精制狗皮膏揮發(fā)性成分的提取及其GC-MS分析

顏巧蓉 唐宇航 劉文涵

（浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江 杭州 310014）

中成藥精制狗皮膏具有舒筋、活血、散寒、止痛的功效，用于治療筋骨痛、急性挫傷、扭傷、風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)痛、脅痛、肌肉酸痛等癥。主要由生川烏、防己、山柰、透骨草、延胡索、干姜、辣椒、樟腦、冰片等十二味中藥制備而成［1］。其中山柰、透骨草、干姜、樟腦、冰片等含有揮發(fā)性成分，這些揮發(fā)性成分具有一定的藥理和藥效，是質(zhì)量評價的重要指標［2］。

目前，精制狗皮膏的質(zhì)量控制中只有粉防己堿、延胡索的薄層色譜鑒別和含膏量檢查［1］，僅就這兩項指標控制該產(chǎn)品的質(zhì)量未免有失全面。本文采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對精制狗皮膏進行了揮發(fā)性成分分析，為有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

精制狗皮膏（國內(nèi)某品牌，批號：100501，購于杭州藥店）。

GC6890N/MSD5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；TC-15型恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）；AL204型電子天平（Mettler-Toledo Group）；揮發(fā)油提取器（油比水輕型）。

乙酸乙酯、丙酮、乙醚、二氯甲烷、正己烷、無水硫酸鈉均為分析純；水為超純水（電阻率≥18.3MΩ·cm，自制）。

1.2 供試品溶液的制備

取樣品2貼，除去蓋襯，剪成小碎片，置500mL圓底燒瓶中，加入200mL超純水和數(shù)粒玻璃珠，室溫浸泡0.5h，接妥揮發(fā)油提取器，由其上端加入超純水至溢流入圓底燒瓶為止，加入1mL乙酸乙酯。置電熱套中緩緩加熱至沸開始計時，并保持微沸4h。停止加熱，靜置冷卻，取乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥后置于容量瓶中，并用適量溶劑洗滌揮發(fā)油測定器數(shù)次，洗滌液并入容量瓶中，用溶劑定容，搖勻。過0.45μm膜，供GC-MS分析。

1.3 GC-MS分析條件

色譜條件：HP-5MS色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm）；載氣：高純氦（99.999％），流速：0.8mL·min-1（恒流）；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初溫50℃，保持5min，然后以5℃·min-1升至260℃，保持10min；進樣量：1μL；分流比：20：1。

質(zhì)譜條件：離子源：EI源；電子轟擊能量：70e V；倍增電壓：1 294V；離子源溫度：230℃；接口溫度：280℃；質(zhì)量掃描范圍：45amu～500amu；溶劑延遲：4.5min。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法研究

2.1.1 浸泡時間的考察

不同的浸泡時間對中藥提取度的影響不同。本次實驗分別考察了浸泡0.5h和3h的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)浸泡時間對揮發(fā)油提取率及成分基本無影響。考慮到實驗操作過程中的實際性，選擇浸泡時間為0.5h。

2.1.2 萃取溶劑的選擇

在前處理中，選用不同的溶劑作為萃取蒸餾液溶劑時得到的結(jié)果差別比較大。本實驗分別考察了丙酮、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、正己烷這5種溶劑，發(fā)現(xiàn)用乙醚和正己烷作為萃取溶劑時得到的TIC峰的數(shù)目較其它三種萃取溶劑多。而用乙醚和正己烷這兩種溶劑萃取出的組分色譜圖在色譜峰的個數(shù)和含量上差別不大；考慮到乙醚的揮發(fā)性較正己烷強，在提取過程中以及提取物的保存中都不如正己烷溶劑穩(wěn)定，所以本文選擇正己烷作為萃取溶劑。

2.1.3 單次加水量的確定

為考察單次加水量對揮發(fā)油得率的影響情況，固定其它條件不變，改變單次加水量。隨著加水量的增加，峰響應(yīng)值先增加后減少，單次加水量為200mL時響應(yīng)值最高。因此，在后面的提取實驗中選擇加200mL超純水。

2.1.4 提取時間的優(yōu)化

實驗過程中，提取時間是比較關(guān)鍵的影響因素之一，本文考察了提取時間分別為1h、2h、3h、4h、5h和6h的試驗情況。結(jié)果表明：在0～4h內(nèi)響應(yīng)值隨著提取時間的延長而增加，4h后響應(yīng)值略有上升但幅度不大，為了節(jié)約時間，提高工作效率，選擇4h為最佳提取時間。

