高糖環(huán)境下肝細(xì)胞外泌體對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響

楊昊長(zhǎng)，許永寧，廖嘉華，楊馨玥，秦雯

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院 病理科，廣西 南寧 530199；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 病理科，廣西 南寧 530005）

胰腺癌是全球預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，其5 年生存率＜10%且特別容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[1-2]。研究表明一些非腫瘤細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞[3]、成纖維細(xì)胞[4-6]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[7]、脂肪肝細(xì)胞[8]）在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，并且受到腫瘤微環(huán)境（如缺氧微環(huán)境、免疫微環(huán)境[8]、高糖微環(huán)境[9-10]等）的影響和調(diào)控。如在胰腺癌中，高糖微環(huán)境被證明可以驅(qū)動(dòng)表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）誘導(dǎo)的胰腺癌侵襲和遷移[11]。筆者前期研究[12]也發(fā)現(xiàn)高血糖可能通過增強(qiáng)腫瘤的侵襲和遷移能力而參與胰腺癌的惡性進(jìn)展。肝臟既是胰腺癌轉(zhuǎn)移的高發(fā)器官[13]，也是糖代謝的重要器官[14]，因此筆者推測(cè)在高糖微環(huán)境下肝細(xì)胞可能參與了胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。外泌體是幾乎所有活細(xì)胞都可以分泌的納米級(jí)細(xì)胞囊泡，也是大多數(shù)生物體液中最小的胞外囊泡，其內(nèi)含有的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 和RNA 可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能，是細(xì)胞交流的關(guān)鍵媒介之一，它們?cè)诩?xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[15]、免疫應(yīng)答[16]、腫瘤轉(zhuǎn)移[17]，后者如上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn) 化（epithelia-mesenchymal transition，EMT）[18]等方面起著重要的作用。最新的研究[3]還認(rèn)為外泌體是串聯(lián)癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間的新興介質(zhì)，既可以在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生，也可以改變腫瘤微環(huán)境。因此，本研究進(jìn)一步探討在高糖微環(huán)境下，肝細(xì)胞分泌的外泌體是否作為細(xì)胞間交流的媒介促進(jìn)了胰腺癌的侵襲和遷移，為深入闡明胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人永生化肝細(xì)胞MIHA（廣西醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)王啟輝教授贈(zèng)送），胰腺癌細(xì)胞PANC-1（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。DMEM（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，C11995500BT），DMEM 正常糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，C11885500BT），胎牛血清（中國(guó)太倉(cāng)依科賽公司，F(xiàn)SP500），青鏈霉素（中國(guó)北京Solarbio 公司，P1400），胰蛋白酶（中國(guó)北京Solarbio 公司，T1320）、超高速離心管（美國(guó)Beckman Coulter 公司，355631），PKH67 試劑盒（美國(guó)Sigma 公司，MINI67），DAPI（中國(guó)北京Bioshap 生物科技公司，BL105A），BCA 試劑盒（中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0010S），0.1% 結(jié)晶紫溶液（中國(guó)北京Solarbio 公司，G1063），4%多聚甲醛（中國(guó)北京Bioshap 生物科技公司，BL539A），10%PAGE 凝膠快速制備試劑盒（中國(guó)上海雅酶生物醫(yī)藥科技公司，PG112），6、24、96 孔板、Transwell 小室（美國(guó)Corning 公司，3516、3524、3599、3422），一抗：CD9、CD63 和GAPDH（中國(guó)武漢三鷹公司，60232-1-lg、67605-1-lg、60004-1-lg），E-cadherin、N-cadherin（美國(guó)Abcam公司，ab1416、ab18203），熒光二抗：鼠抗兔抗（美國(guó)Invitrogen 公司，SA5-35521、SA5-35571）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取等量的人永生化肝細(xì)胞MIHA分別用含10%無外泌體胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 高糖或正常糖培養(yǎng)基，胰腺癌細(xì)胞PANC-1 使用含10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，所有細(xì)胞都置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中正常傳代培養(yǎng)。

1.2.2 外泌體的提取和鑒定MIHA 細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定融合度達(dá)80%時(shí)更換為10%無外泌體胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞上清液于離心管中，分別經(jīng)過2 000 g 30 min、10 000 g 30 min、120 000 g 1.5 h、120 000 g 1.5 h 離心，全程保證離心機(jī)溫度在4 ℃，使用100 μL PBS 重懸將超高速離心管底部外泌體轉(zhuǎn)移至無菌EP 管中，進(jìn)行透射電鏡觀察；使用NanoFCM 粒徑分析儀檢測(cè)外泌體的粒徑；用RIPA 裂解緩沖液裂解外泌體，再用Westrn blot 法檢測(cè)提取物中外泌體標(biāo)志蛋白CD9 和CD63 的表達(dá)。

