蘋果響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)miRNA的深度測序數(shù)據(jù)集

摘要：土壤鹽漬化已成為限制農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量的重要因素之一，影響著全世界范圍內(nèi)的農(nóng)作物產(chǎn)量。蘋果作為一種重要的水果作物，鹽脅迫的危害及耐鹽砧木的缺乏已成為威脅現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要問題。因此，研究蘋果對鹽脅迫的反應(yīng)和適應(yīng)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和緊迫性。本研究分別以0%、0.2%和0.6% NaCl處理0、4、8和12天后的珠美海棠實(shí)生苗為試驗(yàn)材料，從葉片及根系中提取總RNA，構(gòu)建RNA-seq文庫，共鑒定獲得575個(gè)miRNA，包括315個(gè)已知mdm-miRNA和260個(gè)新miRNA。此外，Differential Expression（DE） miRNA對鹽脅迫反應(yīng)具有組織特異性表達(dá)模式。同時(shí)提供珠美海棠miRNA深度測序的數(shù)據(jù)集，結(jié)合生物信息學(xué)方法對原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，獲得高質(zhì)量序列并利用BLAST軟件將預(yù)測靶基因序列與NR、Swiss-Prot、Pfam等數(shù)據(jù)庫比對，獲得響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)基因的注釋信息。GO分析表明與鹽脅迫有關(guān)miRNA及靶基因主要參與生物過程中對刺激的反應(yīng)。本研究為珠美海棠的利用提供理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為耐鹽砧木的選育提供有力支持。

關(guān)鍵詞：蘋果；鹽脅迫；miRNA；深度測序；生物信息學(xué)

1? 引言

鹽脅迫是制約全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要環(huán)境因素之一[1]。據(jù)估計(jì)目前全球約有20%的灌溉土壤正在遭受鹽脅迫的危害，預(yù)計(jì)到2050年全世界將會(huì)有超過50%的可耕地土壤出現(xiàn)土壤鹽漬化問題[2]。植物受到鹽脅迫時(shí)會(huì)影響體內(nèi)Na+、Cl- 等含量的積累，從而破壞細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，進(jìn)而影響植物細(xì)胞膜上相關(guān)酶的活性，破壞膜結(jié)構(gòu)。此外鹽脅迫會(huì)造成光合作用速率下降，增加呼吸消耗，加速植物衰老，并且積累大量有毒代謝物質(zhì)，對植物造成不利影響[3-4]。然而植物為適應(yīng)高鹽環(huán)境已進(jìn)化出應(yīng)對鹽脅迫的策略，包括積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以適應(yīng)滲透損傷[5-6]；激活活性氧清除系統(tǒng)保護(hù)植物免受鹽脅迫引發(fā)的氧化損傷[7-8]；調(diào)控鹽響應(yīng)基因的表達(dá)以保護(hù)細(xì)胞機(jī)制免受脅迫[9]等方式來提高植物耐鹽性。因此，揭示更多耐鹽植物分子機(jī)制對未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

MicroRNA （miRNA）是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物中的非編碼小RNA（sncRNA），長度為20－24個(gè)核苷酸（nt），被認(rèn)為是一種重要的基因表達(dá)調(diào)控因子[10]。miRNA最初發(fā)現(xiàn)于秀麗小桿線蟲[11]，隨著對miRNA的深入研究，越來越多的植物、動(dòng)物和病毒中都發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在。截至目前已從82種植物中共鑒定出10 405個(gè)成熟miRNA，歸屬于上百個(gè)miRNA家族[12]。miRNA與反向互補(bǔ)序列結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，從而通過轉(zhuǎn)錄后水平切割或抑制翻譯來負(fù)調(diào)控其靶基因[13]。此外，miRNA參與了植物種子萌發(fā)和幼苗的生長發(fā)育、植物形態(tài)結(jié)構(gòu)調(diào)控和產(chǎn)量形成，以及對許多生物和非生物脅迫的響應(yīng)[14-16]。已有大量研究證明miRNA在植物響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，miR169c的靶基因可以控制玉米葉片氣孔的開啟和關(guān)閉，從而減少水分流失抵抗鹽脅迫[17]。棉花中miR414c過表達(dá)可負(fù)調(diào)控鐵超氧化物歧化酶基因，增強(qiáng)植物對鹽脅迫的耐受性[18]。此外，越來越多的耐鹽miRNA-mRNA模塊也得到了功能驗(yàn)證。miR156/SPL模塊通過上調(diào)蘋果的MdWRKY100來增強(qiáng)其耐鹽性[19]。在水稻中miR528-AO （l-抗壞血酸氧化酶）模塊可以調(diào)節(jié)抗壞血酸和脫落酸的代謝以及清除ROS，從而增強(qiáng)耐鹽能力[20]。這些研究表明了解miRNA介導(dǎo)的植物耐鹽生理調(diào)控機(jī)制，可以為揭示植物耐鹽脅迫復(fù)雜的分子和遺傳機(jī)制提供必要的基礎(chǔ)。