2.1.5 重現(xiàn)性實驗

為進一步驗證實驗結(jié)果的可靠性與重復(fù)性，在以上確定的條件下做3次實驗，3次實驗TIC峰的數(shù)目相同且強度也相差很小，說明在此條件下實驗重現(xiàn)性較好。

2.2 精制狗皮膏揮發(fā)性成分分析

在優(yōu)化的實驗條件下，提取精制狗皮膏中的揮發(fā)性成分并進行GC-MS分析，所得總離子流圖（TIC）見圖1。

圖1 精制狗皮膏揮發(fā)性成分總離子流圖Fig 1 Total ion chromatography of volatile components from Refining Cream dogskin

通過檢索NIST 2005譜圖庫，并查閱有關(guān)文獻［3-10］與標準譜圖庫對照分析，確認精制狗皮膏揮發(fā)性組分的化學(xué)成分。共檢出76個色譜峰，鑒定了其中59個化合物，占總峰面積的92.70％。采用峰面積歸一化法求得各組分在揮發(fā)油中的相對百分含量，結(jié)果見表1。

表1 精制狗皮膏揮發(fā)性化學(xué)成分Tab 1 Chemical components of volatile compounds from Refining Cream dogskin

續(xù)表1

由表1可知，精制狗皮膏的主要成分為樟腦（36.35％）、薄荷腦（21.43％）和水楊酸甲酯（15.95％），其中相對百分含量超過1％的還有長葉烯（7.94％）、右松酯醛（2.71％）、石竹烯（1.77％）和西柏烯（1.24％），上述成分占揮發(fā)油總量的87.39％。從化合物種類來看，主要為萜烯類及其含氧衍生物（41種，75.66％）、芳香族類（5種，16.68％）和烷烴類（12種，0.36％）化合物。萜類化合物中含單萜類12種，倍半萜類23種，二萜類6種，這些萜類化合物具有抗炎、止痛、消腫等多種功效，這與精制狗皮膏的藥效基本一致。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗對精制狗皮膏揮發(fā)性成分提取過程中的多種因素進行了優(yōu)化，確定最佳提取條件為：室溫下超純水浸泡0.5h，單次加水量200mL，水蒸氣蒸餾提取4h，萃取溶劑選用正己烷。采用GC-MS法對提取的揮發(fā)性成分進行了分離和鑒定，共分離出76個組分，并鑒定了其中59個化合物，主要為單萜烯類、倍半萜烯類及其含氧衍生物。此研究結(jié)果可為精制狗皮膏氣相色譜指紋圖譜的研究及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準［S］.中藥成方制.第八冊，1993：203.

［2］梁 悅，王 璐，茹 鑫，等.逍遙丸（水丸）揮發(fā)性成分的提取及其氣相色譜-質(zhì)譜法分析［J］.分析測試學(xué)報，2009，28（10）：1170.

［3］Wang Z M，Wang L，Li T C，et al.Rapid analysis of the essential oils from dried Illicium verum Hook.f.and Zingiber officinale Rosc.by improved solvent-free microwave extraction with three types of microwave-absorption medium［J］.Anal Bioanal Chem，2006，386（6）：1867.

［4］李 翔，王 敏.干姜揮發(fā)油的均勻設(shè)計提取和化學(xué)成分鑒定［J］.華北國防醫(yī)藥，2010，22（3）：218.

［5］容 蓉，邱麗麗，劉 朋，等.干姜揮發(fā)性成分的水蒸氣蒸餾提取與頂空進樣氣相色譜-質(zhì)譜分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：2811.

［6］邱 琴，劉廷禮，趙 怡，等.氣相色譜-質(zhì)譜法分析山柰揮發(fā)油化學(xué)成分［J］.理化檢驗-化學(xué)分冊，2000，36（7）：295.

［7］崔炳權(quán)，郭曉玲，林元藻.海南產(chǎn)山柰揮發(fā)油化學(xué)成分分析［J］.中國藥房，2008，19（3）：216.

［8］張桂芝，顧玲燕，孟慶華.山柰飲片揮發(fā)油的GC-MS特征成分和指紋圖譜研究［J］.中成藥，2009，31（7）：987.

［9］侯冬巖，回瑞華，李鐵純.GC/MS法分析透骨草化學(xué)成分［J］.遼寧師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002，25（3）：292.

［10］楊再波，鐘才寧，孫成斌，等.固相微萃取/GC-MS分析透骨草的揮發(fā)性成分［J］.華西藥學(xué)雜志，2008，23（4）：389-390.