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    氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備及在細(xì)胞溫度傳感中的應(yīng)用

    2024-04-23 17:14:26陳雨昕胡月芳
    分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2024年4期
    關(guān)鍵詞:生物質(zhì)波長(zhǎng)電化學(xué)

    陳雨昕,胡月芳

    (1.賀州學(xué)院 廣西碳酸鈣資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 材料與化學(xué)工程學(xué)院,廣西 賀州 542899;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院,廣西 南寧 530000)

    熒光碳點(diǎn)(CDs)主要包含碳量子點(diǎn)(CQDs)、石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)以及聚合物點(diǎn)(PDs)等類型[1-2]。CQDs 具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、優(yōu)異的生物相容性、良好的水溶性及優(yōu)異的光電性能[3-5],已發(fā)展成為一類深受歡迎的新型碳納米材料,是納米技術(shù)領(lǐng)域中最為活躍的研究課題之一。近年來,CQDs已在環(huán)境監(jiān)測(cè)[6]、光催化[7]、熒光檢測(cè)[8]及生物成像等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。隨著低碳環(huán)保理念的推廣,綠色化學(xué)也成為碳納米材料研究的一個(gè)趨勢(shì),研究者們?cè)絹碓綗嶂杂诶贸R姷纳镔|(zhì)資源,基于一些簡(jiǎn)便、綠色、高效的方法合成生物質(zhì)碳量子點(diǎn)(BCQDs)。與其他碳源相比,綠色生態(tài)友好的生物質(zhì)碳源不僅具有價(jià)格低廉、獲取方便及來源廣泛等優(yōu)點(diǎn),還因含有多種元素,使得制備時(shí)不需添加外部雜原子即可得到各種性能優(yōu)異的氮自摻雜碳量子點(diǎn)(N-CQDs)[9]。此外,采用生物質(zhì)制備碳量子點(diǎn)還可使低價(jià)值的生物質(zhì)廢棄物轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的材料,實(shí)現(xiàn)變廢為寶,符合資源再利用的綠色低碳環(huán)保主旨。近年來,各種生物質(zhì)包括枇杷葉[10]、桂花籽皮[11]、綠蘿葉[12]、黃豆[13]、韭菜[14]等已被用作碳源來制備系列生物質(zhì)CQDs。

    溫度是生命體最基本的參數(shù)之一,對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的酶活性、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂和能量代謝等生化反應(yīng)具有很大的影響[15]。在一些基于熱效應(yīng)治療腫瘤的方法中,探究細(xì)胞內(nèi)的溫度分布及胞內(nèi)區(qū)域溫度變化,是評(píng)估腫瘤治療效果的重要生理參數(shù)指標(biāo)[16]。因此,對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)溫度的高分辨率、高靈敏度測(cè)量,是一項(xiàng)非常有意義的研究工作。傳統(tǒng)的溫度測(cè)量方法通常是通過物體某些隨溫度變化的特征進(jìn)行間接測(cè)量,比較常見的檢測(cè)工具有水銀溫度計(jì)、耳溫儀及熱電偶等[17]。但這些檢測(cè)方法響應(yīng)速度慢,不能靈敏反映溫度的變化,且不能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞體內(nèi)的溫度測(cè)量,故在生物領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。據(jù)報(bào)道,碳量子點(diǎn)表面狀態(tài)(缺陷和陷阱)的非輻射通道會(huì)受到溫度的影響,溫度升高會(huì)激活更多的非輻射通道,使更多的激發(fā)態(tài)電子通過非輻射過程返回到基態(tài),導(dǎo)致碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度減弱,故碳量子點(diǎn)具有作為溫度傳感器的極大潛能[18]。

    本研究以西紅柿為碳源和氮源,采用微波合成法在最佳合成條件下制備得到N-CQDs,對(duì)其形貌、結(jié)構(gòu)、光電性能和溫敏性能進(jìn)行分析,考察了所合成N-CQDs 的毒性和生物相容性,并將其作為熒光納米探針應(yīng)用于細(xì)胞溫度傳感的研究,探討了基于其開發(fā)細(xì)胞無損測(cè)量納米溫度計(jì)的可行性。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    Tecnai G2 F20 S-TWIN 型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM,荷蘭Philips公司);Tecnai G2 F20 S-TWIN型X 射線光電子能譜儀(XPS,荷蘭Philips 公司);Perkin Elmer Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR,珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司);LS45 型熒光分光光度計(jì)(美國(guó)Agilent Technologies 公司);X-5 型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);CHI660e 型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司,鉑絲電極為對(duì)電極,飽和銀-氯化銀電極為參比電極,玻碳電極(GCE)為工作電極);RA8恒溫循環(huán)器(德國(guó)LAUDA公司);Zeiss LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)。

