EGCG對高脂飲食GK大鼠白色脂肪米色化的誘導作用與機制研究

萬麗瑋 曾鴻哲 彭麗媛 文帥 劉昌偉 鮑肅都 安勤 黃建安 劉仲華

收稿日期：2023-10-11 ????????????修訂日期：2023-11-11

基金項目：國家茶葉產業(yè)技術體系（CARS-19）、茶葉功能成分優(yōu)異資源高效利用技術研究（湘財農指[2021]0015號）

作者簡介：萬麗瑋，女，碩士研究生，主要從事茶葉功能成分利用與深加工研究。*通信作者：Jian7513@hunau.edu.cn；larkin-liu@163.com

摘要：脂肪組織類型與人體代謝密切相關，通過飲食或營養(yǎng)干預將白色脂肪細胞轉變?yōu)楫a熱的米色脂肪細胞是一種減少脂肪積蓄、調節(jié)代謝的安全策略。目前關于白色脂肪組織米色化作用的研究多聚焦于肥胖群體，為探究EGCG對非肥胖代謝紊亂群體的內臟白色脂肪組織米色化的誘導作用及相關機制，采用非肥胖型自發(fā)性2型糖尿病模型Goto-Kakizaki（GK）大鼠，給予每日高脂飲食，并進行40 mg·kg-1和80 mg·kg-1 EGCG灌胃干預，檢測GK大鼠的體質量、攝食量、脂肪組織細胞形態(tài)及米色化相關基因表達水平、UCP1蛋白表達水平，并進行轉錄組測序。結果表明，80 mg·kg-1 EGCG灌胃干預對GK大鼠攝食量和體質量無明顯影響，但能夠促使脂肪細胞呈現(xiàn)向多房型脂肪細胞轉變趨勢，并顯著上調米色化相關的Pparg、Ppargc1a、Ucp1基因表達水平和UCP1蛋白表達水平，具有誘導高脂飲食GK大鼠內臟附睪白色脂肪組織米色化的作用，且表現(xiàn)出調節(jié)脂質代謝的潛力。結合轉錄組分析結果表明，EGCG對高脂飲食GK大鼠白色脂肪組織米色化的誘導作用機制可能與PPAR信號通路、PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路有關。

關鍵詞：EGCG；非肥胖型；GK大鼠；白色脂肪組織；米色化

中圖分類號：S571.1；R972+.6? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1000-369X（2024）01-119-14

Inductive Effect and Mechanism of EGCG on Beiging of White Adipose Tissue in High-fat Diet-fed GK Rats

WAN Liwei， ZENG Hongzhe， PENG Liyuan， WEN Shuai， LIU Changwei， BAO Sudu，

AN Qin， HUANG Jian'an*， LIU Zhonghua*

Key Lab of Education Ministry of Hunan Agricultural University for Tea Science， National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China， Changsha 410128， China

Abstract： The types of adipose tissue are closely related to human metabolism. Transforming white adipocytes into thermogenic beige adipocytes through dietary or nutritional interventions is a safe strategy to reduce fat accumulation and regulate metabolism. Currently， research on the role of white adipose tissue beiging has mainly focused on obese populations. To explore the effect of EGCG on promoting the beiging of white adipose tissue in non-obese individuals with metabolic disorders and its related mechanisms， this study used non-obese， spontaneously diabetic type 2 GK rats. These rats were fed a high-fat diet and received 40 mg·kg-1 and 80 mg·kg-1 EGCG daily by gavage. In this study， we assessed body weight， food intake， cellular morphology of adipose tissue， gene expression levels associated with beiging， and protein expression levels of UCP1 in GK rats. Additionally， transcriptome sequencing was also performed on epididymal white adipose tissue. The results show that gavage intervention with 80 mg·kg-1 EGCG has no significant effect on the food intake and body weight of GK rats. It induced a trend of beiging in adipocytes towards a multilocular phenotype transformation， characterized by a decrease in cell size and an increase in cell number. Moreover， it significantly upregulated the expression levels of beiging-related genes Pparg， Ppargc1a， Ucp1 and the protein expression level of UCP1.This demonstrates the inducing effect of EGCG on the beiging of visceral epididymal white adipose tissue in high-fat diet-fed GK rats， indicating its potential in the regulation of lipid metabolism. Combined with transcriptome analysis， the results suggest that the induction mechanism of EGCG on the beiging of white adipose tissue in high-fat diet-fed GK rats may be associated with the PPAR signaling pathway， PI3K/Akt， and MAPK signaling pathway.