蘋果是全世界重要的栽培果樹之一，亦是鄉(xiāng)村振興和脫貧攻堅(jiān)的優(yōu)勢樹種。然而一些蘋果優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)由于土壤鹽漬化嚴(yán)重，造成樹體營養(yǎng)失衡、生理病害加重、果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)下降等問題，土壤鹽漬化已經(jīng)成為威脅果樹產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要問題[21]。蘋果耐鹽性與其品種和砧木類型密切相關(guān)，選擇耐鹽性強(qiáng)的蘋果砧木類型可以有效提高蘋果耐鹽性[22]。因此對耐鹽砧木的挖掘、篩選及利用將成為現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)和“四荒”用地上新果園發(fā)展的重要發(fā)展趨勢。

我國擁有著豐富的蘋果種質(zhì)資源。據(jù)報(bào)道，珠美海棠可耐0.6%以上鹽含量，具有耐鹽、耐堿、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性。miRNA深度測序作為高通量測序技術(shù)的重要應(yīng)用，通過運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對數(shù)據(jù)分析可從測序得到原始數(shù)據(jù)中篩選出相關(guān)鹽脅迫響應(yīng)基因，極大提高了植物與耐鹽相關(guān)基因種類鑒定的準(zhǔn)確性。因此本研究以珠美海棠實(shí)生苗為材料，通過miRNA測序獲得樣品的miRNA序列數(shù)據(jù)，并通過生物信息學(xué)注釋了匹配到與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的靶基因，為珠美海棠的砧木利用提供理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為解決耐鹽砧木的利用提供有力支持。

2? 數(shù)據(jù)采集和處理方法

2.1? 植物材料和鹽的處理

試驗(yàn)材料來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家蘋果種質(zhì)資源圃（遼寧興城），挑選健康的珠美海棠種子于4℃層積60 d。將層積的種子播種在營養(yǎng)缽中，隨后移栽在花盆中，每盆各一株。挑選150株生長一致、高度約30 cm的一年生苗，分別進(jìn)行0、0.2%和0.6% 的NaCl脅迫處理，每50株為一個(gè)處理組。隨后在鹽脅迫第0、4、8和12 d時(shí)選取整齊一致的植株用超純水洗凈，分別采集葉片和根系液氮速凍，每個(gè)處理重復(fù)3次。取樣完成后，收集的組織樣本在液氮速凍后放入干冰中寄送到測序公司。

2.2? sRNA測序

每個(gè)樣本中的RNA提取參照植物RNA分離試劑盒的說明進(jìn)行分離（Aidlab EASYspin， Beijing， China），隨后用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解和污染，RNA濃度和純度采用Nucleic Proteometer Thermo NANODrop 2000（Thermo Fisher Scientific， Wilmington， DE， USA）進(jìn)行檢測，使用RNA Nano 6000檢測試劑盒評估RNA的完整性（Agilent Technologies， Santa Clara， CA， USA）。只有260/280比值為1.8－1.9，260/230比值為2.0－2.5、RNA完整性（RNA integrity number）大于6.0的RNA樣本可以被認(rèn)為是合格樣品。

獲得高質(zhì)量RNA后，使用Ribo-ZeroTM試劑盒（Epicentre， Madison， WI， USA）去除樣本中rRNA以富集原核mRNA。隨后，使用片段緩沖液隨機(jī)中斷富集的mRNA片段，用六堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，用DNA聚合酶I、RNase H、dNTP和buffer solution合成第二鏈cDNA，使用AMPure XP beads純化cDNA片段。在PCR擴(kuò)增前將純化的雙鏈cDNA片段末端修復(fù)、添加堿基并與NEBNext適配器連接cDNA 15 min。PCR產(chǎn)物用AMPure XP系統(tǒng)（Beckman Coulter， Beverly， MA， USA）純化，并由Agilent 2100 Bioanalyzer系統(tǒng)進(jìn)行文庫質(zhì)量評估。測序采用Illumina HiSeq高通量測序平臺，經(jīng)過堿基識別和分析后，從測序數(shù)據(jù)中獲得FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)。