    小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)(上海林克生物科技有限公司);胎牛血清(FBS)、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰酶、青霉素-鏈霉素和MTT(美國(guó)Sigma 公司);氯化鈉(NaCl)和殼聚糖(C6H11NO4)n(天津市福晨化學(xué)試劑廠);氧化鋁(Al2O3)、葡萄糖(C6H12O6·H2O)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、十二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·12H2O)和二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)(西隴化工股份有限公司)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)所使用的CQDs為課題組自制。

    1.2 N-CQDs的制備

    通過對(duì)合成時(shí)間(3、6、8、10、12 min)、合成溫度(高火、中高火、中火)進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳合成時(shí)間為8 min、最佳合成溫度為中高火。具體步驟如下:將新鮮的西紅柿用去離子水洗凈榨汁,取5 g 西紅柿汁(30 mL)置于微波爐中高火加熱8 min,直到紅色液體變?yōu)樽睾谏镔|(zhì),將該物質(zhì)進(jìn)行研磨,加適量去離子水溶解后離心30 min(4 000 r/min),收集上層棕色混合液。再將收集到的棕色混合物置于透析膜(截留分子量1 000)中在去離子水中透析72 h(每間隔3~4 h 換一次水),可得深黃色N-CQDs 透析液,于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 N-CQDs的表征

    N-CQDs的形態(tài)和功能基團(tuán)及其分子結(jié)構(gòu)由TEM、XPS、FT-IR 進(jìn)行表征;光學(xué)性質(zhì)用熒光分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)和紫外燈進(jìn)行研究。

    1.4 熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定

    以含0.1 mol·L-1H2SO4溶液的硫酸奎寧作為標(biāo)準(zhǔn)參考物[19],采用公式(1)計(jì)算N-CQDs 溶液的熒光量子產(chǎn)率(Q)。

    式中,Q、QR分別為N-CQDs和標(biāo)準(zhǔn)參考物的熒光量子產(chǎn)率;A和AR為兩者在365 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的紫外吸光度;I和IR為該激發(fā)波長(zhǎng)下N-CQDs和標(biāo)準(zhǔn)參考物的熒光峰面積;η和ηR為對(duì)應(yīng)的折光系數(shù)。

    1.5 N-CQDs穩(wěn)定性研究

    實(shí)驗(yàn)考察了NaCl 濃度對(duì)N-CQDs 熒光強(qiáng)度的影響[20]。配制濃度為30、60、90、120、150、180、210 mmol/L 的NaCl 溶液,分別取1 mL NaCl 溶液與1 mL 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的N-CQDs 等體積混合,將混合液置于5 mL比色皿中,在376 nm激發(fā)波長(zhǎng)和440 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量熒光強(qiáng)度。

    同時(shí)考察了不同pH 值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響[21]。分別取1 mL 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的N-CQDs 與2 mL PBS 緩沖溶液混合,將混合液置于5 mL比色皿中,于376 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

    1.6 N-CQDs電化學(xué)性能的研究

    用砂紙打磨GCE,去除其表面的氧化膜,先后使用0.3 μm 和0.05 μm 的氧化鋁粉末反復(fù)打磨拋光,并使用乙醇和去離子水超聲清洗,烘干備用。將3 mg CQDs或N-CQDs倒入1 mL殼聚糖溶液(5 mg/L)中制備混合液,取一滴該混合液滴至GCE表面,低溫烘干,制備得到CQDs或N-CQDs修飾的GCE。

    將修飾好的CQDs/GCE 和N-CQDs/GCE 置于1 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(摩爾比1∶1)和0.1 mol/L PBS(pH 7.5)的混合溶液中,進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描;置于5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(摩爾比1∶1)和0.5 mol/L KNO3的混合溶液中,進(jìn)行電化學(xué)阻抗(EIS)掃描。