Keywords： EGCG， non-obesetype， Goto-Kakizaki rats， white adipose tissue， beiging

機體代謝平衡由復雜的內穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)維持，涉及多個組織器官，其中，脂肪組織負責多種脂肪因子的合成與分泌，承擔著調節(jié)新陳代謝、維持能量穩(wěn)態(tài)、保護周圍組織等作用，與糖尿病、肥胖、高脂血癥等多種疾病的發(fā)生密切相關[1]。哺乳動物的脂肪組織分為主要由白色脂肪細胞組成的白色脂肪組織（White adipose tissue，WAT）和主要以棕色脂肪細胞為主的棕色脂肪組織（Brown adipose tissue，BAT）。在WAT中，白色脂肪細胞用于儲存甘油三酯，并且可以被誘導轉分化為類似棕色脂肪細胞的米色脂肪細胞，這一過程被稱為米色化；在BAT中，棕色脂肪細胞通過線粒體中的解耦聯(lián)蛋白（Uncouple proteins，UCPs）在非耦聯(lián)呼吸及能量消耗中發(fā)揮重要作用。米色和棕色脂肪細胞都能以熱量形式消耗能量，被稱為產熱細胞[2-3]。WAT的米色化是一個復雜的適應性代謝重塑過程[4]，其誘導生成的米色脂肪細胞不僅能夠增強脂質分解代謝、改善胰島素敏感性，而且表現(xiàn)出卓越的葡萄糖攝取與氧化能力[5-6]。因此，誘導米色脂肪細胞生成被認為是一種對抗代謝紊亂的策略，如何通過飲食或營養(yǎng)干預提高產熱脂肪組織的豐度和活性從而促進自身的能量代謝并降低機體的脂質積累，已成為調節(jié)代謝、預防代謝性疾病的重要研究方向[7]。

綠茶是世界范圍內流行的健康飲料。流行病學和試驗研究表明，飲用綠茶可以降低肥胖及相關疾病的風險[8]。綠茶中含有豐富的兒茶素，包括表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）[9]，其中，EGCG是綠茶中主要的生物活性兒茶素，占綠茶兒茶素總含量的50%[10]。據(jù)報道，EGCG具有調節(jié)飲食誘導肥胖小鼠脂質代謝的作用，并通過提高棕色脂肪組織產熱和線粒體生物發(fā)生基因的表達改善肥胖[11]；體外試驗發(fā)現(xiàn)，EGCG抑制了3T3-L1前脂肪細胞分化，并誘導腹股溝白色脂肪組織（Inguinal white adipose tissue，iWAT）米色化[12]，這些結果都提示EGCG可能是白色脂肪細胞轉變?yōu)槊咨炯毎恼T導因子。iWAT是小鼠和大鼠的經(jīng)典皮下脂肪組織，附睪白色脂肪組織（Epididymal white adipose tissue，eWAT）是小鼠和大鼠的經(jīng)典內臟脂肪組織，它們在發(fā)育起源、解剖位置和對代謝刺激的反應方面有所不同[13]，Li等[14]認為EGCG可能通過不同的機制在皮下脂肪組織和附睪脂肪組織中起作用。目前，有關EGCG促進脂肪細胞米色化作用的研究主要采用皮下白色脂肪組織（Subcutaneous white adipose tissue，scWAT），對內臟白色脂肪組織（Visceral white adipose tissue，visWAT）米色化的研究較少，且誘導米色化的機制尚未明確。因此，本研究選取大鼠經(jīng)典內臟白色脂肪庫eWAT為研究對象，探究EGCG誘導visWAT米色化的作用。

Goto-Kakizaki（GK）大鼠是常用的非肥胖型自發(fā)性2型糖尿病模型[15]，在斷乳（3周齡）后即出現(xiàn)代謝紊亂，高脂飲食會進一步加重GK大鼠糖尿病及其代謝紊亂[16-18]，因此，高脂飲食的GK大鼠被認為是一種經(jīng)典的代謝紊亂動物模型[15]。目前有關EGCG促進WAT米色化作用的研究主要集中于肥胖群體，但是，非肥胖群體也可能存在代謝性疾病。有研究表明，亞洲人即使在不肥胖的情況下也易患代謝疾病[19]，這些代謝紊亂的非肥胖型群體也有調節(jié)代謝和預防代謝性疾病的需求，而通過誘導WAT米色化改善其代謝紊亂是一種有前景的策略。因此，本研究以高脂飲食的GK大鼠為研究對象，通過補充不同劑量的EGCG，研究EGCG對GK大鼠主要的內臟白色脂肪庫eWAT米色化的誘導作用，并結合轉錄組學進一步挖掘EGCG在非肥胖型代謝紊亂群體中visWAT米色化的相關機制，以期為EGCG在非肥胖型代謝紊亂群體中作為一種天然的調節(jié)代謝、預防代謝性疾病的活性物質補充理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物

30只SPF級的雄性GK大鼠（9～11周齡）購自江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2021-0013。動物房溫度控制在（25±1）℃，光照條件設定為12 h/12 h光暗循環(huán)，每籠飼養(yǎng)5只大鼠，每日更換墊料、清洗水瓶以保持籠內清潔，試驗期間大鼠自由飲水、攝食。

1.1.2 藥品與試劑

EGCG（純度≥98%）由湖南三福生物科技有限公司提供；甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、非酯化游離脂肪酸（Nonesterified free fatty acids，NEFA）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density

lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；線粒體解偶聯(lián)蛋白1（Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1，UCP1）兔多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術公司；SteadyPure RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒、SYBR Green Pro Taq預混型qPCR試劑盒均購自湖南艾科瑞生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

MS204TS電子天平，梅特勒托利多集團；PCRUV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；多功能酶標分析儀，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司；Power Gen125高速勻漿機、ABI QuantStudio3熒光定量PCR儀、Nanodrop 2000核酸濃度測定儀，賽默飛世爾科技公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；病理切片機，上海徠卡儀器有限公司；石蠟包埋機，武漢俊杰電子有限公司；Eclipse C1正置熒光顯微鏡，日本尼康公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物試驗設計