1.2.3 實(shí)時(shí)激光掃描共聚焦顯微鏡示蹤外泌體的攝取使用親脂性染料PKH67 對(duì)人永生化肝細(xì)胞MIHA 來源的外泌體進(jìn)行標(biāo)記，能夠強(qiáng)而穩(wěn)定地發(fā)出綠色熒光且不使鄰近細(xì)胞染色，因此能顯示肝細(xì)胞MIHA 產(chǎn)生的外泌體和胰腺癌細(xì)胞PANC-1 在共孵育過程中外泌體的移動(dòng)。使用細(xì)胞核染料DAPI 可使胰腺癌細(xì)胞PANC-1 的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，使其得到定位并以此來觀察胰腺癌細(xì)胞PANC-1對(duì)人永生化肝細(xì)胞MIHA 來源的外泌體的攝取。本實(shí)驗(yàn)使用共聚焦皿種板，每皿5 000 個(gè)細(xì)胞；分別取上述高糖和正常糖培養(yǎng)基中分離得到的兩種外泌體進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：100 μL 外泌體溶液重懸于0.5 mL Diluent C 中吹打混勻，避光環(huán)境下將4 μL PKH67 添加到0.5 mL Diluent C 中，將兩者混勻，避光孵育4 min；加入等量的無外泌體胎牛血清終止染色1 min；室溫400 g 離心10 min，棄上清，更換新的離心管，洗滌離心2 次從而去除未結(jié)合的染料，使用200 μL PBS 重懸后得到PKH67 標(biāo)記的外泌體溶液，加入共聚焦皿中37 ℃避光與胰腺癌細(xì)胞PANC-1 共培養(yǎng)8 h；吸去上清，PBS 洗滌1 次，加入1 mL 多聚甲醛避光孵育10 min；吸去多聚甲醛PBS 清洗1 次，加入DAPI 染核，避光孵育5 min后PBS 清洗3 次。最后，分別置于激光共聚焦顯微鏡下觀察HG 組和NG 組胰腺癌細(xì)胞PANC-1 對(duì)肝細(xì)胞MIHA 來源的外泌體的吞噬。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)先取人胰腺癌細(xì)胞PANC-1 按合適的濃度接種于背后用marker 畫好線的6 孔板，過夜鋪滿。劃痕時(shí)吸頭垂直于背后橫線，PBS 清洗3 次后加入無血清培養(yǎng)基。之后，按共培養(yǎng)情況進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)：包括PANC-1 與高糖環(huán)境肝細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)組（高糖組）、PANC-1 與正常糖環(huán)境肝細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)組（正常糖組）、無外泌體的PANC-1 培養(yǎng)組（陰性對(duì)照組NC 組），即分別取高糖和正常糖環(huán)境下肝細(xì)胞MIHA 來源外泌體200 μg加入六孔板與PANC-1 共培養(yǎng)48 h，在0 h 和48 h 分別評(píng)估三組細(xì)胞遷移情況。

1.2.5 Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分組同劃痕試驗(yàn)，即分別提取正常糖與高糖環(huán)境下肝細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體與胰腺癌細(xì)胞PANC-1 共培養(yǎng)48 h 后與陰性對(duì)照組一起分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：⑴ 侵襲實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞消化離心后按照1×104個(gè)數(shù)目接種在涂有Matrigel基質(zhì)膠的上腔室，下室加入500 μL 含10%胎牛血清的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h 后取出小室使用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，拍照計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑵ 遷移實(shí)驗(yàn)：除不需要基質(zhì)膠外其余步驟和分組與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.6 Western blot將胰腺癌細(xì)胞PANC-1 按照5×105個(gè)數(shù)目接種至6 孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)換液，按照100 μg/mL 加入200 μg 外泌體，共培養(yǎng)48 h 后裂解細(xì)胞，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。分組同前，上樣使用10% SDS-PAGE 凝膠設(shè)置150 V 電泳45 min，電泳后設(shè)置電流150 mA 冰上轉(zhuǎn)膜85 min 將印跡轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，快速封閉液封閉15 min。分別與E-cadherin、N-cadherin 和GAPDH一抗4 ℃共同孵育過夜，TBST 漂洗后按照一抗種屬加入熒光二抗暗盒孵育2 h 后掃膜并保存數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 26.0 軟件及Image J 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，使用Graphpad Prism 8.0 制作統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定

