：//www.evolgenius.info/evolview-v2/#login）[31]對進化樹進行美化。根據(jù)擬南芥AtMYB蛋白的分類，最終將百香果PeMYB蛋白分為36個組（P1～P36）[32]。

1.3 基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序分析

從百香果基因組的GFF文件中獲得PeMYB基因的外顯子分布。使用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析PeMYB蛋白的保守基序。使用Tbtools（v1.098745）[29]軟件可視化R2R3-PeMYB的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序。

1.4 百香果中PeMYB基因的染色體分布、基因復制分析

根據(jù)百香果基因組的GFF文件，使用TBtools軟件（v1.098745）[29]可視化PeMYB基因的染色體分布信息。利用TBtools軟件中的MCScanX分析R2R3-PeMYB基因的基因復制事件，并在TBtools的Advanced Circos中可視化結(jié)果?；诖笥?5%的同一性和超過75%基因長度的查詢覆蓋率的篩選標準，使用TBtools中的Simple Ka/Ks Calculator計算PeMYB基因的Ka（非同義替換）和Ks（同義替換）。

1.5 miRNA靶向PeMYB基因結(jié)合位點的預(yù)測

為了預(yù)測PeMYB基因中可能的miRNA靶位點，從已發(fā)表的數(shù)據(jù)中下載百香果成熟miRNA序列[33]，使用在線網(wǎng)站psRNATarget （https：//www.zhaolab.org/psRNATarget/）分析預(yù)測PeMYB基因中的miRNA靶位點。通過Cytoscape軟件[34]構(gòu)建和可視化PeMYB靶基因和預(yù)測的miRNA之間的網(wǎng)絡(luò)相互作用。

1.6 R2R3?PeMYB基因表達分析

用于轉(zhuǎn)錄組分析的百香果（P. edulis Sims）種植于廣西農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所品種試驗園。苞片、萼片、花絲、花瓣、雄蕊、柱頭和胚珠等不同組織的RNA測序數(shù)據(jù)來自中國國家基因庫（CNGB）[35]。RNA-seq使用發(fā)育早期（原孢子細胞形成時）和發(fā)育晚期（胚珠完全分化時）的百香果花的不同組織[35]（不同發(fā)育時期信息見https：//pan.baidu.com/s/1LcC6pEZBS4vP72aaX1aNxA？pwd=PMYB）。此外，在果汁形成期[授粉后53 d（53 DAP）]、果汁轉(zhuǎn)色期[授粉后60 d（60 DAP）]、果皮轉(zhuǎn)色期[授粉后100 d（100 DAP）]和果實成熟期[授粉后128 d（128 DAP）]采集果實樣品。

RNA提取和Illumina測序按照Chen等[36]的研究方法進行。簡言之，使用RNAprep Pure Plant Kit（Tiangen，Beijing，China）試劑盒提取總RNA。計算R2R3?PeMYB基因在百香果花的8個發(fā)育階段的TPM（Transcripts Per Kilobase Million）值。R2R3?PeMYB基因在不同發(fā)育階段的表達譜通過其TPM值來測量，并且基于log2（TPM+0.01）的值使用R中的pheatmap包制作熱圖。TPM值大于50表示基因豐富，用“*”標記。

1.7 脅迫處理和實時定量PCR分析

采用規(guī)格一致的百香果無病毒健康嫁接苗，待生長3周后分別進行冷（4±2 ℃）、熱（45±2 ℃）、滲透（200 mmol·L-1甘露醇）和鹽（200 mmol·L-1 NaCl）脅迫處理[35]。在進行冷和熱脅迫處理時，將健康的幼苗置于4 ℃或45 ℃的生長室中；在進行滲透和鹽脅迫處理時，百香果幼苗先在1/2 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)移到含有200 mmol·L-1甘露醇或200 mmol·L-1 NaCl的新鮮1/2 MS液體培養(yǎng)基中進行脅迫處理。在脅迫處理后0 h、24 h和48 h的時間點，收集至少3株植物的葉片，并收集未處理的植物樣本作為對照，將所有采集的樣品用液氮快速冷凍，在-80 ℃下保存，用于提取RNA。

qRT-PCR在Bio-Rad實時PCR系統(tǒng)（Foster City，CA，USA）中進行，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ系統(tǒng)（TaKaRa Perfect Real Time），樣品體積為20 μL（引物序列信息見https：//pan.baidu.com/s/1LcC6pEZBS4vP72aaX1aNxA？pwd=PMYB）。每個樣品3次技術(shù)重復，每個樣品3次生物學重復。以EF1a基因作為內(nèi)參基因，使mRNA水平正常化。使用2-ΔΔCT方法計算基因的倍數(shù)變化[37]，誤差條表示3個重復的標準偏差（SD）。