30只GK大鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為3組，分別為對照組（CON，n=10）、40 mg·kg-1 EGCG干預組（EGCG-L，n=10）和80 mg·kg-1 EGCG干預組（EGCG-H，n=10），每組大鼠均進食60%高脂飼料。其中，EGCG劑量參照Yang等[20]確定的每杯沖泡綠茶的EGCG含量，并根據(jù)體表面積歸一化[21]方法推算（人體每日飲用綠茶2～3杯相當于大鼠每日灌胃40 mg·kg-1 EGCG；人體每日飲用綠茶4～5杯相當于大鼠每日灌胃80 mg·kg-1 EGCG）。EGCG干預組按照設定劑量灌胃給藥，CON組灌胃等量超純水，每日1次，持續(xù)4周，灌胃體積根據(jù)每日體重變化而變化。試驗期間，每周稱量大鼠體質量1次，每兩天統(tǒng)計1次攝食量。待試驗結束，大鼠禁食12 h，經(jīng)腹腔按30 mg·kg-1劑量注射戊巴比妥鈉麻醉，收集各組大鼠的血液樣本和附睪白色脂肪組織（Epididymal white adipose tissue，eWAT），置于–80 ℃保存?zhèn)溆?。本試驗符合動物倫理?guī)范并經(jīng)湖南農業(yè)大學動物實驗委員會批準，批準號：倫審科2021第（2137）號。

1.2.2 大鼠脂肪組織切片病理學觀察

取每只大鼠的附睪脂肪組織于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、包埋、切片后制備成石蠟切片，進行蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-

eosin staining，H&E染色），將切片置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 實時熒光定量PCR

按照試劑盒說明，提取脂肪組織RNA，通過逆轉錄反應合成cDNA。以cDNA為模板，按試劑盒說明書要求進行實時熒光定量PCR反應，反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。采用β-actin作為內參基因，對脂肪組織中UCP1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑-1α（Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PPARGC1A）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）的基因表達水平進行檢測，3次技術重復。使用NCBI Primer-BLAST網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.

nih.gov/tools/primer-blast）設計引物，委托北京擎科生物科技股份有限公司進行引物合成，PCR引物序列見表1，采用法分析基因的相對表達量。

1.2.4 脂肪組織UCP1蛋白表達水平檢測

免疫組織化學檢測脂肪組織UCP1蛋白表達水平。將石蠟切片脫蠟脫水，進行抗原修復，用牛血清白蛋白室溫封閉后，滴加UCP1一抗4 ℃孵育過夜，第二天滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育，待二氨基聯(lián)苯胺顯色后使用蘇木素復染，最后將切片脫水、透明、封片后，將玻片置于掃描儀下采集圖像。

1.2.5 血液生化指標檢測

大鼠麻醉后主動脈取血，將采集的血液樣本在4 ℃、3 500 r·min-1條件下離心10 min，收集上層血清，放置于–80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書，使用多功能酶標分析儀測定血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、NEFA的含量。

1.2.6 總RNA提取與轉錄組測序

使用總RNA提取試劑盒分別提取每只大鼠附睪白色脂肪組織的RNA，使用Nanodrop 2000核酸定量分析儀對所提RNA的濃度及純度進行檢測，OD260/280在1.9～2.1，OD260/230≥1.0的視為合格，樣品檢測合格后，委托深圳華大基因科技有限公司進行脂肪組織RNA的測序，每組設置3個生物學重復。

1.2.7 測序數(shù)據(jù)處理與分析

將測序得到的raw data使用深圳華大基因科技有限公司自主研發(fā)的過濾軟件SOAPnuke（v1.5.6）進行過濾，過濾掉包含接頭、未知堿基N含量大于5%、低質量的（質量值低于15的堿基占該reads總堿基數(shù)的比例大于20%的reads為低質量的reads）reads，得到clean data。使用Dr. Tom多組學數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)（https：//biosys.bgi.com）進行數(shù)據(jù)分析、繪圖及挖掘。通過HISAT2（v2.1.0）軟件將clean data與參考基因組進行比對，使用Bowtie2（v2.3.4.3）將clean data比對到參考基因集上并在RSEM（v1.3.1）軟件進行基因表達定量。通過pheatmap（v1.0.8）繪制基因表達量的聚類熱圖，使用DESeq2（v1.4.5）進行差異基因檢測，條件為Q值≤0.05且|log2Fold Change|≥0.585。基于超幾何檢驗深入探索與表型變化相關的基因功能，使用Phyper對差異基因進行GO及KEGG（www.kegg.jp）富集分析，以Q值≤0.05為閾值篩選顯著富集的候選基因。使用GSEA（v4.3.2）軟件進行基因集富集分析，滿足校正后P值（Adjusted P value）<0.25的視為顯著富集。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均使用平均數(shù)±標準差（±SD）表示，采用Image J軟件處理圖像，使用GraphPad Prism 9和TBtool軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析及圖表繪制，多組間數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA單向方差分析和Tukey

事后檢驗，當P<0.05時表示差異達到統(tǒng)計學顯著水平，*、**、***、****分別表示P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1。

2 結果與分析

2.1 EGCG對高脂飲食GK大鼠體質量和攝食量的影響

由圖1A可知，適應性喂養(yǎng)兩周后，30只GK大鼠的體質量無顯著差異，經(jīng)相應條件飼養(yǎng)4周后，各組GK大鼠的體質量無顯著差異。對GK大鼠每日攝食量進行分析發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，EGCG干預對GK大鼠攝食量無顯著影響（圖1B）。以上結果表明，在本試驗中EGCG灌胃干預對GK大鼠體質量與攝食量影響不顯著。