    1.7 N-CQDs溫敏性能分析

    使用恒溫水循環(huán)器連接熒光分光光度計(jì)進(jìn)行樣品溫度控制,通過外接恒溫系統(tǒng)對(duì)N-CQDs 納米顆粒水溶液進(jìn)行加熱,分別測(cè)定其在不同溫度下的熒光光譜。

    1.8 細(xì)胞毒性及細(xì)胞傳感性能研究

    用MTT 法進(jìn)行N-CQDs 生物毒性研究。在7 個(gè)培養(yǎng)皿中分別添加0、100、150、200、250、300、350 μg/mL 的N-CQDs溶液,隨后加入20 μL 20% MTT 溶液孵育16 h。向各培養(yǎng)皿中加入100 μL二甲亞砜,反應(yīng)15 min。將培養(yǎng)皿置于570 nm 的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定儀中進(jìn)行光學(xué)測(cè)量,考察N-CQDs 的生物毒性。

    用胰酶消化4T1 細(xì)胞,然后將細(xì)胞懸浮液接種至4 個(gè)35 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,并置于CO2含量為5%、溫度37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后將4 個(gè)培養(yǎng)皿中的4T1 細(xì)胞與10 μg/mL N-CQDs 及高糖細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃下孵育2 h。使用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次,并通過外接恒溫系統(tǒng)緩慢加熱(注意控制細(xì)胞的原位溫度),使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形貌。檢測(cè)之前,將設(shè)置溫度點(diǎn)(20、30、40、50、60 ℃)平衡5 min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 N-CQDs結(jié)構(gòu)及組成

    利用TEM、FT-IR 等手段對(duì)N-CQDs 的粒徑分布、表面成分組成等進(jìn)行研究。從圖1A 可以看出,合成的碳點(diǎn)為較均一的顆粒球形小圓點(diǎn),分散性良好,平均粒徑約3.4 nm。由FT-IR 可知,1 638 cm-1處為C=C 鍵的伸縮振動(dòng),1 886 cm-1處為C=O 的彎曲振動(dòng),3 306 cm-1處為O—H 鍵的彎曲振動(dòng)(圖1B)。該結(jié)果表明N-CQDs表面存在大量的羧基和羥基等親水基團(tuán),具有良好的水溶性[22]。

    采用XPS 考察N-CQDs 的表面元素構(gòu)成,結(jié)果顯示,N-CQDs 全譜圖(圖2A)中531.9、399.9、284.9 eV 處的峰分別對(duì)應(yīng)O1s、N1s和C1s 3 個(gè)特征峰[23],說明該西紅柿碳量子點(diǎn)的主要組成元素為C、N 和O。元素含量分析結(jié)果表明,該N 自摻雜CQDs 中C、N、O 的相對(duì)元素百分含量分別為65.24%、1.48%和30.28%。圖2B為C1s的XPS高分辨圖譜,其在286.4 eV和284.8 eV處出現(xiàn)的兩個(gè)發(fā)射峰分別歸屬為C—O 和C=C/C—C 鍵[24];圖2C 為N1s 的XPS 高分辨圖譜,其在399.5 eV 和403.0 eV 處的兩個(gè)發(fā)射峰分別歸屬為C—N—C 和C—N 鍵;O1s 的XPS 高分辨圖譜(圖2D)在531.8 eV 和532.9 eV 處的兩個(gè)擬合峰分別歸屬為O=C 和C—O 鍵[25]。XPS 測(cè)定結(jié)果表明該碳量子點(diǎn)為氮摻雜碳量子點(diǎn),產(chǎn)率為44.9%,經(jīng)式(1)計(jì)算可得到N—CQDs的量子產(chǎn)率為18.9%。

    圖2 N-CQDs的XPS全譜圖(A),C1s分譜(B),N1s分譜(C),O1s分譜(D)Fig.2 XPS full spectrum(A),C1s spectrum(B),N1s spectrum(C),O1s spectrum(D) of N-CQDs

    圖3 為N-CQDs 的XRD 圖,其在22.3°處的寬衍射峰為無定形碳結(jié)構(gòu)的(002)晶面[26],說明所合成的量子點(diǎn)為無定形結(jié)構(gòu)。

