HPLC-RID法測定不同廠家益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量?

王秋萍 楊邦祝 宋善敏 甘夢蘭 李滿香 何珺 雷陽（81）

摘要：建立了測定益母草中鹽酸水蘇堿含量的HPLC-RID方法，并測定分析了14家藥廠的益母草中鹽酸水蘇堿的含量。結(jié)果表明：以Mercury益母草專用柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以70%乙腈溶液為流動相、流速1.0 mL/min、柱溫45℃的條件下采用示差檢測器進行檢測，鹽酸水蘇堿在0.100～0.523 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；回歸方程為y=91 519 x+1 342.2 （R2=0.991 6），平均回收率100.07 %，RSD為0.71 %，且該方法具有重復(fù)性好、操作簡便、快速、穩(wěn)定、易于普及等優(yōu)點；各廠家的益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量差異較大，14家廠家中僅有1367和8656這2家的益母草藥材符合藥典標(biāo)準(zhǔn)；鹽酸水蘇堿含量與益母草藥材性狀具有關(guān)聯(lián)性，市民、藥企和中藥商等在購買益母草藥材時，建議選擇性狀為葉多、青綠、莖細的益母草藥材。

關(guān)鍵詞： 益母草；鹽酸水蘇堿； HPLC-RID；不同廠家；藥材性狀

中圖分類號：S567.2; R917文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2024）02-0081-04

Determination of Stachydrine Hydrochloride in Leonuri Herba from Different

Manufacturers by HPLC-RID

WANG Qiu-ping1，2，YANG Bang-zhu1，SONG Shan-min1，GAN Meng-lan1，LI Man-xiang1，HE Jun2，LEI Yang1

（1. Guizhou Vocational College of Agriculture， Qingzhen 551400， PRC;

2. Guizhou Provincial Biochemical Engineering Center， Guizhou University， Guiyang 550025， PRC）

Abstract： A HPLC-RID method was established to determine the content of stachydrine hydrochloride in Leonuri Herba， and then the content of stachydrine hydrochloride in the Leonuri Herba samples from 14 manufacturers was determined. The results indicated that the content of stachydrine hydrochloride demonstrated a good linear relationship within the range of 0.100–0.523 mg/mL using the differential detector with the Mercury column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）， mobile phase of 70：30 acetonitrile-water solution， flow rate of 1.0 mL/min， and column temperature of 45℃. The regression equation was y=91 519 x+1 342.2 （R2=0.991 6）， and the average recovery rate was 100.07% （RSD of 0.71%）. The established HPLC-RID method was characterized by good repeatability， simple operation， rapid determination with stable results， and easy popularization. The content of stachydrine hydrochloride varied significantly among samples from different manufacturers， and only the samples from manufacturers 1367 and 8656 met the standards in the Chinese Pharmacopoeia. The content of stachydrine hydrochloride was associated with the medicinal characteristics of Leonuri Herba. According to the results， we suggested that users， pharmaceutical enterprises， and Chinese medicine manufacturers chose the Leonuri Herba materials with rich green leaves and fine stems.

Key words： Leonuri Herba; stachydrine hydrochloride; HPLC-RID; different manufacturers; medicinal characteristics

益母草（Leonurus japonicus Houtt.）為唇形科益母草屬植物的新鮮或干燥地上部分，別名益母艾、野麻、坤草等，全國大部分地區(qū)均有種植[1]。益母草中主要有效成分為益母草堿和鹽酸水蘇堿[2]。藥理作用研究表明，益母草中的生物堿具有顯著的興奮子宮、鎮(zhèn)痛抗炎、改善血液流變學(xué)、抗血栓等多種藥理活性[3-5]，為治療月經(jīng)不調(diào)、胎漏難產(chǎn)、產(chǎn)后惡露不盡、瘀血腹痛等婦科病及抗心肌缺血臨床治療的常用良藥[6-8]。目前市面上以益母草為單一原料制成有糖型或無糖型益母草顆粒的國藥準(zhǔn)字號廠家多達185家，益母草原藥材中鹽酸水蘇堿的含量檢測是益母草顆粒生產(chǎn)中的必要步驟。由于各廠家生產(chǎn)的益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量的差異，臨床和藥理試驗發(fā)現(xiàn)，有病人在服用常規(guī)或過量益母草藥材后，人體出現(xiàn)過敏、腹瀉等不良反應(yīng)，有的甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的肝、腎等臟器損傷[9-12]。因此，益母草藥材質(zhì)量的把控至關(guān)重要，而高效快捷的鹽酸水蘇堿檢測技術(shù)也顯得尤為迫切。目前，用于測定益母草中鹽酸水蘇堿含量的方法有HPLC-UV法、HPLC-ELSD法、HPLC-MS法、HPLC-DAD法等[13-16]，它們大多儀器昂貴、操作繁雜、維護較難，不便于在中小型企業(yè)中普及應(yīng)用。因此，亟需建立一種操作簡便、快速、穩(wěn)定、易于普及的方法，以便各類型藥企普及益母草藥材中鹽酸水蘇堿的檢測。