2.2 EGCG對高脂飲食GK大鼠脂肪組織形態(tài)的影響

由圖2可知，CON組脂肪細胞體積膨大，且嚴重變形，細胞大小不一，呈無規(guī)則排列（圖2A）；EGCG-L組脂肪細胞排列相對整齊，無明顯變形，結構較完整（圖2B）；EGCG-H

組脂肪細胞呈多邊形，視野內可見細胞數(shù)目增多，且細胞排列整齊，形態(tài)清晰，細胞膜清楚（圖2C）。每個切片隨機選取5個視野，使用Image J軟件對視野范圍內的每個脂肪細胞面積進行定量分析，結果如圖2D所示。相對于CON組，EGCG-L組和EGCG-H組細胞平均面積顯著下降（P<0.01），且EGCG干預組的脂肪細胞面積的數(shù)值分布較CON組更集中，此外，EGCG-H組細胞面積的最大觀測值與最小觀測值均小于其他兩組。

2.3 EGCG對高脂飲食GK大鼠脂肪組織米色化相關基因表達的影響

為進一步探究EGCG對高脂飲食GK大鼠白色脂肪組織米色化的誘導作用，檢測了脂肪組織中調控脂肪細胞分化的關鍵基因Pparg以及產熱基因Ucp1、Ppargc1a的表達情況。如圖3所示，與CON組對比，EGCG-L組Pparg表達量顯著上升（P<0.05），Ppargc1a和Ucp1表達量無顯著差異；EGCG-H組Pparg、Ppargc1a、Ucp1表達量均極顯著上升（P<0.01）。

2.4 EGCG對高脂飲食GK大鼠UCP1蛋白表達水平的影響

線粒體棕色脂肪解偶聯(lián)蛋白1（Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1，UCP1）是在產熱脂肪細胞中特異性表達的蛋白，是研究脂肪組織產熱功能的重要標志物。白色脂肪細胞被誘導為米色脂肪細胞后會激活UCP1蛋白的表達，為明確EGCG對高脂飲食GK大鼠UCP1蛋白表達水平的影響，進一步通過免疫組織化學檢測了UCP1蛋白在GK大鼠eWAT的表達情況。由圖4可知，CON組和EGEG-L組細胞染色少且呈淡黃色，UCP1蛋白均呈弱陽性表達，EGCG-H組細胞染色為棕黃色，UCP1蛋白呈陽性表達。使用Image J軟件計算平均光密度值，分析UCP1蛋白表達水平，結果如圖4D所示，EGCG-L組UCP1蛋白表達水平與CON組無顯著差異，EGCG-H組UCP1蛋白表達水平顯著高于CON組（P<0.05）。表明40 mg·kg-1 EGCG干預對eWAT米色化作用不明顯，而80 mg·kg-1 EGCG干預能夠提高產熱脂肪標志物UCP1蛋白的表達水平，進一步證明了EGCG能夠在eWAT中發(fā)揮其誘導白色脂肪組織米色化的作用。

2.5 EGCG對高脂飲食GK大鼠血清脂質水平的影響

為探究EGCG誘導的WAT米色化對脂質代謝的調節(jié)潛力，對GK大鼠血脂的重要組分TC、TG、HDL-C、LDL-C進行了檢測。由圖5A和5B可知，與CON組相比，EGCG-H組血清TG、TC水平顯著下降（P<0.01）。高水平的LDL-C是動脈粥樣化及心血管疾病重要的發(fā)病因素，圖5C顯示，與CON組相比，EGCG-L和EGCG-H組大鼠血清LDL-C水平均得到顯著改善（P<0.05），且EGCG-H組效果優(yōu)于EGCG-L組。血清中HDL-C有助于降低心腦血管疾病的發(fā)病風險，其水平和動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展呈負相關[18]，由圖5D可知，EGCG-L組HDL-C水平顯著高于CON組（P<0.01），而EGCG-H組與CON組無顯著差異。NEFA是血清中未與膽固醇、甘油等成分酯化的非酯化游離脂肪酸，其水平可反映脂質代謝狀況。由圖5E可知，與CON組相比，EGCG-L組NEFA含量下降，但無顯著差異，而EGCG-H組NEFA含量顯著降低（P<0.05）。以上結果表明，40 mg·kg-1和80 mg·kg-1 EGCG干預能不同程度地改善脂質代謝，其中，80 mg·kg-1 EGCG干預能夠顯著影響血脂水平。

2.6 EGCG對高脂飲食GK大鼠脂肪組織轉錄組的影響

本研究通過DNBSEQ平臺檢測了GK大鼠eWAT共9個樣品，單個樣品平均產出6.68 G數(shù)據(jù)。樣品比對基因組的平均比對率為98.15%，比對基因集的平均比對率為72.31%。為確保試驗數(shù)據(jù)準確，對轉錄組測序所得的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進行過濾，得到高質量clean reads，數(shù)據(jù)過濾情況如表2所示。過濾后的clean reads占原始數(shù)據(jù)的比例大于95%，Q20和Q30分別代表測序過程中堿基識別錯誤的概率小于1%和0.1%的clean reads的比率，由表2可知，本研究中所有被測樣品的clean reads Q30均在94%以上，測序質量較高，能夠滿足后續(xù)測序數(shù)據(jù)分析的要求。

將樣本基因表達量降維處理后進行主成分分析（Principal component analysis，PCA），結果如圖6A所示，3組樣本的組內聚類和組間差異符合進一步分析的要求。如圖6B和6C所示，在CON組和EGCG-L組之間共篩選到55個差異表達基因，其中27個差異基因上調表達，28個差異基因下調表達；在CON組和