高糖與正常糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝細(xì)胞MIHA 外泌體樣品在透射電鏡下均呈橢圓形或球形囊泡，形態(tài)完整，大小均勻，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)（圖1A），粒徑分析顯示其粒徑大小在40～150 nm 之間（圖1B），符合外泌體的形態(tài)特征。Western blot 結(jié)果顯示，其外泌體標(biāo)志蛋白CD9 和CD63 表達(dá)陽性（圖1C）。由此可確定提取物為外泌體。

圖1 兩種培養(yǎng)基來源的外泌體鑒定 A：透射電子顯微鏡下提取物呈現(xiàn)脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的外泌體形態(tài)表征（比例尺=100 nm）；B：粒徑分析測(cè)量提取物小囊泡的粒徑范圍與外泌體粒徑范圍一致；C：Western blot結(jié)果顯示兩種培養(yǎng)基來源提取物外泌體標(biāo)志蛋白CD9和CD63表達(dá)陽性 Figure 1 Identification of exosomes from two culture medium sources A: Characterization of exosome morphology with lipid bilayer structure observed under transmission electron microscopy (scale bar=100 nm);B: Particle size analysis showing the size range of extracted small vesicles consistent with the range of exosome sizes;C: Western blot results demonstrating positive expression of exosome marker proteins CD9 and CD63 in extracts from both culture medium sources

2.2 外泌體的攝取

在實(shí)時(shí)激光掃描共聚焦顯微鏡下可見到胰腺癌細(xì)胞PANC-1 細(xì)胞核被DAPI 染成藍(lán)色，隨著時(shí)間的推移，被PKH67 染為綠色的外泌體逐漸聚集于藍(lán)色細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)中，表明兩種培養(yǎng)基來源的肝細(xì)胞MIHA 外泌體均能被胰腺癌細(xì)胞PANC-1攝取（圖2）。

圖2 PANC-1細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取（綠色熒光顯示外泌體，藍(lán)色熒光顯示PANC-1細(xì)胞核的位置；Merge為前面兩圖的疊加效果，從而顯示胰腺癌細(xì)胞對(duì)外泌體的攝??；比例尺=50 μm）Figure 2 The uptake of exosomes by panc-1 cells (exosomes labeled in green fluorescence,PANC-1 cell nuclei labeled in blue fluorescence;Merge represents the overlay of the two previous images,demonstrating the uptake of exosomes by pancreatic cancer cells;scale bar=50 μm)

2.3 劃痕試驗(yàn)結(jié)果

劃痕試驗(yàn)檢測(cè)PANC-1 細(xì)胞在外泌體作用下遷移能力的改變，結(jié)果顯示，高糖組PANC-1 細(xì)胞的遷移率為（30.19±3.76）%、正常糖組PANC-1 細(xì)胞的遷移率為（22.87±4.07）%、陰性對(duì)照組PANC-1 細(xì)胞的遷移率為（16.62±4.52）%，高糖組PANC-1 細(xì)胞的遷移率明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而正常糖組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 細(xì)胞遷移率檢測(cè) A：劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率（×40）；B：各組細(xì)胞遷移率比較Figure 3 Cell migration rate detection A: Wound-healing assay to detect cell migration rate (×40);B: Comparison of cell migration rates among different groups

2.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示；高糖組遷移細(xì)胞數(shù)為（194.20±39.54）個(gè)、正常糖組遷移細(xì)胞數(shù)為（106.60±23.68）個(gè)、陰性對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為（89.60±32.55）個(gè)，高糖組遷移細(xì)胞數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而正常糖組與陰性對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 細(xì)胞遷移數(shù)檢測(cè) A：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移數(shù)（×100）；B：各組細(xì)胞遷移數(shù)比較Figure 4 Cell migration number detection A: Transwell migration assay to detect cell migration number (×100);B: Comparison of cell migration numbers among different groups

2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖組侵襲細(xì)胞數(shù)為（164.40±26.09）個(gè)、正常糖組侵襲細(xì)胞數(shù)為（116.20±29.88）個(gè)、陰性對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（99.80±25.59）個(gè)，高糖組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而正常糖組與陰性對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。

圖5 細(xì)胞侵襲數(shù)檢測(cè) A：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲數(shù)（×100）；B：各組細(xì)胞侵襲數(shù)比較Figure 5 Cell invasion number detection A: Transwell invasion assay to detect cell invasion number (×100);B: Comparison of cell invasion numbers among different group