1.8 用qRT-PCR分析PeMYB基因在花青素生物合成中的表達

為了篩選與花青素合成相關(guān)的PeMYB基因，利用MEGA（version 11.0）構(gòu)建了4個物種（擬南芥、番茄、葡萄和百香果）的R2R3-MYB基因系統(tǒng)發(fā)育樹。然后，根據(jù)與花青素合成有關(guān)的MYB基因的分支，如VvMYBA1、SlMYB75、AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114，篩選出候選PeMYB基因。然后對授粉后不同發(fā)育階段（G：青皮期，授粉后第60天；T：果皮顏色轉(zhuǎn)化期，授粉后第110天；P：紫皮成熟期，授粉后第130天）的百香果果皮中的候選PeMYB基因進行qRT-PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果中MYB基因的鑒定

根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的HMM模型，從百香果基因組數(shù)據(jù)庫中初步篩選具有典型MYB結(jié)構(gòu)域的候選基因。在去除冗余序列后，總共確定了99個R2R3-MYB基因（基因信息見https：//pan.baidu.com/s/1LcC6pEZBS4vP72aaX1aNxA？pwd=PMYB）。根據(jù)基因在染色體上的位置將R2R3-MYB基因命名為PeMYB1至PeMYB99。PeMYB蛋白序列長度從113（PeMYB78）到1013（PeMYB39）個氨基酸不等，分子質(zhì)量從12.89 ku（PeMYB78）到113.94 ku（PeMYB39）不等。此外，PeMYB的理論pI值從4.73（PeMYB16）到10.15（PeMYB76）不等。所有PeMYB蛋白的亞細胞定位被預(yù)測為在細胞核中表達，這與PeMYB作為轉(zhuǎn)錄因子的功能和特性一致。

2.2 百香果R2R3-MYB基因的多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進一步分析和鑒定R2R3-PeMYB蛋白中R2和R3 MYB重復序列的特征，筆者進行了Web Logo和多序列比對（圖1）。R2和R3的基本結(jié)構(gòu)分別為[-W-（X19）-W-（X19）-W-]和[-F-（X18）-W-（X18）-W-]，它們包含約52個氨基酸殘基。如圖1所示，PeMYB蛋白的R2和R3結(jié)構(gòu)域有大量的保守氨基酸，特別是色氨酸殘基（W）。R2重復序列包含3個保守的色氨酸殘基（W），它們形成MYB轉(zhuǎn)錄因子的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)。R3重復序列的第二個和第三個色氨酸殘基（W）高度保守，而第一個保守的色氨酸殘基大部分被苯丙氨酸（F）取代，少數(shù)被異亮氨酸（I）和亮氨酸（L）取代。此外，R2重復序列中的E-10、D-11、L-14、G-22、R-37、K-40、R-43、R-45和L-50殘基和R3重復序列中的E-10、G-22、A-29、R-35、T-36、N-38、K-41和N-42殘基，在大多數(shù)MYB蛋白序列中都是一致的（圖1-A）。

為了分析R2R3-PeMYB的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和基因功能，利用MEGA軟件構(gòu)建了包含99個百香果R2R3-PeMYB蛋白和126個擬南芥AtMYB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。根據(jù)之前的研究，擬南芥中的R2R3-MYB蛋白成員被分為25個亞組（S1～S25）[32]。根據(jù)樹的拓撲結(jié)構(gòu)和AtMYB蛋白的分類，99個R2R3-PeMYB蛋白可以分為36組（P1～P36），用不同的顏色繪制（圖2）。其中百香果和擬南芥聚為27個分支，亞組P35（S21）含有最多的R2R3-MYB蛋白成員，有7個AtMYB蛋白和8個PeMYB蛋白。同時，第1分支和第8分支分別是擬南芥和百香果的物種特異性分支。聚在同一亞群中的PeMYB蛋白和AtMYB蛋白成員數(shù)量的差異表明兩個物種之間MYB基因家族存在明顯的種間差異。