EGCG-H組之間共篩選到323個差異表達基因，其中127個差異基因上調表達，196個差異基因下調表達，差異基因表達量熱圖如圖6D所示。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行生物學途徑分類，結果如圖6E和6F所示，EGCG-L組的差異表達基因更多富集在免疫系統(tǒng)相關通路，在代謝途徑中富集到的通路數(shù)量較少，而EGCG-H組的差異表達基因更多富集在脂質代謝和內分泌系統(tǒng)相關通路。進一步對CON組和EGCG干預組的差異表達基因進行KEGG富集，富集結果如圖6G和6H所示，與CON組相比，EGCG-L組差異基因顯著富集在補體和凝血級聯(lián)、類風濕性關節(jié)炎、近端小管碳酸氫鹽回收、肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、蛋白質消化和吸收、白細胞經(jīng)內皮遷移信號通路；EGCG-H組差異基因顯著富集在ECM-受體相互作用信號通路、TGF-β信號通路、神經(jīng)退行性病變-多種疾病信號通路、河馬信號通路、色氨酸代謝、阿米巴病、人瘤病毒感染、基底細胞癌、Wnt信號通路、MAPK信號通路、癌癥中的轉錄失調、雌激素信號通路、生熱作用、糖尿病心肌病、PI3K/Akt信號通路、PPAR信號通路、調節(jié)干細胞多能性的信號通路、癌癥中蛋白聚糖、金黃色葡萄球菌感染、亨廷頓病信號通路。

由于KEGG富集分析涉及到主觀設定的閾值，可能遺漏部分有重要生物學意義的基因，并且不能反映差異基因的總體變化趨勢，具有一定局限性，因此，進一步將EGCG-H組對比CON組進行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA），結果如圖7所示。GSEA顯著富集到PPAR信號通路、AMPK信號通路、PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路，其中PPAR信號通路被活化，AMPK信號通路、PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路被抑制。此外，對EGCG-H組的米色脂肪細胞標志基因Ucp1、Dio2、Cox8b、Ppargc1a、Tmem26以及Fgf21、Sorl1、Fndc5等可能與EGCG發(fā)揮促進WAT米色化作用相關基因的

表達量進行分析，結果發(fā)現(xiàn)（圖6E），相對于CON組，EGCG-H組Sorl1表達量下調，Ppargc1a、Cox8b、Dio2、Fgf21、Ucp1、Fndc5、Tmem26表達量上調，表明這些基因可能與EGCG促進eWAT米色化有關。

3 討論

綠茶是一種有益健康的飲品，越來越多的研究表明，飲用綠茶與預防心血管疾病和改善機體代謝有關，在綠茶中含量最豐富的兒茶素EGCG的抗肥胖作用已被認可，但對于非肥胖的代謝紊亂動物模型的調節(jié)脂質代謝與誘導WAT米色化的作用及其相關機制仍需進一步探究。Grove等[22]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠顯著降低高脂飲食誘導肥胖小鼠的體重，但本研究結果顯示各組GK大鼠體重均無顯著差異，與Uchiyama等[23]使用GK大鼠作為動物模型的結果一致，推測可能是由于GK大鼠的品種特性所致。

脂肪細胞的大小和數(shù)量對代謝功能有著重要的影響，脂肪細胞肥大會損害系統(tǒng)的能量平衡[24]，而通過減少能量積累或增加脂肪細胞的數(shù)量能夠防止脂肪細胞肥大，從而維持脂肪組織的健康[25]，本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG干預可有效減少脂質積累，經(jīng)80 mg·kg-1 EGCG干預后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，白色脂肪細胞內脂滴變小、數(shù)量增多，具有由單房大脂滴過渡到多房小脂滴的米色化趨勢，表明EGCG可能通過促進eWAT白色脂肪細胞米色化消耗脂肪組織中過量的能量，達到減少脂質積累的目的。

Pparg是調節(jié)脂肪發(fā)育和功能，以及白色脂肪細胞向米色脂肪細胞轉化的關鍵轉錄因子[5]，Ppargc1a、Ucp1是米色脂肪細胞的標志基因[26]。本研究檢測結果表明，80 mg·kg-1 EGCG能夠顯著提高Pparg、Ppargc1a、Ucp1的表達水平。WAT米色化的特點是出現(xiàn)UCP1蛋白的表達[27]，UCP1是一種存在于棕色和米色脂肪細胞線粒體內膜中的蛋白，能夠消耗線粒體內外膜間的質子電化學梯度，使氧化磷酸化與ATP合成解偶聯(lián)，把底物氧化產生的能量轉化為熱能，以此介導脂肪組織產熱，發(fā)揮預防代謝性疾病的作用[28]。雖然近年來有研究證明存在不依賴于UCP1的生熱途徑[29]，但線粒體中ATP合成的解偶聯(lián)仍然是棕色和米色脂肪細胞產熱的主要機制。為進一步探究產熱脂肪標志物UCP1蛋白的表達，對eWAT進行免疫組織化學檢測，結果表明，80 mg·kg-1 EGCG干預能夠激活脂肪分化相關的重要轉錄因子Pparg及其共激活物Ppargc1a，增強PPARG與PPARGC1A的結合，進而使線粒體膜的特異性蛋白UCP1的表達增加，使白色脂肪細胞轉化為米色脂肪細胞。