市售的益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量常常存在較大差異，與藥企、中醫(yī)院等具有檢測儀器相比，普通市民在購買益母草藥材時很難確定其有效成分含量。而鹽酸水蘇堿含量往往與益母草藥材性狀具有很大的關(guān)聯(lián)，分析不同廠家益母草藥材性狀與鹽酸水蘇堿含量的關(guān)系，可為市民、藥企和中藥商購買益母草藥材提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器 1100 系列分析型HPLC[安捷倫科技（中國）有限公司]，Mercury益母草專用柱（大連依利特分析儀器有限公司），BSA124S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；其他為一般常規(guī)儀器。

1.1.2 試藥與試劑 鹽酸水蘇堿對照品（100%，批號122683，中國食品藥品檢定研究院），益母草藥材（貴陽市太升中藥材市場的誠信、啟源、惠源等14家中藥廠家，用廠家老板的手機尾號后4位作為該藥材的代號），乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他為常規(guī)試劑（分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Mercury益母草專用柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為70%乙腈溶液；流速1.0 mL/min；柱溫45℃；示差檢測器，進樣量10 μL，樣品上機前過0.45 μm微孔濾膜。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的對照品適量，加70%乙醇制成含鹽酸水蘇堿0.100 mg/mL的溶液，搖勻備用。

1.2.3 供試品溶液制備 參照2015版《中華人民共和國藥典》[12]制備，樣品置于70℃烘箱烘至恒重，粉碎過40目篩，以八分法對角取樣。稱取樣品粉末約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精準(zhǔn)加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失重量，搖勻過濾備用。

1.2.4 方法學(xué)考察 （1）專屬性試驗：取對照品、供試品溶液進行測定，記錄色譜圖。（2）線性關(guān)系考察：精密稱取干燥至恒重的對照品適量，加70%乙醇制成鹽酸水蘇堿濃度分別為0.100、0.201、0.300、0.402、0.523 mg/mL的溶液，搖勻，按1.2.1色譜條件進行HPLC分析，記錄色譜圖。以鹽酸水蘇堿的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進行回歸分析。（3）重復(fù)性試驗：取同一批樣品6份，按1.2.3配制供試品溶液，按1.2.1色譜條件進行測定，根據(jù)測定值計算RSD。（4）穩(wěn)定性試驗：按1.2.3配置供試品溶液，靜置0、2、4、6、8、10、12 h后分別進行測定，記錄色譜圖，根據(jù)測定值計算RSD。（5）精密度試驗：精密吸取對照品溶液，連續(xù)測定6次，記錄色譜圖，按測定值計算RSD。（6）回收率試驗：精密稱取益母草粉末2 g，按1.2.3方法制成待測樣品，取6份樣品，其中：2份精密加入0.273 mg/mL的鹽酸水蘇堿1 mL；2份精密加入0.341 mg/mL的鹽酸水蘇堿1 mL；2份精密加入0.409 mg/mL的鹽酸水蘇堿1 mL。按1.2.1色譜條件分別測定，記錄色譜圖，計算平均回收率和RSD值。

1.2.5 不同廠家益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量的測定 按1.2.3的方法處理14個廠家的4批次益母草藥材，配制成供試品溶液，按1.2.1色譜條件分別進行測定，計算各廠家各批次藥材的鹽酸水蘇堿含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品及樣品的HPLC圖譜

分別取對照品溶液、供試品溶液進行HPLC分析，色譜圖如圖1所示，鹽酸水蘇堿的出峰時間約為11 min，峰型完整，無干擾。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系考察 回歸方程為y=91 519 x+1 342.2，

R2為0.991 6，表明建立的回歸方程相關(guān)性良好。此外，回歸方程的線性范圍為0.100～0.523 mg/mL。

2.2.2 重復(fù)性試驗 鹽酸水蘇堿含量為0.66%，其RSD值為0.23%，表明該檢測方法的重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 鹽酸水蘇堿含量為0.66%，其RSD值為0.29%，表明12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.4 精密度試驗 由表1可知，鹽酸水蘇堿的平均加樣回收率為100.07 %，RSD為0.71 %，表明該檢測方法的精密度良好。

2.3 不同廠家益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量測定

由表2可知，益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量最高的是廠家1367，達0.824%，其藥材性狀為葉多、葉綠、莖細；其次為廠家8656，鹽酸水蘇堿含量達0.679%，其藥材性狀為葉多、青綠、莖細。益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量在0.30%～0.50%的廠家有5083、8299、4368、3606、1458，其藥材性狀大多為色青綠或略黃、莖略多或莖粗。益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量在0.30%以下的廠家有5918、6813、7947、4636、2356、2768、2501，其藥材性狀大多為莖多葉少、葉色略黃、莖粗。2015版《中華人民共國藥典》規(guī)定：益母草藥材按干燥品計算，其鹽酸水蘇堿（C7H13NO2·HCl）含量不得少于0.50 %[15]，表明僅有廠家1367和8656的益母草藥材符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。因此，市民、藥企和中藥商等在購買益母草藥材時，應(yīng)選擇性狀為葉多、青綠、莖細的益母草藥材。