    圖3 N-CQDs的XRD圖Fig.3 XRD pattern of N-CQDs

    2.2 N-CQDs光學(xué)性能分析

    N-CQDs 內(nèi)部的π-π*電子躍遷[27]使得其在波長(zhǎng)284 nm 處出現(xiàn)UV-Vis 吸收峰(圖4A);由圖4B 可知,N-CQDs的最大激發(fā)和發(fā)射峰分別位于380 nm和453 nm。N-CQDs(10 μg/mL)在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜如圖4C所示,結(jié)果表明,隨著激發(fā)波長(zhǎng)由360 nm增加至460 nm,N-CQDs的熒光發(fā)射峰發(fā)生紅移,表現(xiàn)出明顯的激發(fā)波長(zhǎng)依賴性。N-CQDs 的激發(fā)波長(zhǎng)依賴現(xiàn)象,可能因其發(fā)射位置和顆粒大小差異所致[28]。圖4D 為N-CQDs 溶液在自然光和紫外燈光下的照射效果比對(duì)圖,在紫外燈下N-CQDs 溶液發(fā)射出明亮的藍(lán)光。

    圖4 N-CQDs的UV-Vis圖(A),N-CQDs的最大激發(fā)和最大發(fā)射波長(zhǎng)圖譜(B),N-CQDs在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜圖(C),N-CQDs在自然光(左)和紫外燈(右)下的發(fā)光圖(D)Fig.4 UV-Vis spectrum(A) and spectra of maximum excitation and maximum emission wavelength(B) of N-CQDs,emission fluorescence spectra of N-CQDs at different excitation wavelengths(C),diagrams of N-CQDs under natural light(left) and ultraviolet lamp(right) exposure(D)

    2.3 N-CQDs熒光穩(wěn)定性分析

    考察了10 μg/mL 的N-CQDs 在不同NaCl 濃度和pH 值下的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NCQDs 溶液的熒光強(qiáng)度在不同濃度NaCl 溶液和不同pH值的酸堿性溶液中均保持較穩(wěn)定的狀態(tài),表明N-CQDs具有優(yōu)異的耐鹽性和熒光穩(wěn)定性。

    2.4 N-CQDs電化學(xué)性能分析

    碳量子點(diǎn)的電化學(xué)性能也會(huì)對(duì)其細(xì)胞溫度熒光傳感性能產(chǎn)生較大的影響,如當(dāng)量子點(diǎn)的電荷狀態(tài)發(fā)生變化時(shí),其熒光強(qiáng)度、熒光壽命及熒光波長(zhǎng)均將發(fā)生變化,從而影響細(xì)胞溫度熒光傳感的準(zhǔn)確性與精密性。因此,在制備細(xì)胞溫度熒光傳感器時(shí),也需要對(duì)碳量子點(diǎn)的電化學(xué)性能進(jìn)行優(yōu)化。

    采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗法分析N-CQDs的電化學(xué)性能,并以CQDs作為對(duì)照。如圖5A所示,CQDs和N-CQDs修飾的GCE的CV曲線均出現(xiàn)閉合的氧化還原峰。CQDs修飾的GCE的氧化峰和還原峰對(duì)稱性稍差,是準(zhǔn)可逆過程;而N-CQDs修飾的GCE的CV曲線中的還原峰和氧化峰比較對(duì)稱,表明在電極表面發(fā)生了反應(yīng)速率較快的可逆過程。原因可能是,相比CQDs,N-CQDs 表面所含的基團(tuán)較豐富,使得電極表面的電活性面積增大,電流的運(yùn)輸能力提高。CV圖譜結(jié)果表明,N-CQDs具有比CQDs更為優(yōu)異的光電性能。

    圖5 CQDs、N-CQDs修飾玻碳電極的CV圖譜(A)及裸電極、CQDs、N-CQDs修飾電極的EIS圖譜(B)Fig.5 CV diagrams of CQDs and N-CQDs modified GCE(A) and EIS diagrams of bare GCE,CQDs and N-CQDs modified GCE(B)

    電化學(xué)阻抗法也被用于考察N-CQDs修飾的GCE的電化學(xué)性能,如圖5B所示,裸GCE的電化學(xué)阻抗非常小,修飾CQDs后電化學(xué)阻抗得到明顯增強(qiáng);而N-CQDs修飾的GCE的電化學(xué)阻抗增強(qiáng)更大,即N-CQDs修飾的GCE電極的電化學(xué)性能更為優(yōu)異。