WAT的米色化伴隨著代謝重編程，具有促進脂肪分解代謝和能量消耗的作用，被視為對抗代謝紊亂的有效策略[5]。本研究結果表明，40 mg·kg-1 EGCG干預能夠調節(jié)高脂飲食GK大鼠血清LDL-C、HDL-C水平，80 mg·kg-1 EGCG干預能夠調節(jié)血清TG、TC、LDL-C、NEFA水平，兩個不同劑量的EGCG都能在不影響攝食量和體質量的情況下，表現(xiàn)出調節(jié)脂質代謝的潛力，且80 mg·kg-1劑量EGCG的效果更顯著，這可能是WAT米色化帶來的代謝收益。

為揭示EGCG對高脂飲食GK大鼠WAT米色化的誘導作用及機制，我們對GK大鼠eWAT進行了轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同劑量的EGCG干預后，EGCG-H組相較于EGCG-L組篩選到了更多的差異基因，與CON組的差異更為明顯。通過KEGG富集發(fā)現(xiàn)，EGCG-L組的差異表達基因未顯著富集到與脂肪產熱調控有關的信號通路，而EGCG-H組的差異表達基因顯著富集到TGF-β信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路、PPAR信號通路、PI3K/Akt信號通路和生熱作用，這些通路被認為與脂肪生成、脂肪分化、產熱調控有關。由于KEGG富集分析是針對有顯著差異的基因進行富集，可能遺漏部分有重要生物學意義的基因。從基因集角度將EGCG-H組對比CON組進行GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)80 mg·kg-1 EGCG干預后，大鼠PPAR信號通路被活化，AMPK信號通路、PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路被抑制。PPAR信號通路在糖脂代謝和脂肪產熱等方面發(fā)揮了重要作用，許多PPAR激動劑已被合成用于治療血脂異常和2型糖尿病等代謝性疾病[30]，PPAR信號通路的激活能夠促進WAT米色化；AMPK是調控脂質合成代謝與分解代謝的關鍵上游因子，激活AMPK信號通路可以調控脂質代謝紊亂[31-32]。但本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EGCG干預后AMPK信號通路在大鼠eWAT中受到抑制，這可能與GK大鼠代謝特性有關。成年（8～12周）GK大鼠胰島β細胞數(shù)量明顯減少且分泌功能受損，在疾病后期（8～24周）胰島炎癥反應的急劇增強，伴隨胰島功能性代償機制的喪失[33-34]，研究表明，EGCG能有效控制胰島炎癥[35]，保護和改善胰島β細胞功能[36]，Orts?ter等[37]發(fā)現(xiàn)，EGCG能改善db/db小鼠的糖耐量，增加胰島素分泌并且減少胰島的病理改變，近期研究證實AMPK與胰島素信號通路間存在復雜的關系，胰島素能夠抑制AMPK的活性[31]，因此，我們推斷AMPK信號通路的抑制可能與EGCG對GK大鼠胰島β細胞的保護和促進胰島素分泌的作用有關。PI3K能夠被免疫細胞中的細胞因子和趨化因子受體激活，參與炎癥細胞的募集，抑制PI3K/Akt信號通路能夠減少脂肪組織的巨噬細胞浸潤[38]。另有研究表明，抑制PI3Kα可能促進β3-腎上腺素能信號傳導，誘導WAT米色化從而增加能量消耗[39]。內臟脂肪組織在受到高脂飲食等誘導肥胖刺激后，相較于皮下脂肪組織更易產生炎癥反應[40]，抑制MAPK信號通路能夠減少巨噬細胞中炎癥細胞因子的表達[41]，本研究中，EGCG干預抑制了高脂飲食GK大鼠eWAT的MAPK信號通路，這可能與EGCG的抗炎作用有關，Okla等[42]認為抗炎作用有助于提高產熱脂肪細胞的活性。

針對EGCG-H組的米色脂肪細胞標志基因和米色化作用相關基因的表達量分析發(fā)現(xiàn)，相對于CON組，EGCG-H組Ppargc1a、Cox8b、Dio2、Ucp1、Tmem26表達量上調，這些基因是米色脂肪細胞特異性基因[43-44]，其表達量的上調進一步佐證了EGCG在大鼠eWAT中誘導米色化的作用。Whittle等[45]研究發(fā)現(xiàn)Sorl1敲除的小鼠出現(xiàn)白色脂肪組織米色化且不受飲食誘導肥胖的影響；Laeger等[46]認為FGF21能夠在不改變小鼠體脂肪量的情況下誘導WAT褐變和增強產熱作用；由Fndc5編碼的鳶尾素是一種運動誘導的肌動蛋白，具有誘導WAT褐變、改善胰島素抵抗等生物學作用[47]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于CON組，EGCG-H組Sorl1表達量下調，F(xiàn)gf21、Fndc5表達量上調，這些基因可能是EGCG誘導GK大鼠eWAT米色化作用的潛在靶點，后續(xù)將通過RNA干擾技術、基因敲除技術、蛋白質組學等方法對其作用機制進行進一步探究。

本研究從GK大鼠的體質量、攝食量、脂肪細胞形態(tài)、白色脂肪組織米色化相關基因表達水平、UCP1的蛋白表達水平以及eWAT RNA-seq對EGCG在GK大鼠visWAT米色化的誘導作用進行了多方面的探究，但未涉及脂肪細胞的線粒體功能的研究。WAT米色化過程中脂肪細胞為滿足細胞的產熱需求，其線粒體數(shù)量和活力均會大幅增加[2]，未來可以從線粒體生物發(fā)生、融合分裂與自噬以及蛋白穩(wěn)態(tài)等方面對EGCG促進WAT的米色化作用進行更深入的研究。

參考文獻

[1]Camp H S， Ren D， Leff T. Adipogenesis and fat-cell function in obesity and diabetes [J]. Trends in Molecular Medicine， 2002， 8（9）： 442-447.

