基于香豆素和寡聚芳酰胺的Hg2+熒光探針性能及應(yīng)用研究

楊永安，王 媛，陳 明，謝一柳，王英伍，許肖云

（1.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009；2.四川省遂寧生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，四川 遂寧 629000；3.西華師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，四川 南充 637009）

汞廣泛存在于自然界中，隨著人類活動(dòng)開展和工業(yè)進(jìn)程的加快，汞的消耗量也越來越大。2018年聯(lián)合國(guó)環(huán)境署發(fā)布的報(bào)告表明，全世界每年排放汞數(shù)千噸。汞的主要存在形式為單質(zhì)汞、無機(jī)汞和有機(jī)汞，進(jìn)入環(huán)境中的無機(jī)汞在細(xì)菌作用下可轉(zhuǎn)化成毒性更大且難分解的有機(jī)汞。汞及其衍生物隨食物鏈進(jìn)入生物體后，極易與細(xì)胞膜或酶蛋白內(nèi)的巰基結(jié)合［1-2］，從而影響細(xì)胞的正常代謝和生理功能，且易產(chǎn)生生物富集［3-5］，進(jìn)而損害心臟、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、口腔及皮膚等器官［6-8］，即使很低的濃度也可能會(huì)造成永久性破壞［9-11］，導(dǎo)致人體中毒，如水俁?。?2］，給人類健康帶來巨大傷害［13］。世界衛(wèi)生組織和我國(guó)規(guī)定飲用水中的汞不能超過1.0×10-3mg/L［14］。目前，汞已成為最引人關(guān)注的環(huán)境污染物之一［15］。因此，設(shè)計(jì)和開發(fā)高效、快速且靈敏的汞檢測(cè)技術(shù)愈加緊迫和重要。

目前汞的測(cè)定方法有分光光度法、原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法、高效液相色譜法以及電化學(xué)法等［16-20］，但上述方法存在樣品預(yù)處理復(fù)雜、分析設(shè)備昂貴、分析周期長(zhǎng)等弊端，難以滿足方便、快捷和靈敏的檢測(cè)要求［21］。熒光法因具有操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)異性能，受到研究人員的廣泛關(guān)注［22］。熒光探針的核心是熒光基團(tuán)，常見的有羅丹明類、萘酰亞胺類、菁類、香豆素類以及吡咯甲川類等［23-27］。其中香豆素因熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、斯托克斯位移大以及易修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于探針設(shè)計(jì)［28-30］。

已有研究設(shè)計(jì)并合成了一種基于三中心氫鍵促進(jìn)的剛性芳酰胺寡聚體［31-32］。該類分子不僅具有合成簡(jiǎn)單、原料易得、易純化和產(chǎn)率高的特點(diǎn)，且因其三中心氫鍵處于骨架外部，使得羰基伸向環(huán)內(nèi)形成一個(gè)富電子空腔，該空腔不僅可選擇性地識(shí)別某些小分子［33-34］，還對(duì)某些金屬離子具有很強(qiáng)的絡(luò)合能力［35-37］?；趯?duì)該類新型化合物的結(jié)構(gòu)特性和研究興趣，本文首次利用寡聚芳酰胺三聚體和3-氨基香豆素高效合成了擁有兩個(gè)香豆素?zé)晒饣鶊F(tuán)的寡聚芳酰胺分子（Coumarin-oligaramide，COA）（合成路線見圖1），并研究了其對(duì)Hg2+離子的識(shí)別性能及檢測(cè)機(jī)理。最后將其用于實(shí)際水樣中Hg2+離子的檢測(cè)，以考察其在環(huán)境監(jiān)測(cè)和分離領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值，為指導(dǎo)和設(shè)計(jì)更加高效的新型熒光探針奠定基礎(chǔ)。

圖1 探針COA的合成路線Fig.1 Synthesis route of probe COA

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse 型熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Agilent 公司）；AVANCE-400 型核磁共振儀（四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，CDCl3作溶劑）、INVENIO R 型傅里葉變換紅外光譜儀（IR，美國(guó)Bruker 公司）；Q-TOF-Premier spectrometer 型質(zhì)譜儀（ESI-HRMS，美國(guó)Waters 公司）；AFS-9130型原子熒光光度計(jì)（北京吉天儀器有限公司）。

3-氨基香豆素、乙二胺四乙酸四鈉鹽水合物（EDTA）、鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/L）、KNO3、NaNO3、Ca（NO3）2·4H2O、Mg（NO3）2·6H2O、Cu（NO3）2·3H2O、Zn（NO3）2·6H2O、Pb（NO3）2、Cd（NO3）2·4H2O、Fe（NO3）3·9H2O、Mn（NO3）2·6H2O、Ni（NO3）2·6H2O、Co（NO3）2·6H2O、AgNO3、Al（NO3）3·9H2O、Cr（NO3）3·9H2O、Hg（NO3）2·H2O購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司，除鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液外均為分析純。測(cè)試所用溶劑為色譜純。汞質(zhì)控樣購(gòu)于環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所。其余原料均從供應(yīng)商處購(gòu)買后直接使用。