2.3 R2R3-PeMYB的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

為了解PeMYB基因的結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，使用TBtools軟件對外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行了分析和可視化（圖3）。結(jié)果表明，PeMYB基因的外顯子數(shù)目從1到13不等。大部分R2R3-PeMYB基因（53.3%）具有相似的外顯子-內(nèi)含子分布（含有3個外顯子和2個內(nèi)含子），少數(shù)R2R3-PeMYB基因含有12個或更多的外顯子（PeMYB58、PeMYB60、PeMYB82）。此外，具有相似外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的基因，特別是在內(nèi)含子數(shù)量方面，傾向于在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚集在同一亞組中。例如，P34（S22）亞組中的兩個基因都缺乏內(nèi)含子，而P38（S20）亞組的基因都有兩個內(nèi)含子（圖3）。

使用MEME在線網(wǎng)站預(yù)測了99個R2R3-PeMYB蛋白的10個保守基序（圖3，各基序的長度和保守序列見https：//pan.baidu.com/s/1LcC6pEZBS4vP72aaX1aNxA？pwd=PMYB）。結(jié)果表明，基序1、基序2和基序3位于幾乎所有R2R3-PeMYB蛋白序列的N端，且這些序列含有保守的色氨酸殘基，并與R2和R3結(jié)構(gòu)域相關(guān)?？傮w而言，同一亞組內(nèi)的基因表現(xiàn)出相似的基序組成，但亞組間存在明顯差異，表明基序模式可能與PeMYB蛋白的功能有關(guān)。有趣的是，基序7和基序8只出現(xiàn)在P18（S14）亞組中，可能P18（S14）亞組中的一些基因在進化過程中發(fā)生了變化。PeMYB蛋白的基序分析顯示，同一亞組下的成員高度保守，進一步證明了它們在系統(tǒng)發(fā)育樹中進化關(guān)系的接近性。

2.4 R2R3-PeMYB基因的染色體定位和基因復制

為了研究百香果R2R3-MYB基因家族的遺傳差異，分析了R2R3-PeMYB基因的染色體定位（圖4）。結(jié)果顯示，95個R2R3-PeMYB基因被不均勻地定位在9條染色體上，4個R2R3-PeMYB基因分布在未組裝的支架上。大多數(shù)R2R3-PeMYB基因位于染色體的末端。1號染色體上的R2R3-PeMYB基因數(shù)量最多（28個，28.3%），其次是6號染色體，包含15個（15.2%）基因。其余的染色體上有3到11個基因，表明染色體和基因數(shù)量之間沒有相關(guān)性。

基因重復事件分析顯示，在R2R3-PeMYB基因中鑒定出37對片段重復基因和7對串聯(lián)重復基因（圖4，基因?qū)π畔⒁奾ttps：//pan.baidu.com/s/1LcC6pEZBS4vP72aaX1aNxA？pwd=PMYB）。6次串聯(lián)重復事件發(fā)生在1、2、4、5和6號染色體上，大部分片段重復事件發(fā)生在1號染色體上。在99個基因中，54個（54.5%）產(chǎn)生了37個片段重復基因?qū)?，表明基因重復事件（串?lián)重復和片段重復）對PeMYB基因的多樣性和進化有重要貢獻。Ka和Ks的比例可以反映生物進化過程中的選擇壓力。因此，為了探索選擇壓力在MYB基因家族進化中的作用，獲得了同源基因的Ka/Ks比率（Ka/Ks比率信息見https：//pan.baidu.com/s/1LcC6pEZBS4vP72aaX1aNxA？pwd=PMYB）。幾乎所有R2R3-PeMYB基因?qū)Φ腒a/Ks比值均小于1，表明這些PeMYB基因進化過程可能受到純化選擇。