2.3? 生物信息學(xué)分析

為了進(jìn)行后續(xù)分析，采用‘Golden Delicious GDDH13_V1.1作為參考基因組進(jìn)行序列比對。如圖1所示，Illumina測序平臺的工作流程如下：首先經(jīng)過堿基識別，即Base Calling，原有的圖像數(shù)據(jù)文件會(huì)被轉(zhuǎn)換為原始測序序列，這也就是所謂的Raw Data或者Raw Reads。

這些收集到的原始序列可能會(huì)包含有接頭序列或者質(zhì)量較低的序列。為了保證分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，需要對這些初始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢查，然后再生成高質(zhì)量的序列，即Clean Reads。隨后用短序列比對工具Bowtie將Clean Reads比對到Silva數(shù)據(jù)庫、GtRNAdb數(shù)據(jù)庫、Rfam數(shù)據(jù)庫以及Repbase數(shù)據(jù)庫。此流程有助于過濾掉核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核內(nèi)小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）等非編碼RNA以及重復(fù)序列。在與參考基因組比對完成后，將比對結(jié)果與miRBase（v22）數(shù)據(jù)庫內(nèi)已有的miRNA成熟序列及其上下游序列進(jìn)行比對。此階段最多允許一個(gè)錯(cuò)配，被滿足條件的reads將被確認(rèn)為已知miRNA。對于沒有能夠匹配到已知miRNA序列的數(shù)據(jù)，使用miRDeep2軟件工具來進(jìn)行處理。該軟件通過分析reads在基因組上的位置信息，能夠推斷出潛在的前體序列。然后根據(jù)reads在前體序列中的分布和前體的結(jié)構(gòu)能量信息，利用貝葉斯模型進(jìn)行評分，以預(yù)測新的miRNA。隨后，對已知的miRNA和新預(yù)測的miRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)和堿基編輯等相關(guān)分析，將獲得的靶基因與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對和分類注釋。最終基于這些注釋，確定與響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的miRNA。

3? 數(shù)據(jù)樣本描述

3.1? sRNA深度測序數(shù)據(jù)

從珠美海棠對照組0 NaCl（0 d）和NaCl（0.2%和0.6%）脅迫條件處理4 d、8 d、12 d的葉片（L）及根系（R）部位中提取總RNA，構(gòu)建了包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)共42個(gè)樣品的RNA-seq文庫，并利用Illumina Hiseq X-ten平臺進(jìn)行高通量測序。對所獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)一步過濾，最終得到用于后續(xù)分析的高質(zhì)量小RNA reads。通過質(zhì)量控制，每個(gè)樣品的Clean Data均大于9.31 M。隨后將每個(gè)樣本中獲取的Clean Reads與‘Golden Delicious GDDH13_V1.1參考基因組進(jìn)行比對，Q30和GC含量分別為99.06%－99.35%、41.02%－49.37%（表1）。

3.2? miRNA分析

miRNA的起始轉(zhuǎn)錄位置往往在基因間隔區(qū)、內(nèi)含子與編碼序列的反向互補(bǔ)序列上。這些miRNA的前體都體現(xiàn)出所具有的特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而其成熟體則是要依賴于Dicer或DCL酶的剪切才能實(shí)現(xiàn)?；趍iRBase（v22）數(shù)據(jù)庫和miRDeep2軟件包，我們對42個(gè)樣品進(jìn)行了深入分析，共鑒定出575個(gè)miRNA。其中，已知的miRNA有315個(gè)，而新預(yù)測的miRNA則有260個(gè)。此外，miRDeep2軟件還預(yù)測了新miRNA的候選前體結(jié)構(gòu)及其序列深度信息，并生成相應(yīng)的pdf文件（圖2）。

注：圖A為miRDeep2軟件對miRNA前體的打分和比對到成熟序列、環(huán)狀結(jié)構(gòu)、star序列上的reads數(shù)及其前體的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖：紅色為成熟序列，黃色為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，紫色為star序列；圖B顯示比對到本條前體上的reads分布；圖C包含了成熟序列、環(huán)狀結(jié)構(gòu)、star序列的位置，紫色為miRDeep2軟件預(yù)測的star序列，亮藍(lán)色為測序reads支持的star序列。