1.2 金屬離子濃度標(biāo)定

用EDTA 待測(cè)溶液滴定鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液（二甲酚橙為指示劑，六次甲基四胺為緩沖溶液）至溶液由紫紅色變?yōu)辄S色即為滴定終點(diǎn)，平行滴定5 次，計(jì)算EDTA 溶液濃度。接著分別稱量約2.0 g 各金屬硝酸鹽于100 mL 燒杯中，用去離子水溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶并定容；在pH 5.0～6.0 條件下，以二甲酚橙為指示劑，用已標(biāo)定的EDTA滴定金屬離子至紫色變?yōu)辄S色即為滴定終點(diǎn)，平行滴定5次，計(jì)算金屬離子溶液濃度。

1.3 探針合成

化合物1、2、3以及寡聚芳酰胺三聚體4按照參考文獻(xiàn)［31，35］的方法進(jìn)行合成。

在250 mL 三頸瓶中，加入4.46 g 寡聚芳酰胺三聚體4、1.42 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）、760 mg 1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAT）和100 mL 二氯甲烷，常溫下攪拌1 h 后，加入726 mg 3-氨基香豆素（化合物5），室溫下過夜攪拌。待反應(yīng)完全后，依次用稀鹽酸和水洗滌產(chǎn)物，再以無水硫酸鈉干燥后經(jīng)硅膠柱層析（CH2Cl2-CH3OH，15∶1，體積比） 提純，得橙色產(chǎn)物3.47 g，產(chǎn)率69.5%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.58（s，2H），9.47（s，2H），9.18（s，2H），9.02（s，1H），8.45（s，2H），7.65（d，J＝8.0 MHz，2H），7.65（t，J=8.0 Hz，2H），7.58（t，J=8.0 Hz，2H），7.52（d，J＝8.0 MHz，2H），6.55（s，3H），4.09（t，J=6.40 Hz，8H），3.80（s，12H），1.94（m，8H），1.17～1.44（m，72H），0.78～1.82（m，12H）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：164.87，163.82，159.30，158.50，156.57，151.47，149.26，145.33，143.05，136.87，130.23，128.32，125.90，121.81， 119.83， 117.25， 115.02， 112.84， 107.07， 107.52， 96.69， 94.89， 69.25， 61.84，31.91，29.71，29.69，29.67，29.59，29.36，26.02，22.67，14.07。ESI-HRMS：m/z1487.95［M＋H］＋。

1.4 光譜測(cè)試

分別取已標(biāo)定的K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Ag+、Cr3+、Al3+、Co2+、Hg2+金屬離子溶液，用甲醇配制成1.0×10-3mol/L的金屬離子貯備液。用CH2Cl2∶CH3OH=9∶1（體積比）混合液配制濃度為1.0×10-5mol/L的探針溶液。

取2.5 mL探針溶液至石英比色皿（厚度1.0 cm，體積3.0 mL）中，加入金屬離子貯備液，最大加入量不超過0.1 mL，以減少體積變化對(duì)待測(cè)溶液濃度的影響［38］。輕微振搖后進(jìn)行熒光光譜測(cè)試。本實(shí)驗(yàn)中，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為365 nm和515 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針對(duì)金屬離子的識(shí)別

在配制的探針混合溶液中，分別加入1.0×10-5mol/L的K+、Na+、Ag+、Al3+、Co2+、Cr3+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Hg2+金屬離子溶液。結(jié)果如圖2 所示，前15 種金屬離子加入后體系熒光強(qiáng)度均較低，表明探針分子對(duì)這些金屬離子沒有響應(yīng)或微弱響應(yīng)；加入Hg2+后，515 nm 處出現(xiàn)一個(gè)很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，表明熒光探針對(duì)Hg2+具有很好的選擇性。盡管加入Fe3+時(shí)探針分子具有一定熒光強(qiáng)度，但強(qiáng)度僅為Hg2+的五分之一，其影響可忽略。

圖2 不同金屬離子（1.0×10-5 mol/L）存在下探針COA（1.0×10-5 mol/L）的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of probe COA（1.0×10-5 mol/L） in the presence of different metal ions（1.0×10-5 mol/L）