2.5 MicroRNA靶向R2R3-PeMYB基因的預(yù)測

MicroRNAs（miRNA）是一類長度約22 nt的小型非編碼RNA，參與動物和植物的轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控。因此，為了更好地了解miRNA參與PeMYB基因的調(diào)控機制，利用已發(fā)表的miRNA序列在psRNATarget網(wǎng)站上預(yù)測miRNA靶向PeMYB基因的結(jié)合位點。PeMYB基因中miRNA靶向位點的網(wǎng)絡(luò)相互作用和示意圖如圖5-A和圖5-B所示，鑒定的11個miRNA靶向17個PeMYB基因，結(jié)果顯示ped-miR828b靶向最多的7個PeMYB基因（PeMYB3、PeMYB30、PeMYB46、PeMYB62、PeMYB63、PeMYB85和PeMYB93）；ped-miR319p靶向3個PeMYB基因（PeMYB32、PeMYB54、PeMYB61），其余9個miRNA分別靶向至少1個PeMYB基因。通過比較靶基因，PeMYB54和PeMYB61被三個miRNA靶向，即ped-miR319b、ped-miR319l和ped-miR319p；PeMYB32被兩個miRNA靶向，分別為ped-miR319p和ped-miR171k-5p（圖5，詳情信息見https：//pan.baidu.com/s/1LcC6pEZBS4vP72aaX1aNxA？pwd=PMYB）?？傊琾ed-miR828b和ped-miR319p是主要的miRNA，而PeMYB32、PeMYB54和PeMYB61是可能發(fā)揮重要作用并需要進一步對其功能進行研究的主要靶基因。

2.6 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的R2R3-PeMYB基因表達分析

為了探索R2R3-PeMYB基因的潛在功能，使用RNA-seq數(shù)據(jù)對99個R2R3-PeMYB基因在百香果花的不同組織的不同發(fā)育階段和果實中的表達譜進行了表征（圖6）。在所有樣本中具有低表達水平的基因被過濾掉。

根據(jù)不同花發(fā)育階段PeMYB基因表達的模式，觀察到PeMYB基因在百香果花的不同組織發(fā)育階段的表達變化（圖6）。大部分PeMYB基因（如PeMYB79和PeMYB80）在百香果花的不同組織發(fā)育中早期表達，但在發(fā)育后期呈下降趨勢。較少基因在百香果花的不同組織的發(fā)育過程中表現(xiàn)出高表達模式。在胚珠發(fā)育的各個階段，一些PeMYB基因，如PeMYB34和PeMYB39，都表現(xiàn)出高表達模式。

筆者在本研究中還分析了PeMYB基因在授粉后不同發(fā)育時期的表達模式（圖6）。隨著授粉后時間的延長，PeMYB40和PeMYB93的表達水平持續(xù)下降。此外，一些PeMYB基因，如PeMYB22、PeMYB59、PeMYB82和PeMYB83，僅在果汁形成過程（53 DAP）中表達。此外，PeMYB30、PeMYB75和PeMYB76在果汁轉(zhuǎn)色期（60 DAP）、果皮轉(zhuǎn)色期（100 DAP）和果實成熟期（128 DAP）均呈現(xiàn)高表達模式。這些結(jié)果表明，不同的PeMYB基因在百香果發(fā)育的不同階段發(fā)揮著重要作用。

為了驗證PeMYB基因在百香果花的不同組織發(fā)育中的表達情況，利用qRT-PCR研究了6個代表性PeMYB基因（PeMYB11，PeMYB34，PeMYB39，PeMYB69，PeMYB79和PeMYB88）在同一花組織中的表達譜（圖7）?？傮w而言，6個PeMYB基因的qRT-PCR趨勢與RNA-seq分析結(jié)果一致。PeMYB11在雄蕊發(fā)育早期高表達，同時PeMYB88在雄蕊發(fā)育晚期高表達。PeMYB34、PeMYB39和PeMYB69在胚珠發(fā)育過程中優(yōu)先表達，而PeMYB79在百香果花的不同組織的發(fā)育早期顯著高表達。