2.4 符合標(biāo)準(zhǔn)藥材復(fù)檢

從符合標(biāo)準(zhǔn)的2廠家購買大批量益母草藥材，復(fù)檢其益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量分別為0.66% 和0.79%，均大于0.50%的要求。

3 小結(jié)與討論

益母草中鹽酸水蘇堿屬于強極性的酸堿兩性小分子化合物，反相色譜柱較難將其分離，常用的C18柱也較難將其分離[13]。該研究采用的正向酰胺柱具有良好的分離效果，克服了以上不足。

該研究所用樣品上機前均過0.45 μm微孔濾膜處理，可較好地保護色譜柱及儀器，同時也可減少污染或雜質(zhì)對測定結(jié)果的影響。

李偉等[13]報道的益母草原藥材鹽酸水蘇堿的檢測方法為HPLC-ELSD（蒸發(fā)光散射檢測器），使用該方法需要有較高的飄移管溫度和一定的載氣體積流量，耗時耗能耗材。周超等[14]采用HPLC-MS法同時測定益母草及益母草顆粒中鹽酸水蘇堿及益母草堿含量時，流動相需要梯度洗脫分流進入質(zhì)譜儀，對柱溫、毛細管電壓、探頭溫度、錐孔電壓、定量離子等都有一定的要求，儀器價格較貴、操作繁雜、不易普及；該研究建立的HPLC-RID法測定益母草中鹽酸水蘇堿含量與前人研究已報道的HPLC-ELSD[13]、HPLC-MS[14]、HPLC-UV[15]、HPLC-DAD[16]法相比，具有重復(fù)性好、操作簡便、快速、穩(wěn)定、易于普及等優(yōu)點，可滿足一般藥企對益母草藥材的質(zhì)量控制。

該研究對市場上不同廠家益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各廠家的益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量差異較大，14家廠家中僅有1367和8656這2家的益母草藥材符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。此外，鹽酸水蘇堿的含量與益母草藥材性狀有較大關(guān)聯(lián)度，鹽酸水蘇堿含量較高的益母草藥材性狀大多為葉多、青綠、莖細，含量較低的益母草藥材性狀大多為莖多葉少、葉色略黃、莖粗。因此，市民、藥企和中藥商等在購買益母草藥材時，應(yīng)選擇性狀為葉多、青綠、莖細的益母草藥材。

參考文獻：

[1] 俞捷，王璟，趙榮華，等. 益母草腎臟不良反應(yīng)研究進展[J]. 中國中藥雜志，2010，35（9）：1213-1216.

[2] 李存玉，馬赟，劉奕洲，等. 超濾-納濾聯(lián)用優(yōu)化益母草生物堿的濃縮工藝[J]. 中國中藥雜志，2017，42（1）：100-106.

[3] 謝曉芳，陳俊仁，李剛敏，等. 益母草對子宮的藥理作用研究進展[J]. 世界中醫(yī)藥，2020，15（9）：1263-1266.

[4] 代良萍，董艷紅，胡婷婷，等. 水蘇堿藥理作用研究進展[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2016，22（19）：189-193.

[5] 喬晶晶，吳啟南，薛敏，等. 益母草化學(xué)成分與藥理作用研究進展[J]. 中草藥，2018，49（23）：5691-5704.

[6] 王麗娟，張麗，王勇，等. 益母草鎮(zhèn)痛抗炎作用的實驗研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2009，20（3）：645-646.

[7] 魏麗春，李慶軍. 益母草的藥理與臨床研究進展[J]. 西北藥學(xué)雜志，2009，24（4）：333-335.

[8] 崔展. 益母草顆粒抗心肌缺血的臨床研究[J]. 中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2017，9（17）：190-192.

[9] 孫蓉，馮群，趙慶華，等. 益母草毒性研究進展[J]. 中國藥物警戒，2014，11（2）：70-73.

[10] 黃偉，孫蓉，張作平. 益母草不同炮制品的小鼠急性毒性實驗研究[J]. 中國藥物警戒，2010，7（2）：65-69.

[11] 于華蕓，季旭明. 益母草的毒性毒理研究概況[J]. 湖南中醫(yī)雜志，2008，24（2）：112-113.

[12] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典-四部（2015年版）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[13] 李偉，張建軍，王小花，等. HPLC-ELSD測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2018，24（23）：100-103.

[14] 周超，張聿梅，何軼，等. HPLC-MS法同時測定益母草及其顆粒劑中鹽酸水蘇堿與鹽酸益母草堿的含量[J]. 藥物分析雜志，2016，36（5）：830-834.

[15] 包小紅，周娟，伍丕娥. HPLC法測定4種益母草制劑中鹽酸水蘇堿及其標(biāo)準(zhǔn)方法評價[J]. 中成藥，2012，34（9）：1825-1828.

[16] 伍濤，肖裕章，李成洪，等. HPLC-DAD法測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量的方法[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2020，55（3）：23-28， 37.

（責(zé)任編輯：張煥裕）