2.2 Hg2+濃度對(duì)熒光強(qiáng)度影響

考察了Hg2+濃度對(duì)探針COA 熒光強(qiáng)度的影響。在配制的探針混合溶液中，分別加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5（×10-5mol/L）的Hg2+溶液，結(jié)果如圖3 所示。隨著Hg2+濃度的不斷增加，COA 的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)Hg2+濃度為1.5×10-5mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度增加了約15倍。Hg2+濃度達(dá)1.0×10-5mol/L后，探針COA的熒光強(qiáng)度幾乎不再增加，熒光強(qiáng)度接近最大值，可推斷探針COA與Hg2+的配比為1∶1。

圖3 探針COA（1.0×10-5 mol/L）在不同Hg2+濃度下的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of probe COA（1.0×10-5 mol/L）with different concentrations of Hg2+

向已配制的探針溶液中，逐次加入0.1×10-5～1.0×10-5mol/L 的Hg2+，分別測(cè)定加入后的熒光強(qiáng)度，并利用Origin 8.0 軟件擬合曲線。結(jié)果表明，Hg2+濃度（x）在0.1×10-5～1.0×10-5mol/L 范圍內(nèi)，與探針COA 的熒光強(qiáng)度（y）呈線性關(guān)系，線性方程為y=421.5818x+30.8454，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9953。根據(jù)3σ/k計(jì)算檢出限（LOD），其中σ表示經(jīng)10 次測(cè)量的探針空白溶液熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為擬合曲線的斜率。經(jīng)計(jì)算得到LOD 值為2.08×10-7mol/L，低于世界衛(wèi)生組織對(duì)飲用水中Hg2+含量最低標(biāo)準(zhǔn)（4.98×10-7mol/L 即1.0×10-3mg/L）和我國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838-2002）Ⅲ類水中Hg2+的標(biāo)準(zhǔn)限值（4.98×10-7mol/L）［14］，說明該COA 探針具有較強(qiáng)的檢測(cè)能力。

2.3 共存金屬離子的影響

為考察在其它金屬離子共存下，探針COA選擇性識(shí)別Hg2+的能力，進(jìn)行了共存金屬離子競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。在探針溶液中加入1.0×10-5mol/L 的共存金屬離子，測(cè)定其最大熒光強(qiáng)度，然后加入1.0×10-5mol/L 的Hg2+，比較加入Hg2+前后的最大熒光強(qiáng)度值。結(jié)果如圖4 所示，加入Hg2+后，探針COA 與Ag+、Cr3+、Al3+、Co2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+、Ca2+、Mg2+、K+、Na+體系的熒光強(qiáng)度分別增加了23.7、 10.7、 9.9、 6.8、 10.0、 9.6、 6.2、10.8、15.3、9.1、14.4、28.5、18.4、29.6和51.9 倍。由此可知，Hg2+較其它金屬離子具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力，探針COA 在選擇性識(shí)別Hg2+時(shí)，不受其它共存金屬離子的影響，具有很強(qiáng)的抗干擾能力。

圖4 共存金屬離子競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)Fig.4 Competition experiments of coexisting metal ions cHg2+=cmetal ions =1.0×10-5 mol/L

2.4 可逆性研究

為了考察探針COA 的回收情況和應(yīng)用潛力，選用與Hg2+配位能力更強(qiáng)的EDTA（兩者的穩(wěn)定常數(shù)高達(dá)6.3×1021［39］）對(duì)其進(jìn)行可逆性研究。結(jié)果如圖5 所示，COA 探針的熒光強(qiáng)度很弱（曲線a），當(dāng)加入Hg2+后，探針COA 與Hg2+相互作用，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光（曲線b）；當(dāng)加入EDTA 后，熒光強(qiáng)度回落到最初狀態(tài)（曲線c），這是由于具有更強(qiáng)配位能力的EDTA 與Hg2+形成更穩(wěn)定的配合物，從而釋放出探針，說明探針COA在識(shí)別Hg2+的過程中具有可逆性。

圖5 探針COA識(shí)別Hg2+的可逆實(shí)驗(yàn)Fig.5 Reversible experiment of probe COA to identify Hg2+

2.5 配位比的測(cè)定

本研究基于Job's plot 實(shí)驗(yàn)選用熒光光譜法確定探針與Hg2+的配位比。結(jié)果如圖6 所示，隨著［Hg2+］/（［COA］+［Hg2+］）的比值逐漸增大，熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，當(dāng)［Hg2+］/（［COA］+［Hg2+］）的比值為0.5時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最高點(diǎn)，說明探針與Hg2+的配位比為1∶1，該結(jié)論與滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 探針COA與Hg2+的Job's plot曲線Fig.6 Job's plot of probe COA and Hg2+

2.6 識(shí)別機(jī)理推測(cè)

