改進(jìn)QuEChERS方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定藏茶中88種農(nóng)藥殘留

嚴(yán)曉賢，仝凱旋，朱浙輝，謝瑜杰，吳興強(qiáng)，常巧英，石志紅，范春林，陳 輝*

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.河北大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；3.西藏自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，西藏 拉薩 850000）

藏茶是一種黑茶，起源于唐朝，已有上千年歷史［1］。它是藏族人民的養(yǎng)生之茶，因獨(dú)特的口感和豐富的營養(yǎng)價(jià)值而受到廣泛歡迎。藏茶在種植過程中可能會(huì)過量使用農(nóng)藥來防治病蟲害，因此，農(nóng)藥殘留是影響藏茶“綠色健康”屬性的重要因素。針對茶葉中農(nóng)藥殘留安全問題，我國實(shí)行GB 2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［2］標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了106種農(nóng)藥在茶葉中的最大殘留限量（MRL），比2019 版增加了丁硫克百威、毒蟲畏、二溴磷、樂果、氯磺隆等41 種農(nóng)藥［3］。GB 2763.1-2022《食品中2，4-滴丁酸鈉鹽等112 種農(nóng)藥最大殘留限量》中，新增了馬拉硫磷、仲丁威等4 種農(nóng)藥在茶葉中的MRL［4］，為我國茶葉產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留監(jiān)管提供了依據(jù)。

目前，農(nóng)藥殘留的前處理方式主要有固相萃取［5］、QuEChERS［6-7］、分散液液微萃取［8］以及磁固相萃?。?］等技術(shù)。QuEChERS可根據(jù)不同基質(zhì)樣品選擇合適的凈化材料進(jìn)行凈化，從而降低干擾物對目標(biāo)分析物的干擾，提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。高堯華等［10］選用N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）和十八烷基鍵合硅膠（C18）填料對綠茶樣品進(jìn)行凈化，通過氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測綠茶中的35種農(nóng)藥。方俊蘭等［11］同樣使用PSA、GCB和C18填料對紅茶和綠茶樣品進(jìn)行凈化，通過超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對茶葉中的166 種農(nóng)藥進(jìn)行篩查。許芮菡等［12］利用多壁碳納米管（MWCNTs）為主的凈化填料對茶葉樣品進(jìn)行凈化，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。上述研究顯示出QuEChERS 方法在茶葉農(nóng)藥殘留分析中的重要應(yīng)用，同時(shí)也突出了不同吸附劑組合在凈化過程中的關(guān)鍵作用。

由于藏茶種植環(huán)境、加工工藝等條件與紅茶或綠茶存在較大差異，茶褐素等成分明顯高于普通茶葉［13-14］，增加了前處理凈化難度，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性造成較大影響。交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）吸附劑成本低，由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，能較好去除茶褐素、多酚和兒茶素等［15］。本文依據(jù)GB 2763-2021和GB 2763.1-2022標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)文獻(xiàn)［16-18］報(bào)道，以茶葉中88種風(fēng)險(xiǎn)較高農(nóng)藥為研究對象，采用以PVPP 為主的吸附材料作為QuEChERS 前處理方法的凈化劑，用于藏茶基質(zhì)凈化，建立了藏茶中88 種農(nóng)藥的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法已應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測，可為藏茶中農(nóng)藥殘留監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)防范提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀配有Xevo TQ-S cronos 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore 公司）；N-EVAP112 氮吹濃縮儀（美國Organomation Associates 公司）；SR-2DS 型水平振蕩器（日本TATEC 公司）；Allegra X-30R離心機(jī)（美國Becakmen Coulter 公司）；PL602-L電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

88 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（純度均大于98%，天津阿爾塔科技有限公司）；甲酸、甲酸銨（質(zhì)譜級，美國Agilent 公司）；乙腈、甲醇（色譜級，美國Thermo Fisher 公司）；乙酸、氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；GCB、C18、PSA（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

藏茶樣品購于西藏本地市場，將樣品放入粉碎機(jī)中粉碎，過425 μm的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，混勻后放入自封袋中，置于4 ℃冷藏備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將88種農(nóng)藥（質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL）分為Ⅰ組、Ⅱ組，精密移取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻后得到10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃避光保存。精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，配制成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