2.7 R2R3-PeMYB基因響應(yīng)非生物脅迫的表達模式

據(jù)報道，擬南芥R2R3-MYB基因家族S1、S2、S11、S20和S22亞組的成員與各種應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[32]。已知與一亞組中的同源基因可能具有相似的生物學功能。為了進一步探索R2R3-PeMYB基因可能的生物學功能，在冷、熱、滲透和鹽脅迫下，選擇了上述系統(tǒng)發(fā)育樹亞群中與擬南芥R2R3-MYB基因成員聚集的8個PeMYB基因進行qRT-PCR分析（圖8）。在低溫處理下，4個基因（PeMYB27、PeMYB40，PeMYB46和PeMYB79）具有相似的表達模式，且隨著處理時間的延長呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢。PeMYB53、PeMYB80和PeMYB86的相對表達水平隨著處理時間的推移先升高后降低。而在熱處理條件下，只有PeMYB27和PeMYB80的表達量顯著上調(diào)，其他PeMYB基因（PeMYB46，PeMYB50，PeMYB53，PeMYB79和PeMYB86）呈現(xiàn)波動表達模式。在鹽脅迫處理下，4個PeMYB基因（PeMYB40、PeMYB46、PeMYB80和PeMYB86）的表達水平與0 h相比均上升，而PeMYB27、PeMYB50和PeMYB53的表達水平顯著下調(diào)。在滲透處理過程中，PeMYB27、PeMYB50、PeMYB53和PeMYB80呈現(xiàn)波動的表達模式，而4個基因（PeMYB40、PeMYB46、PeMYB79和PeMYB86）的表達水平呈現(xiàn)極顯著上調(diào)。有趣的是，PeMYB40在除熱脅迫外的所有脅迫下都表現(xiàn)出顯著上調(diào)的表達水平。PeMYB27僅在低溫和高溫處理下表達量呈增加趨勢，而PeMYB86的表達量僅在滲透和鹽脅迫條件下增加。

2.8 R2R3-PeMYB基因在花青素生物合成中的表達分析

為了更好地探索PeMYB基因在花青素生物合成中的表達模式，構(gòu)建了多個物種（擬南芥、番茄、葡萄和百香果）中R2R3-MYB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（系統(tǒng)發(fā)育樹信息見https：//pan.baidu.com/s/1LcC6pEZBS4vP72aaX1aNxA？pwd=PMYB），然后在其他不同物種中與花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB基因（VvMYBA1、SlMYB75、AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114）的分支中篩選候選的PeMYB基因。候選PeMYB基因以百香果果實不同發(fā)育時期的果皮來進行qRT-PCR分析（圖9）。qRT-PCR結(jié)果顯示，PeMYB62和PeMYB63的表達量在果皮顏色轉(zhuǎn)化期（T）顯著增加，表明PeMYB62和PeMYB63可能參與調(diào)節(jié)百香果果皮中花青素的積累。

3 討 論

在百香果基因組中共鑒定到99個R2R3-PeMYB基因。在系統(tǒng)發(fā)育分析時，根據(jù)以往研究提出的分類學和拓撲結(jié)構(gòu)，將百香果和擬南芥的R2R3-MYB基因分為36個亞組[32]。大多數(shù)亞組包含來自百香果和擬南芥的R2R3-MYB成員，暗示它們可能來源于共同的祖先。然而，少數(shù)亞組只來自百香果或擬南芥的R2R3-MYB成員，這表明R2R3-MYB基因家族在分離后可能經(jīng)歷了物種特異性分化。

聚集在同一亞組的成員具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、基序組成和分布順序[32]。與其他植物一樣，大多數(shù)R2R3-PeMYB基因表現(xiàn)出3個外顯子和2個內(nèi)含子的常規(guī)剪接模式，這可能表明它們在不同物種中的保守功能。基序1、基序2和基序3在大多數(shù)R2R3-PeMYB蛋白中高度保守，并作為MYB保守結(jié)構(gòu)域的組成部分，這對轉(zhuǎn)錄因子的功能特異性至關(guān)重要[38]。不同亞組的R2R3-MYB結(jié)構(gòu)差異很大。例如，亞組P18（S14）和P35（S21）具有與其他亞組顯著不同的基序組成，而基序7和基序8是亞組P18（S14）所特有的基序，表明P18（S14）亞組的PeMYB基因可能經(jīng)歷了不同的進化發(fā)展，具有特定的功能。R2R3-PeMYB基因在P18（S14）亞組中的表達譜不同。例如，PeMYB33在雄蕊發(fā)育后期高表達，而PeMYB42在雄蕊發(fā)育早期高表達。此外，P35（S21）亞組的PeMYB基因在胚珠發(fā)育的不同時期均低表達或不表達。因此，不同亞組間的結(jié)構(gòu)多樣性可能有助于R2R3-PeMYB基因家族的功能多樣性。