2.6 EMT相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果

用Western blot 檢測(cè)EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，高糖組PANC-1 細(xì)胞中E-cadherin 蛋白的表達(dá)明顯降低，N-cadherin 蛋白的表達(dá)明顯升高（均P＜0.05），而正常糖組與陰性對(duì)照組間兩種蛋白表達(dá)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖6）。

圖6 EMT相關(guān)蛋白檢測(cè) A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：各組E-cadherin與N-cadherin蛋白表達(dá)量比較Figure 6 Detection of EMT-related proteins A: Results of Western blot analysis;B: Comparison of protein expression levels of E-cadherin and N-cadherin among different groups

3 討論

胰腺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，近年來患者數(shù)量持續(xù)增加。但是，胰腺位于腹部深處，屬于腹膜后位器官，這一特殊位置導(dǎo)致胰腺癌難以被早期發(fā)現(xiàn)；且大多數(shù)早期胰腺癌不會(huì)引起患者明顯的臨床癥狀，直到擴(kuò)散轉(zhuǎn)移后才得以確診[19]。胰腺癌的轉(zhuǎn)移又以肝轉(zhuǎn)移較為常見[1-2]，這種臨床現(xiàn)象是否與肝細(xì)胞本身的活動(dòng)有關(guān)值得探討。

文獻(xiàn)報(bào)道一些非腫瘤細(xì)胞以外泌體為媒介在腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，成纖維細(xì)胞通過外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通訊在調(diào)節(jié)乳腺癌進(jìn)展的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。來自成纖維細(xì)胞外泌體的circTBPL1 轉(zhuǎn)運(yùn)到乳腺癌細(xì)胞中，保護(hù)其下游靶基因TPBG 免受miR-653-5p 介導(dǎo)的降解，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4]。在卵巢癌中，成纖維細(xì)胞外泌體可通過調(diào)控miR-29c-3p-MMP2 軸促進(jìn)卵巢癌的腹膜轉(zhuǎn)移[5]。在胰腺癌中，M2 巨噬細(xì)胞來源的外泌體通過miR-193b-3p 靶向TRIM62 促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展和谷氨酰胺的攝取。TRIM62 的表達(dá)與miR-193b-3p 和c-Myc 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即miR-193b-3p 和c-Myc 的高表達(dá)和TRIM62 的低表達(dá)預(yù)示著胰腺癌患者預(yù)后不良[3]。成纖維細(xì)胞來源的外泌體通過miR-3173-5p/ACSL4 通路誘導(dǎo)了胰腺癌的吉西他濱耐藥[6]。在非小細(xì)胞肺癌中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過運(yùn)送microRNA-30b-5p 阻斷EZH2/PI3K/Akt 軸而抑制非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移[7]。在結(jié)直腸癌中，脂肪肝細(xì)胞來源的外泌體將YAP 信號(hào)相關(guān)的miRNA 轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞中，通過抑制LATS2而增強(qiáng)YAP 活性，從而促進(jìn)致癌的YAP 蛋白信號(hào)通路并形成免疫抑制微環(huán)境，導(dǎo)致了結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移[8]。此外，腫瘤及其微環(huán)境一直有“種子和土壤”的假說，即腫瘤微環(huán)境為腫瘤這?！胺N子”提供了肥沃的“土壤”，促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。不少研究認(rèn)為高糖微環(huán)境也是有利于腫瘤生長(zhǎng)的“土壤”[9-10,20-23]，因?yàn)樗梢蕴腔?xì)胞外基質(zhì)[21]，還可以抑制癌細(xì)胞氧化磷酸化和細(xì)胞凋亡[9]。在胰腺癌中，高糖培養(yǎng)基預(yù)處理28 d 后，胰腺癌PANC-1 細(xì)胞的活力明顯增加；高糖微環(huán)境通過增高磷酸化STAT3 和Myc 的水平[22]、改變Wnt/β-catenin 信號(hào)通路[23]等而促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展。那么，在高糖微環(huán)境下，作為非腫瘤細(xì)胞的肝細(xì)胞，其外泌體是否充當(dāng)了細(xì)胞間交流的媒介從而促進(jìn)胰腺癌的侵襲和遷移呢？本研究首先通過實(shí)驗(yàn)提取了高糖條件下肝細(xì)胞分泌的外泌體并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。使用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞MIHA，運(yùn)用超高速離心法提取細(xì)胞上清液中的外泌體，通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)提取物中存在較多圓形或橢圓形的囊泡，其形態(tài)完整、大小均勻，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，與外泌體的形態(tài)一致。接著，使用nanoFCM 粒徑分析儀檢測(cè)這些圓形囊泡的粒徑，發(fā)現(xiàn)其粒徑大小在40～150 nm 之間，與外泌體的大小一致。最后，用RIPA 裂解緩沖液裂解提取物，再用Western blot 法檢測(cè)證實(shí)提取物中有外泌體標(biāo)志蛋白CD9 和CD63 的表達(dá)。至此，完成了從形態(tài)學(xué)到分子水平對(duì)高糖微環(huán)境下肝細(xì)胞外泌體的鑒定。