根據(jù)Huang 等［16］的前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，具體步驟為：精確稱取2 g 粉末狀藏茶（精確至±0.01 g）于50 mL 離心管中，加入2 mL 超純水后，渦旋30 s，靜置10 min。加入10 mL 的1%乙酸乙腈提取溶劑和鋯珠4顆，渦旋1 min。再加入2 g NaCl，渦旋30 s，振蕩5 min，離心（10000 r/min）5 min。取3 mL上清液至15 mL 離心管（含100 mg C18+200 mg PVPP+30 mg GCB）中，渦旋1 min，振蕩5 min，離心5 min（4 200 r/min）。取1 mL 上清液，加入10 mL 玻璃離心管中，40 ℃水浴氮吹至干后，用1 mL 乙腈-水溶液（體積比3∶2）超聲復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相：A為0.01%甲酸水溶液（含2 mmol/L甲酸銨），B為0.01%甲酸甲醇。梯度洗脫程序：0～1.5 min，2% B；1.5～2 min，2%～10% B；2～6 min，10%～80% B；6～7 min，80%～90% B；7～10.5 min，90% B；10.5～11 min，90%～70% B；11～12.5 min，70%～2% B；12.5～15 min，2% B；流速：0.3 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源：正離子掃描（ESI+），離子源溫度：150 ℃；電噴霧電壓：2.0 kV；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測。

由此對照當(dāng)代個(gè)別忘記了初心、高高在上的官員，會(huì)發(fā)現(xiàn)他們太把自己當(dāng)回事兒了。比如新聞里曝光過的“史上最牛環(huán)保局長”福建省長樂市環(huán)保局原局長陳桂光接到記者詢問的電話說：“你也不要打我電話，一打就打局長，局長很不值錢是不是……你隨便的一個(gè)群眾就打我電話……”記者問：“一般群眾不能給你打電話是嗎？”局長說：“當(dāng)然不能打電話，我電話為什么要讓你打……”此局長官員群眾界限分明，群眾連打他的電話都不能，更何談讓這樣的官員到群眾中去，乃至讓他愛民如子！

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度為50 μg/L的88種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在MS Scan模式下分別對農(nóng)藥進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，通過優(yōu)化錐孔電壓獲得每種農(nóng)藥具有最高響應(yīng)信號的母離子。在Daughter Scan 模式下對母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，優(yōu)化碰撞能量，選擇響應(yīng)信號最強(qiáng)的兩個(gè)子離子分別作為定量離子和定性離子。88種農(nóng)藥的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 88種農(nóng)藥的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometry parameters of 88 pesticides

（續(xù)表1）

2.2 流動(dòng)相的選擇

以0.01%甲酸水溶液（含2 mmol/L 甲酸銨）為水相，考察了甲醇和乙腈兩種體系對目標(biāo)農(nóng)藥響應(yīng)值與峰形的影響，結(jié)果表明，相較于乙腈，選用甲醇能提高加氫峰母離子農(nóng)藥或加銨峰母離子農(nóng)藥的響應(yīng)值。在正離子掃描模式下，加入少量甲酸和甲酸銨能促進(jìn)目標(biāo)化合物離子化，提高化合物的質(zhì)譜峰響應(yīng)［19］。對比了0.01%甲酸水溶液（含2 mmol/L甲酸銨）-0.01%甲酸甲醇、0.01%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）-0.01%甲酸甲醇、0.05%甲酸水溶液（含2 mmol/L甲酸銨）-0.05%甲酸甲醇、0.1%甲酸水溶液（含2 mmol/L甲酸銨）-0.1%甲酸甲醇4 組流動(dòng)相對目標(biāo)農(nóng)藥峰形和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)和甲酸銨濃度的增加，特丁硫磷、甲萘威、三唑酮等農(nóng)藥的響應(yīng)值呈先升后降趨勢。當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.01%，甲酸銨濃度為2 mmol/L 時(shí)，目標(biāo)農(nóng)藥的響應(yīng)值和峰形達(dá)到最優(yōu)，因此選用0.01%甲酸水溶液（含2 mmol/L 甲酸銨）-0.01%甲酸甲醇作為流動(dòng)相。88 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL）的總離子流圖（TIC）見圖1。

圖1 88種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）的總離子流圖Fig.1 TIC of 88 pesticides mixed standard solution（100 μg/mL）

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 水化體積的優(yōu)化藏茶屬于干燥樣品，因此在樣品提取前加入少量水浸潤，可以有效提高目標(biāo)化合物的提取效率，獲得較好的回收效果。在50 μg/kg 加標(biāo)水平下，考察了分別加入0、1、2、3、4 mL 水時(shí)對目標(biāo)農(nóng)藥回收率的影響（圖2）。結(jié)果表明，在不加水的情況下，雖然提取溶液中色素等雜質(zhì)較少，但僅有60種目標(biāo)農(nóng)藥的回收率在70% ～120%。加水量過多時(shí)，可能因提取基質(zhì)更多，導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)較大，回收率在70% ～120%之間的目標(biāo)農(nóng)藥減少。當(dāng)加水量為2 mL時(shí)，回收率在70% ～120%條件的目標(biāo)農(nóng)藥數(shù)量最多。因此，本文選用2 mL加水量作為最優(yōu)水化體積。