3.3? 鹽脅迫下miRNA的差異表達(dá)分析

為了在珠美海棠中發(fā)現(xiàn)響應(yīng)鹽脅迫的miRNA，分析了在0.2%和0.6% NaCl處理下葉片和根系中不同處理時(shí)間（4 d、8 d、12 d）下鹽響應(yīng)差異miRNA的相對表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)在0.2% NaCl處理4 d、8 d、12 d后的葉片中分別有10、126和15個(gè)DE miRNA特異性表達(dá)，3個(gè)DE miRNA在鹽處理4 d、8 d、12 d后的葉片中共同表達(dá)。在0.6% NaCl處理4 d、8 d、12 d后的葉片中分別有29、29和30個(gè)DE miRNA特異性表達(dá)，9個(gè)DE miRNA共同表達(dá)（圖3a）。此外，在0.2% NaCl處理4 d、8 d、12 d后的根中分別有38、34和27個(gè)DE miRNA特異性表達(dá)，10個(gè)DE miRNA共同表達(dá)。在0.6% NaCl處理4 d、8 d、12 d后的根中分別有55、39和9個(gè)DE miRNA特異性表達(dá)，22個(gè)DE miRNA共同表達(dá)（圖3b）?？傊?，這些miRNA對鹽脅迫反應(yīng)具有組織特異性表達(dá)模式。

3.4? miRNA靶基因預(yù)測及注釋

通過已知的miRNA與新預(yù)測出的miRNA，再結(jié)合對應(yīng)物種的基因序列信息，運(yùn)用TargetFinder軟件預(yù)測可能的靶基因，預(yù)測結(jié)果如表2所示。以BLAST軟件為工具，針對預(yù)測出的靶基因序列和NR、Swiss-Prot、Pfam等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)一步了解這些靶基因，以此獲取靶基因的注釋信息。在5 812個(gè)預(yù)測出的靶基因中，共有5 692個(gè)獲得了注釋信息。全部miRNA靶基因注釋數(shù)量和不同樣品miRNA靶基因注釋數(shù)量見表3。

3.5? 注釋到的響應(yīng)鹽脅迫靶基因數(shù)據(jù)及GO分析

注釋到響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的靶基因數(shù)據(jù)以.xlsx文件格式保存。其中，注釋到鹽脅迫的靶基因見表4?；诩?xì)胞成分、分子功能和生物過程對預(yù)測的靶基因進(jìn)行GO富集分析。GO分析顯示，差異表達(dá)的靶基因被注釋為44個(gè)GO術(shù)語。在細(xì)胞成分類別中，主要富集的術(shù)語是“Cell”（GO：0005623）、“Cell part”（GO：0044464）、“membrane”（GO：0016020）和“organelle”（GO：0043226）。就其分子功能而言，主要富集的術(shù)語是“binding”（GO：00055488）、“catalytic activity”（GO：0003824）、“transporter activity”（GO：0005215）和“nucleic acid binding transcription factor activity”（GO：0003676）。涉及生物過程的主要術(shù)語是“metabolic process”（GO：0008152）、“cellular process”（GO：0009987）、“single-organism process”（GO：0044699）、“biological regulation”（GO：0065007）、“developmental process”（GO：0032502）和“response to stimulus”（GO：0050896）（圖4）。

4? 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與評估

為了保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性，試驗(yàn)樣品寄送到北京百邁客生物科技有限公司后，由專業(yè)人員進(jìn)行總RNA的提取以及miRNA的深度測序，并使用百邁客云平臺進(jìn)行生物信息學(xué)分析。同時(shí)確保所提取的RNA滿足構(gòu)建miRNA文庫的要求。miRNA測序后的原始序列首先通過內(nèi)部perl腳本進(jìn)行處理，隨后通過去除接頭；去除短于18或長于30個(gè)核苷酸的序列；去除對于每個(gè)樣本中質(zhì)量值低的序列；去除未知堿基N含量大于等于10%的Reads以獲得Clean Reads。共得到648.15 M Clean Reads，各樣品不少于9.31 M Clean Reads。同時(shí)計(jì)算清理數(shù)據(jù)的Q30、GC含量和序列重復(fù)水平。以上數(shù)據(jù)的整理過程均由專業(yè)人員進(jìn)行核查。

將rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA等ncRNA以及重復(fù)序列過濾后，選用非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫（NR）、同源蛋白家族數(shù)據(jù)庫（Pfam）、人工注釋的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫（Swiss-Prot）等數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行注釋，并根據(jù)不同數(shù)據(jù)庫的注釋最終確定與響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的靶基因。響應(yīng)鹽脅迫靶基因篩選按照如下標(biāo)準(zhǔn)篩選：當(dāng)只在其中一種數(shù)據(jù)庫中注釋到與耐鹽相關(guān)的基因，則保留該注釋的基因；當(dāng)在兩種或以上數(shù)據(jù)庫中均注釋到響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的基因，則保留該注釋的基因。

5? 數(shù)據(jù)價(jià)值與使用建議

該數(shù)據(jù)集通過miRNA深度測序獲得樣品的序列數(shù)據(jù)，并利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合分析，注釋到珠美海棠與響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的靶基因，可為珠美海棠的砧木利用提供理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。同時(shí)為解決耐鹽砧木的利用提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

6? 數(shù)據(jù)可用性

中國科技資源標(biāo)識碼（CSTR）： 17058.11.sciencedb. agriculture.00097；

數(shù)據(jù)對象標(biāo)識碼（DOI）： 10.57760/sciencedb. agriculture.00097。

數(shù)據(jù)服務(wù)系統(tǒng)網(wǎng)址：https：//www.scidb.cn/s/iqmQfi。

作者分工與貢獻(xiàn)

劉昭，數(shù)據(jù)整理匯總和論文撰寫。

高源，數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與方法設(shè)計(jì)。

王昆，數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與方法設(shè)計(jì)。

孫思邈，數(shù)據(jù)收集與可視化。

代瑛姿，前期數(shù)據(jù)處理和分析。

路翔，樣品收集及質(zhì)量控制。

田雯，數(shù)據(jù)匯總處理。

王大江，論文構(gòu)架及質(zhì)量控制。

馮建榮，論文構(gòu)架及質(zhì)量控制。

倫理聲明

本研究未涉及倫理。

利益沖突聲明

作者聲明，全部作者均無會(huì)影響研究公正性的財(cái)務(wù)利益沖突或個(gè)人利益沖突。

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Deep Sequencing Dataset of miRNAs in Response to Salt Stress in Apples

LIU Zhao1，2， GAO Yuan2， WANG Kun2， SUN SiMiao2， DAI YingZi1， LU Xiang1，2， TIAN Wen1，2， WANG DaJiang2，*， FENG JianRong1，*

1 College of Agriculture， Shihezi University， Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germplasm Resources Utilization， Shihezi 832000， Xinjiang ， China; 2 Research Institute of Pomology ， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Horticultural Crops Germplasm Resources Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xingcheng 125100， Liaoning， China

Abstract： Soil salinization has become an important factor limiting crop yield and quality， affecting crop yields worldwide. As an important fruit crop， the harm of salt stress and the lack of salt tolerant rootstocks have become important issues threatening the healthy and sustainable development of the modern apple industry. Therefore， studying the response and adaptation of apple trees to salt stress is of great practical significance and urgency. In this study， total RNA was extracted from the leaves and roots of Malus zumi （Mats.） Rehd. seedlings were treated with 0， 0.2% and 0.6% NaCl after 0， 4， 8 and 12 days， and RNA-seq libraries were constructed. A total of 575 miRNAs were identified， including 315 known mdm-miRNAs and 260 new miRNAs. In addition， differentially expressed （DE） miRNAs exhibited tissue-specific expression patterns in response to salt stress. At the same time， a data set for deep sequencing of miRNA in Malus zumi （Mats.） Rehd was provided， and bioinformatics methods were used to control the quality of the original data. High quality sequences were obtained， and BLAST software was used to compare the predicted target gene sequences with NR， Swiss Prot， Pfam and other databases to obtain annotation information of salt tolerance related genes. GO analysis shows that miRNAs and target genes related to salt stress are mainly involved in the response to stimuli in biological processes. This will provide theoretical data basis for the utilization of Malus zumi （Mats.） Rehd and favorable support for the breeding of salt tolerant rootstocks.

Keywords： apple; salt stress; miRNA; deep sequencing; bioinformatics