[2]Sakers A， De Siqueira M K， Seale P， et al. Adipose-tissue plasticity in health and disease [J]. Cell， 2022， 185（3）： 419-446.

[3]Lee Y H， Mottillo E P， Granneman J G. Adipose tissue plasticity from WAT to BAT and in between [J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2014， 1842（3）： 358-369.

[4]Ma Y R， Shen S Y， Yan Y， et al. Adipocyte thyroid hormone β receptor-mediated hormone action fine-tunes intracellular glucose and lipid metabolism and systemic homeostasis [J]. Diabetes， 2023， 72（5）： 562-574.

[5]Yang N F， Wang Y X， Tian Q， et al. Blockage of PPARγ T166 phosphorylation enhances the inducibility of beige adipocytes and improves metabolic dysfunctions [J]. Cell Death & Differentiation， 2023， 30（3）： 766-778.

[6]Wang Q， Li H X， Tajima K， et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization [J]. Nature， 2022， 609（7925）： 151-158.

[7]Jia M， Xu T C， Xu Y J， et al. Dietary fatty acids activate or deactivate brown and beige fat [J]. Life Sciences， 2023， 330： 121978. doi： 10.1016/j.lfs.2023.121978.

[8]Cui C J， Jin J L， Guo L N， et al. Beneficial impact of epigallocatechingallate on LDL-C through PCSK9/LDLR pathway by blocking HNF1α and activating FoxO3a [J]. Journal of Translational Medicine， 2020， 18（1）： 195. doi： 10.1186/s12967-020-02362-4.

[9]Lambert J D， Sang S M， Yang C S. Biotransformation of green tea polyphenols and the biological activities of those metabolites [J]. Molecular Pharmaceutics， 2007， 4（6）： 819-825. doi： 10.1021/mp700075m.

[10]Lee M S， Kim Y. （-）-Epigallocatechin-3-gallate enhances uncoupling protein 2 gene expression in 3T3-L1 adipocytes [J]. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 2009， 73（2）： 434-436.

[11]Lee M S， Shin Y， Jung S， et al. Effects of epigallocatechin-3-gallate on thermogenesis and mitochondrial biogenesis in brown adipose tissues of diet-induced obese mice [J]. Food & Nutrition Research， 2017， 61（1） ： 1325307. doi： 10.1080/16546628.2017.1325307.

[12]Mi Y， Liu X， Tian H， et al. EGCG stimulates the recruitment of brite adipocytes， suppresses adipogenesis and counteracts TNF-α-triggered insulin resistance in adipocytes [J]. Food & Function， 2018， 9（6）： 3374-3386.

[13]Nahmgoong H， Jeon Y G， Park E S， et al. Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics [J]. Cell Metabolism， 2022， 34（3）： 458-472.

[14]Li F， Gao C， Yan P， et al. EGCG reduces obesity and white adipose tissue gain partly through AMPK activation in mice [J]. Front Pharmacol， 2018， 9： 1366. doi： 10.3389/fphar.2018.01366.

[15]Argoud K， Wilder S P， Mcateer M A， et al. Genetic control of plasma lipid levels in a cross derived from normoglycaemic Brown Norway and spontaneously diabetic Goto-Kakizaki rats [J]. Diabetologia， 2006， 49（11）： 2679-2688.

[16]Szkudelska K， Okulicz M， Hertig I， et al. Resveratrol ameliorates inflammatory and oxidative stress in type 2 diabetic Goto-Kakizaki rats [J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2020， 125： 110026. doi： 10.1016/j.biopha.2020.110026.

[17]Brunham L R. HDL as a causal factor in atherosclerosis： insights from human genetics [J]. Current Atherosclerosis Reports， 2016， 18（12）： 71. doi： 10.1007/s11883-016-0623-0.

[18]Matafome P， Louro T， Rodrigues L， et al. Metformin and atorvastatin combination further protect the liver in type 2 diabetes with hyperlipidaemia [J]. Diabetes Metabolism Research and Reviews， 2011， 27（1）： 54-62.

[19]Kiya M， Tamura Y， Takeno K， et al. Adipose insulin resistance and decreased adiponectin are correlated with metabolic abnormalities in nonobese men [J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism， 2021， 106（5）： e2228-e2238.

[20]Yang C S， Hong J. Prevention of chronic diseases by tea： possible mechanisms and human relevance [J]. Annual Review of Nutrition， 2013， 33： 161-81.

[21]Nair A B， Jacob S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human [J]. Journal of Basic and Clinical Pharmacy， 2016， 7（2）： 27-31.

[22]Grove K A， Sae-Tan S， Kennett M J， et al. （-）-Epigallocatechin-3-gallate inhibits pancreatic lipase and reduces body weight gain in high fat-fed obese mice [J]. Obesity， 2012， 20（11）： 2311-2313.

[23]Uchiyama Y， Suzuki T， Mochizuki K， et al. Dietary supplementation with （-）-epigallocatechin-3-gallate reduces inflammatory response in adipose tissue of non-obese type 2 diabetic Goto-Kakizaki （GK） rats [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2013， 61（47）： 11410-11417.