基因復制事件在基因家族成員的擴展中起著重要作用，片段復制和串聯(lián)復制是基因家族在基因組中擴展的主要原因[38]。在百香果R2R3-MYB基因家族中，鑒定出7對串聯(lián)重復和37對片段重復基因，表明片段重復事件是百香果R2R3-MYB基因家族擴增的主要來源。在這些基因?qū)χ?，只有一對片段重復基因（PeMYB15-PeMYB17）的Ka/Ks值大于1，表明這對基因在進化過程中經(jīng)歷正向選擇。然而，這兩個基因在本研究中的不同組織中都沒有顯示出任何特殊的表達譜，這表明它們可能只在其他特定的發(fā)育階段或某些條件下表達。有些重復基因表現(xiàn)出相似的表達模式，聚集在同一個亞家族中，如來自同一亞組（P30）的PeMYB58和PeMYB60均在花絲、雄蕊、柱頭和胚珠發(fā)育的早期階段高表達，表明它們可能存在功能冗余。然而，大多數(shù)基因?qū)Ρ憩F(xiàn)出不同的表達模式，這表明百香果R2R3-MYB基因家族的成員存在功能分化的現(xiàn)象。例如，盡管PeMYB6和PeMYB34屬于同一亞組（P18/S14），但它們顯示出完全不同的表達模式。PeMYB34在胚珠發(fā)育階段具有高水平表達，而PeMYB6在萼片、胚珠的早期發(fā)育階段以及苞片和花瓣的后期發(fā)育階段高度表達。此外，PeMYB79和PeMYB81基因?qū)Φ谋磉_模式也不同。PeMYB79在果汁顏色轉(zhuǎn)化期（60 DAP）表達，而PeMYB81主要在果皮顏色轉(zhuǎn)化期（100 DAP）表達。這些基因?qū)Ρ磉_模式的差異表明了PeMYB基因的功能多樣性。

百香果作為廣受歡迎的水果和觀賞作物，探究其代謝過程、花和果實發(fā)育的調(diào)控機制具有重要意義。大多數(shù)R2R3-PeMYB基因的生物學功能仍不清楚，鑒定不同物種中的同源基因?qū)樘骄窟@些基因的功能提供有價值的參考。前人研究表明AtMYB117/LOF1在花器官發(fā)育和胚珠生長等多種發(fā)育過程中建立邊界區(qū)域[39]。同源的PeMYB48和PeMYB69在胚珠發(fā)育過程中表現(xiàn)出高表達模式，并與AtMYB117/LOF1聚類，表明PeMYB48和PeMYB69在調(diào)節(jié)胚珠發(fā)育中可能具有類似的功能。P29（S18）亞組的基因，包括AtMYB33、AtMYB65和AtMYB101，在花的發(fā)育，特別是花粉發(fā)育中發(fā)揮重要作用[40]。同一亞組中的PeMYB54和PeMYB61在雄蕊發(fā)育早期特異性高表達，說明其可能在雄蕊發(fā)育中具有相似的功能。已有研究表明R2R3-MYB基因在果實發(fā)育過程中也具有調(diào)控功能?；赗2R3-PeMYB基因在不同組織中的表達譜的層次聚類，建立了一個具有8個基因表達的果實特殊表達塊，這些基因在果實發(fā)育的某些階段豐富。大部分豐富基因在果汁轉(zhuǎn)色期（60 DAP）和果皮轉(zhuǎn)色期（100 DAP）的表達量最高。已知植物中許多R2R3-MYB基因在黃酮醇生物合成中發(fā)揮作用[11]。例如，MdMYB1是蘋果中花青素生物合成的一個調(diào)節(jié)器[41]。PalMYB90可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵類黃酮途徑提高楊樹花青素水平[42]。說明在果汁轉(zhuǎn)色期和果實轉(zhuǎn)色期均高表達的R2R3-PeMYB基因可能參與了果實發(fā)育過程中黃酮醇或花青苷的代謝。