圖2 不同水化體積對農(nóng)藥回收率和滿足要求農(nóng)藥數(shù)量的影響Fig.2 Effect of different hydration volumes on recoveries and the amount of pesticides meeting requirements

2.3.2 提取溶劑的優(yōu)化分別考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑對藏茶中目標(biāo)農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果表明，相較于甲醇和乙酸乙酯，乙腈作為提取溶劑時(shí)的殘留雜質(zhì)較少，回收率在70%～120%之間的目標(biāo)農(nóng)藥數(shù)量最多（圖3）。由于敵敵畏、樂果等在堿性環(huán)境中較為敏感，且易分解，需在乙腈溶劑中加入適量乙酸調(diào)節(jié)溶液的pH 值。因此，考察了1%乙酸乙腈、2%乙酸乙腈、4%乙酸乙腈對藏茶中目標(biāo)農(nóng)藥的提取效率（圖3）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于乙腈，使用1%乙酸乙腈作為提取溶劑時(shí)，烯啶蟲胺、甲拌磷、苯線磷等60 種目標(biāo)農(nóng)藥的回收率增加。隨著酸度的增加，回收率在70%～120%之間的農(nóng)藥數(shù)量基本相同，但有68 種農(nóng)藥的響應(yīng)明顯降低。本研究選擇1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對滿足要求農(nóng)藥數(shù)量的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on the amount of pesticides meeting requirements

2.3.3 萃取鹽的優(yōu)化考察了1 g NaCl、2 g NaCl、3 g NaCl、2 g NaCl+4 g MgSO4共4 種不同加入量的萃取鹽對藏茶中農(nóng)藥回收率及滿足要求農(nóng)藥數(shù)量的影響。結(jié)果顯示（圖4），采用上述萃取鹽時(shí)滿足回收率在70%～120%之間的農(nóng)藥數(shù)量分別為79、86、82、85種，其中加入2 g NaCl 時(shí)的提取和分離效果優(yōu)于1 g NaCl 和3 g NaCl，加入2 g NaCl+4 g MgSO4時(shí)滿足回收率要求的農(nóng)藥數(shù)量和平均回收率與加入2 g NaCl 基本相同?？紤]綠色環(huán)保與節(jié)省成本，本研究選擇2 g NaCl進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖4 不同加入量的萃取鹽對農(nóng)藥回收率和滿足要求農(nóng)藥數(shù)量的影響Fig.4 Effect of different additions of extraction salts on recovery and the amount of pesticides meeting requirements

2.3.4 凈化填料的優(yōu)化常用的吸附劑填料PSA、C18、GCB 能有效去除藏茶中的有機(jī)酸、糖類、脂肪、色素等物質(zhì)，PVPP可去除多酚、茶褐素等物質(zhì)。因此，選用PSA、C18、GCB、PVPP對樣品進(jìn)行凈化處理。

在50 μg/kg 加標(biāo)水平下，考察了5 種不同組合的吸附劑填料：150 mg PSA+150 mg C18+30 mg GCB+150 mg PVPP（A）、150 mg C18+30 mg GCB+150 mg PVPP（B）、150 mg C18+30 mg GCB（C）、30 mg GCB+150 mg PVPP（D）、150 mg C18+150 mg PVPP（E）對目標(biāo)農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果表明（圖5），采用A、B 組時(shí)目標(biāo)農(nóng)藥回收率在70%～120%范圍內(nèi)的數(shù)量基本一致，盡管PVPP與PSA對茶葉基質(zhì)中極性干擾化合物的減少程度近似［20］，但考慮成本原因，后續(xù)使用更為廉價(jià)的PVPP作為凈化填料。B 組相較于C 組，有97.72%目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)下降，且C組目標(biāo)農(nóng)藥回收率在70%～120%范圍內(nèi)的數(shù)量低于其余4組，證明加入PVPP 能有效降低基質(zhì)效應(yīng)，提高農(nóng)藥的回收率。D 組相較于B 組，克百威、仲丁威、地蟲硫磷、三唑酮、敵敵畏的回收率均大于120%，滅線磷、甲基異柳磷、氯噻啉等農(nóng)藥的回收率增至115% ～120%之間，證明加入C18能有效吸附藏茶基質(zhì)中的雜質(zhì)。與E 組對比，B 組中低基質(zhì)效應(yīng)的農(nóng)藥數(shù)量占比比E 組多7%，說明GCB 的加入可以明顯凈化色素，降低基質(zhì)干擾。最終選用C18、PVPP和GCB吸附劑進(jìn)行優(yōu)化。