由熒光滴定實(shí)驗(yàn)和Job's plot 實(shí)驗(yàn)可知，探針COA 與Hg2+的配位比為1∶1。為進(jìn)一步確定探針COA 對(duì)Hg2+的識(shí)別機(jī)理，測(cè)定了COA、COA 和Hg2+絡(luò)合物的紅外光譜。結(jié)果如圖7 所示，在COA的紅外光譜中，1 690 cm-1處的峰歸屬為香豆素C=O 的振動(dòng)峰［41］，1 660 cm-1處為寡聚芳酰胺C=O的伸縮振動(dòng)峰［42］。當(dāng)COA與Hg2+絡(luò)合后，寡聚芳酰胺C=O 的伸縮振動(dòng)峰紅移至1 676 cm-1，而香豆素C=O 的振動(dòng)峰僅紅移至1 691 cm-1處。說明與Hg2+發(fā)生配位的是探針COA 中寡聚芳酰胺中的羰基氧，而非香豆素中的羰基氧。

圖7 COA，COA和Hg2+絡(luò)合物的紅外光譜Fig.7 IR spectra of probe COA，COA and Hg2+ complex

采用核磁共振氫譜進(jìn)一步推測(cè)了COA 對(duì)Hg2+的識(shí)別機(jī)理。結(jié)果如圖8所示，加入Hg2+后，酰胺鍵質(zhì)子Ha、Hb 和寡聚芳酰胺芳環(huán)質(zhì)子Hc、Hd 分別向低場(chǎng)移動(dòng)了0.38、0.31、0.52、0.57 ppm，而香豆素中的質(zhì)子He 幾乎沒有發(fā)生位移，再次說明與Hg2+配位的是寡聚芳酰胺中的羰基氧，與紅外光譜的結(jié)論一致。

圖8 300 K下COA、COA和Hg2+絡(luò)合物（2.0×10-3 mol/L）的核磁共振氫譜Fig.8 1H NMR spectra of COA，COA and Hg2+ complex（2.0×10-3 mol/L） at 300 K

結(jié)合以上分析，推測(cè)探針COA 和Hg2+的識(shí)別機(jī)理如圖9所示。加入Hg2+前，在365 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，COA 探針中寡聚芳酰胺羰基氧上的孤對(duì)電子向熒光基團(tuán)香豆素轉(zhuǎn)移，發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET），使得探針COA 僅發(fā)出微弱的熒光；當(dāng)探針COA 與Hg2+作用后，由于羰基氧上的孤對(duì)電子參與配位，無法發(fā)生PET 過程，從而使得探針在515 nm處發(fā)出很強(qiáng)的熒光。

圖9 COA與Hg2+的識(shí)別機(jī)理Fig.9 Recognition mechanism of COA and Hg2+

2.7 探針對(duì)水樣中Hg2+的檢測(cè)

選取西河河水和實(shí)驗(yàn)室自來水為待測(cè)水樣，分別進(jìn)行1.0、5.0、10.0、15.0（×10-6mol/L）水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定5次。結(jié)果如表1所示，水樣中Hg2+的回收率為97.0%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.5%～2.5%。汞質(zhì)控樣的檢測(cè)結(jié)果在1倍偏差范圍。

表1 實(shí)際水樣中Hg2+的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and RSDs of Hg2+in different real water samples

為進(jìn)一步拓展探針COA 的應(yīng)用范圍，檢驗(yàn)其廢水處理能力，本研究選取某城鎮(zhèn)污水處理廠進(jìn)出口排放的廢水為樣品，分別采用COA 探針和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)原子熒光法［40］進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。由表可知，探針COA 的檢測(cè)結(jié)果與原子熒光法的檢測(cè)結(jié)果基本一致，表明探針COA 適用于不同類型水樣中Hg2+的定量檢測(cè)，且具有很高的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 COA探針和原子熒光法對(duì)廢水中Hg2+的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Table 2 Comparison of determination results of Hg2+ by COA fluorescence probe and atomic fluorescence spectrometry

3 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)合成了一種新型的基于香豆素的寡聚芳酰胺類熒光探針COA，該探針可高效識(shí)別Hg2+，且具有較強(qiáng)的抗干擾性和較好的可逆性。COA 探針可與Hg2+形成1∶1 配合物，IR 和1H NMR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)探針COA 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)是PET 過程中斷所致。該探針對(duì)Hg2+的檢出限為2.08×10-7mol/L，滿足世界衛(wèi)生組織對(duì)飲用水的最低允許濃度要求，也低于我國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838-2002）Ⅲ類水中Hg2+的標(biāo)準(zhǔn)限值。該探針適用于不同水樣中Hg2+的定量檢測(cè)，且準(zhǔn)確度和精密度較高，滿足水質(zhì)檢測(cè)相關(guān)要求。