[24]Jeon Y G， Kim Y Y， Lee G， et al. Physiological and pathological roles of lipogenesis [J]. Nature Metabolism， 2023， 5（5）： 735-759.

[25]Wang B， Du M. Increasing adipocyte number and reducing adipocyte size： the role of retinoids in adipose tissue development and metabolism [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2023： 1-18. doi： 10.1080/10408398.2023.2227258.

[26]Inagaki T， Sakai J， Kajimura S. Transcriptional and epigenetic control of brown and beige adipose cell fate and function [J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2016， 17（8）： 480-495.

[27]Keinan O， Valentine J M， Xiao H， et al. Glycogen metabolism links glucose homeostasis to thermogenesis in adipocytes [J]. Nature， 2021， 599（7884）： 296-301.

[28]Kajimura S， Spiegelman B M， Seale P. Brown and beige fat： physiological roles beyond heat generation [J]. Cell Metabolism， 2015， 22（4）： 546-559.

[29]Ikeda K， Kang Q， Yoneshiro T， et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis [J]. Nature Medicine， 2017， 23（12）： 1454-1465.

[30]Hong F， Pan S J， Guo Y， et al. PPARs as nuclear receptors for nutrient and energy metabolism [J]. Molecules， 2019， 24（14）： 2545. doi： 10.3390/molecules24142545.

[31]G?ransson O， Kopietz F， Rider M H. Metabolic control by AMPK in white adipose tissue [J]. Trends in Endocrinology & Metabolism， 2023， 34（11）： 704-717.

[32]Wu L Y， Zhang L N， Li B H， et al. AMP-activated protein kinase （AMPK） regulates energy metabolism through modulating thermogenesis in adipose tissue [J]. Frontiers in Physiology， 2018， 9： 122. doi： 10.3389/fphys.2018.00122.

[33]Srinivasan K， Ramarao P. Animal models in type 2 diabetes research： an overview [J]. Indian Journal of Medical Research， 2007， 125（3）： 451-472.

[34]Hou J， Li Z， Zhong W， et al. Temporal transcriptomic and proteomic landscapes of deteriorating pancreatic islets in type 2 diabetic rats [J]. Diabetes， 2017， 66（8）： 2188-2200.

[35]雷蕾， 林智立， 王琳琳， 等. 2型糖尿病發(fā)病過程中胰島炎癥的動力學機理[J]. 科學通報， 2020， 65（35）： 4139-4148.

Lei L， Lin Z L， Wang L L， et al. The dynamics mechanism of islet inflammation during type 2 diabetes progress [J]. Chinese Science Bulletin， 2020， 65： 4139-4148.

[36]Cai E P， Lin J K. Epigallocatechin gallate （EGCG） and rutin suppress the glucotoxicity through activating IRS2 and AMPK signaling in rat pancreatic β cells [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009， 57（20）： 9817-9827.

[37]Orts?ter H， Grankvist N， Wolfram S， et al. Diet supplementation with green tea extract epigallocatechin gallate prevents progression to glucose intolerance in db/db mice [J]. Nutrition & Metabolism， 2012， 9： 11. doi： 10.1186/1743-7075-9-11.

[38]Kobayashi N， Ueki K， Okazaki Y， et al. Blockade of class IB phosphoinositide-3 kinase ameliorates obesity-induced inflammation and insulin resistance [J]. PNAS， 2011， 108（14）： 5753-5758.

[39]Araiz C， Yan A， Bettedi L， et al. Enhanced β-adrenergic signalling underlies an age-dependent beneficial metabolic effect of PI3K p110α inactivation in adipose tissue [J]. Nature Communications， 2019， 10（1）： 1546. doi： 10.1038/s41467-019-09514-1.

[40]Hwang I， Kim J B. Two faces of white adipose tissue with heterogeneous adipogenic progenitors [J]. Diabetes & Metabolism Journal， 2019， 43（6）： 752-762.

[41]Tian X， Xie G， Xiao H， et al. CXCR4 knockdown prevents inflammatory cytokine expression in macrophages by suppressing activation of MAPK and NF-κB signaling pathways [J]. Cell & Bioscience， 2019， 9： 55. doi： 10.1186/s13578-019-0315-x.

[42]Okla M， Kim J， Koehler K， et al. Dietary factors promoting brown and beige fat development and thermogenesis [J]. Advances in Nutrition， 2017， 8（3）： 473-483.

[43]Wang W S， Seale P. Control of brown and beige fat development [J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2016， 17（11）： 691-702.

[44]Finlin B S， Memetimin H， Confides A L， et al. Human adipose beiging in response to cold and mirabegron [J]. JCI Insight， 2018， 3（15）： e121510. doi： 10.1172/jci.insight.121510.

[45]Whittle A J， Jiang M， Peirce V， et al. Soluble LR11/SorLA represses thermogenesis in adipose tissue and correlates with BMI in humans [J]. Nature Communications， 2015， 6： 8951. doi： 10.1038/ncomms9951.

[46]Laeger T， Baumeier C， Wilhelmi I， et al. FGF21 improves glucose homeostasis in an obese diabetes-prone mouse model independent of body fat changes [J]. Diabetologia， 2017， 60（11）： 2274-2284.

[47]Zhang Y， Xie C， Wang H， et al. Irisin exerts dual effects on browning and adipogenesis of human white adipocytes [J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism， 2016， 311（2）： E530-E541. doi： 10.1152/ ajpendo.

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