花青素是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，主要積累在花、果、葉等組織中。它們通過色彩豐富的顏色吸引昆蟲等傳粉者，幫助植物完成生命過程[43]。目前，與花青素合成有關(guān)的R2R3-MYB基因已在多個物種中被發(fā)現(xiàn)，包括擬南芥[9]、葡萄[44]、番茄[45]等。AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114控制擬南芥組織中花青素的生物合成[14]。葡萄（Vitis vinifera L.）的VvMybA1基因調(diào)節(jié)花青素生物合成的最后代謝步驟[44]。筆者在本研究中用擬南芥、葡萄和番茄的R2R3-MYB基因構(gòu)建了一個系統(tǒng)發(fā)育樹，以篩選與花青素合成相關(guān)的候選PeMYB基因，并對候選PeMYB基因進行了qRT-PCR分析。結(jié)果表明，PeMYB62和PeMYB63基因在果皮顏色轉(zhuǎn)化中高度表達，表明PeMYB62和PeMYB63基因可能參與花青素的合成。此外，PeMYB62和PeMYB63基因是Ped-miR828家族的靶基因，并且miR828已被報道參與花青苷合成途徑[46]。這進一步表明，PeMYB62和PeMYB63基因很可能在花青素合成途徑中發(fā)揮重要作用，未來可以進一步研究。

百香果的生長發(fā)育易受光照、溫度和水分等環(huán)境因素的影響[3]。R2R3-MYB基因已被證明與響應(yīng)非生物脅迫有關(guān)[9]。筆者在本研究中設(shè)置冷、熱、滲透和鹽脅迫4種非生物脅迫條件，通過qRT-PCR分析了8個R2R3-PeMYB基因的表達水平。有趣的是，這些R2R3-PeMYB基因顯著響應(yīng)至少兩種應(yīng)激處理。AtMYB41能夠影響細胞壁發(fā)育，響應(yīng)ABA、干旱和鹽脅迫[47]，其同源基因PeMYB86也對干旱和鹽脅迫最敏感且誘導程度高。此外，與擬南芥的情況類似[18]，P15（S1）亞組的基因包括PeMYB40和PeMYB46在干旱、鹽和冷脅迫下也被高度誘導。ped-miR166h-5p靶向的PeMYB79也參與響應(yīng)多種脅迫，進一步說明了PeMYB79在參與百香果抗逆方面具有重要作用。同時，這些響應(yīng)脅迫的PeMYB基因中的大多數(shù)也在特定發(fā)育階段的某些組織中優(yōu)先表達。例如，亞組P20（S2）中的PeMYB27在高溫和低溫脅迫下被高度誘導，并且在萼片和苞葉及柱頭的發(fā)育晚期也高表達。對這些基因功能的進一步研究有助于揭示PeMYB基因在不同條件下對百香果生長和發(fā)育的調(diào)控機制。

4 結(jié) 論

在百香果（P. edulis）基因組中總共鑒定出99個R2R3-MYB基因?；谙到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系，99個R2R3-PeMYB基因分為36個亞組。R2R3-PeMYB基因隨機分布在9條百香果染色體上?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，同一亞組中內(nèi)含子的剪接模式在MYB結(jié)構(gòu)域中高度保守。共線性分析表明，片段復制事件促進了百香果R2R3-MYB家族的擴張。PeMYB基因在不同發(fā)育階段的花組織中表現(xiàn)出不同的表達模式，8個R2R3-PeMYB在各種非生物脅迫（冷、熱、鹽和滲透壓）下也表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。此外，PeMYB62和PeMYB63可能參與百香果花青素的合成。本研究為后續(xù)研究和驗證R2R3-MYB基因在百香果花果發(fā)育中的潛在功能奠定了基礎(chǔ)。

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