研究還發(fā)現(xiàn)，外泌體及其攜帶的信息物質(zhì)可以通過組織間的旁分泌、內(nèi)分泌通路來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[24]、影響細(xì)胞功能[25]，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)控因素。在腫瘤相關(guān)的外泌體中，有的能促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的EMT、遷移和侵襲[26]，有的能促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移[27]、有的能促進(jìn)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移[28]，有的能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[29]，有的能抑制尿路上皮癌的轉(zhuǎn)移[30]等。

為了證實(shí)肝細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能與胰腺癌細(xì)胞相互作用，本研究使用親脂性染料PKH67 標(biāo)記高糖和正常糖環(huán)境下提取的肝細(xì)胞MIHA 的外泌體，使其發(fā)出綠色熒光。再將其分別與胰腺癌細(xì)胞PANC-1 共培養(yǎng)。然后，使用細(xì)胞核染料DAPI 使胰腺癌細(xì)胞PANC-1 的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。最后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：隨著時(shí)間的推移，被PKH67 染為綠色的外泌體逐漸聚集于被DAPI 染成藍(lán)色的胰腺癌細(xì)胞PANC-1 核周的細(xì)胞質(zhì)中，表明肝細(xì)胞MIHA 來源的外泌體能被胰腺癌細(xì)胞PANC-1 攝取。

為研究胰腺癌細(xì)胞攝入高糖環(huán)境下肝細(xì)胞分泌的外泌體后會(huì)發(fā)生何種改變，本研究對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1 繼續(xù)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。劃痕試驗(yàn)顯示，高糖組胰腺癌細(xì)胞的遷移率高于其他兩組；Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，高糖組的遷移和侵襲能力均高于其他兩組。Western blot 結(jié)果顯示，高糖組胰腺癌細(xì)胞PANC-1 中E-cadherin 蛋白的表達(dá)顯著降低，而N-cadherin 蛋白的表達(dá)則顯著增強(qiáng)。E-cadherin 和N-cadherin 是EMT 相關(guān)蛋白，EMT是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞典型特征的一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的轉(zhuǎn)變過程，在這個(gè)過程中上皮細(xì)胞獲得了遷移和侵襲周圍組織的能力從而導(dǎo)致了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等不同特征[31]。在EMT 中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)缺失被認(rèn)為是關(guān)鍵步驟[32]，同時(shí)N-cadherin 作為間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增高從而使腫瘤細(xì)胞更具運(yùn)動(dòng)性和侵襲性[33]。當(dāng)受到某些因素刺激時(shí)（如缺氧微環(huán)境），胰腺癌細(xì)胞E-cadherin 的表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)而啟動(dòng)EMT 過程導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。E-cadherin 的表達(dá)水平與患者的預(yù)后呈正相關(guān)，也是胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物[34]，并且E-cadherin 的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和不良分化呈顯著的相關(guān)性[35]。本研究中高糖組胰腺癌細(xì)胞PANC-1 的E-cadherin 表達(dá)降低而N-cadherin 表達(dá)升高，表明高糖微環(huán)境下肝細(xì)胞分泌的外泌體能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的EMT，從而增強(qiáng)其侵襲和遷移能力。

綜上所述，本研究從體外細(xì)胞水平證實(shí)了高糖微環(huán)境下肝細(xì)胞MIHA 產(chǎn)生的外泌體能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞PANC-1 的侵襲、遷移及EMT。筆者推測(cè)此結(jié)果可能與外泌體中某些miRNA 的表達(dá)改變有關(guān)。由于本研究主要從形態(tài)學(xué)和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，尚未涉及基因水平，因此課題組后續(xù)會(huì)進(jìn)一步從基因?qū)用嫔钊胙芯?，探討高糖微環(huán)境下胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的完整分子網(wǎng)絡(luò)，為胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供新的思路和方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊昊長(zhǎng)負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作、文稿撰寫及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；秦雯負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、提供基金資助、審校稿件和指導(dǎo)課題實(shí)施；許永寧、廖嘉華及楊馨玥負(fù)責(zé)細(xì)胞培養(yǎng)。