    2.5 N-CQDs溫敏性能分析

    考察了溫度(25~65 ℃)對(duì)N-CQDs 熒光強(qiáng)度的影響。如圖6A 所示,隨著溫度的升高,N-CQDs 的熒光強(qiáng)度明顯降低,65 ℃時(shí)N-CQDs 的相對(duì)熒光強(qiáng)度猝滅了51%;當(dāng)溫度從65 ℃降回25 ℃時(shí),NCQDs 的熒光強(qiáng)度逐漸得到恢復(fù)。在25~65 ℃范圍內(nèi),N-CQDs 的熒光強(qiáng)度(IF)與溫度(t)呈良好的線性關(guān)系(圖6B),線性方程為IF=1296.54-14.95t,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.998 7。結(jié)果表明,在25~65 ℃范圍內(nèi),N-CQDs的熒光強(qiáng)度顯示出良好的可逆性,在該范圍內(nèi)的溫度變化不會(huì)對(duì)N-CQDs表面的熒光結(jié)構(gòu)造成永久性破壞。N-CQDs的熒光強(qiáng)度隨著溫度升高而減弱的現(xiàn)象可能是由于溫度升高使N-CQDs發(fā)生聚集引起了明顯的熒光猝滅[28]。N-CQDs 的熒光強(qiáng)度隨溫度的升高呈線性下降,表明N-CQDs 具有優(yōu)異的溫敏性能,有望開發(fā)成溫度傳感器。

    圖6 溫度對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響(A)及N-CQDs熒光強(qiáng)度與溫度的線性關(guān)系(B)Fig.6 Effect of temperature on fluorescence intensity of N-CQDs(A) and linear relationship between fluorescence intensity of N-CQDs and temperature(B)

    2.6 N-CQDs細(xì)胞毒性分析

    采用MTT 法測(cè)定了不同質(zhì)量濃度的N-CQDs 對(duì)4T1 細(xì)胞的毒性。從圖7 可知,將不同質(zhì)量濃度的NCQDs 與4T1 細(xì)胞共孵育后,后者仍呈現(xiàn)出良好的細(xì)胞活性,當(dāng)N-CQDs為350 μg/mL時(shí),細(xì)胞活性為原來的94.2%。結(jié)果表明該N-CQDs的細(xì)胞毒性幾乎可以忽略不計(jì),具有良好的生物相容性,在活細(xì)胞成像領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

    圖7 不同質(zhì)量濃度N-CQDs下細(xì)胞毒性測(cè)試Fig.7 Cytotoxicity test in the presence of N-CQDs at different mass concentrations

    2.7 N-CQDs的細(xì)胞溫度傳感性能分析

    從圖8A 可以看出,N-CQDs 孵育的4T1 細(xì)胞在紫外光激發(fā)下發(fā)出明亮的藍(lán)光,證明N-CQDs 具有良好的細(xì)胞膜穿透性,可用于細(xì)胞成像。圖8A~E 顯示,當(dāng)從25 ℃緩慢加熱至65 ℃時(shí),N-CQDs 的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。從細(xì)胞明場(chǎng)圖片(圖8F)可以看出,細(xì)胞和N-CQDs 孵育后發(fā)育良好,未出現(xiàn)明顯損傷,說明該N-CQDs 對(duì)細(xì)胞的毒理性低,通過對(duì)比細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,即可得到細(xì)胞的溫度變化信息,所制備的N-CQDs有望用于活細(xì)胞溫度的探測(cè)及成像。

    圖8 N-CQDs孵育的4T1細(xì)胞在不同溫度下的共聚焦顯微鏡圖Fig.8 Confocal microscopy imagings of 4T1 cells incubated with N-CQDs at different temperatures

    3 結(jié) 論

    本研究以生物質(zhì)西紅柿為原材料,通過微波法制備得到熒光強(qiáng)度強(qiáng)、水溶性穩(wěn)定的氮自摻雜碳量子點(diǎn)N-CQDs。TEM、UV-Vis、FT-IR、XPS、熒光、電化學(xué)分析結(jié)果顯示,N-CQDs 表面富含羥基、羧基等親水基團(tuán),有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,光學(xué)性能優(yōu)良,電化學(xué)性能優(yōu)異,具有良好的溫度傳感性能及生物相容性,可應(yīng)用于活細(xì)胞的溫度探測(cè)及成像,在溫度響應(yīng)的熒光傳感生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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