圖5 B組對比于C組的基質(zhì)效應(yīng)降幅程度和不同吸附劑組合對滿足要求農(nóng)藥數(shù)量的影響Fig.5 Reduction degree of matrix effect in group B versus group C and the effect of different adsorbent combinations on the number of pesticides meeting the requirements

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）通常在樣品離子化過程中出現(xiàn)，會(huì)影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，主要表現(xiàn)為基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)［21］。計(jì)算公式為：ME（%）=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1）×100%，當(dāng)|ME|≤20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；20%＜|ME|≤50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＞50%時(shí)為較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)［22］。

藏茶中基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)中組分和共提取物易干擾目標(biāo)農(nóng)藥離子，導(dǎo)致離子增強(qiáng)或抑制。本文通過測定基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5、1、2、5、10、50、100、200、500、1000 μg/kg）和對應(yīng)的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1、0.2、0.4、1、2、10、20、40、100、200 μg/L），建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算ME。結(jié)果表明，藏茶基質(zhì)中54.5%的目標(biāo)物農(nóng)藥屬于中等和弱基質(zhì)效應(yīng)。為避免基質(zhì)干擾，通過基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法降低基質(zhì)對目標(biāo)農(nóng)藥的影響。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限根據(jù)前述的樣品前處理方法，以空白藏茶樣品制備一系列不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）分別確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。結(jié)果表明，所有目標(biāo)農(nóng)藥在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9990～0.9999；LOD 和LOQ 分別為0.15～3 μg/kg 和0.5～10 μg/kg，除特丁硫磷外，其余農(nóng)藥的LOQ均小于10 μg/kg（表2）。

表2 藏茶中農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，LODs，LOQs，recoveries and relative standard deviations of pesticides in Tibetan tea

2.5.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差選用空白藏茶樣品，分別添加1、2、10倍LOQ濃度水平的88種目標(biāo)農(nóng)藥，進(jìn)行空白加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，藏茶樣品中88 種農(nóng)藥在上述加標(biāo)水平下的回收率分別為73.2%～108%、73.2%～109%、72.5%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不大于12%（表2），該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足農(nóng)藥多殘留檢測要求。

(續(xù)表2)

2.6 實(shí)際樣品檢測

采用本方法對12 份市售藏茶樣品進(jìn)行檢測，共檢出28 種農(nóng)藥，檢出頻次最多的農(nóng)藥主要有啶蟲脒、聯(lián)苯菊酯、噻嗪酮、多菌靈、毒死蜱、噻蟲胺、吡蟲啉等（見表3）。其中檢出頻次最多農(nóng)藥多菌靈及超標(biāo)農(nóng)藥吡蟲啉的MRM 圖和二級質(zhì)譜圖如圖6 和圖7 所示。有6 種檢出農(nóng)藥在GB 2763-2021 和GB 2763.1-2022中未規(guī)定MRL，分別為氯蟲苯甲酰胺、敵敵畏、丙環(huán)唑、戊唑醇、三唑醇、甲硫威及其代謝物，表明在藏茶種植過程中存在超范圍使用農(nóng)藥的情況；有4 批次樣品中吡蟲啉超過限量值，其余檢出農(nóng)藥的殘留量均低于MRL。

圖6 多菌靈的MRM色譜圖（A）與二級質(zhì)譜圖（B）Fig.6 MRM chromatograms（A） and secondary mass spectrum（B） of carbendazim

圖7 吡蟲啉的MRM色譜圖（A）和二級質(zhì)譜圖（B）Fig.7 MRM chromatograms（A） and secondary mass spectrum（B） of imidacloprid

表3 藏茶實(shí)際樣品中農(nóng)藥檢出結(jié)果Table 3 Detection results of 88 pesticides in actual samples of Tibetan tea

3 結(jié) 論

本文采用改進(jìn)的QuEChERS 結(jié)合UPLC-MS/MS 分析技術(shù)，建立了藏茶中88 種農(nóng)藥的快速檢測方法，使用成本更低的PVPP 代替PSA，與C18、GCB 組合對樣品進(jìn)行凈化，降低了樣品前處理成本，并在最優(yōu)條件下對藏茶樣品進(jìn)行檢測。該方法具有較好的靈敏度、高效性以及適用性，滿足農(nóng)藥多殘留檢測技術(shù)要求，可彌補(bǔ)藏茶中農(nóng)藥殘留檢測方法的空白，為藏茶農(nóng)藥殘留監(jiān)測和質(zhì)量安全提供了重要的技術(shù)和數(shù)據(jù)支持。