不同產(chǎn)地黃芪飲片中多糖及甲苷含量比較

張立軍 王國(guó)祥

摘要：黃芪是常用補(bǔ)氣藥之一，黃芪多糖和黃芪甲苷是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。以黃芪多糖和黃芪甲苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較甘肅、內(nèi)蒙古、山西三個(gè)不同產(chǎn)地的黃芪飲片的質(zhì)量差異。結(jié)果表明：甘肅黃芪、內(nèi)蒙古黃芪、山西黃芪的多糖含量分別為22.87%、20.02% 、22.29%；甘肅黃芪的黃芪甲苷含量最高，為0.049%；其次是山西黃芪，黃芪甲苷含量為0.026%，內(nèi)蒙古黃芪中黃芪甲苷含量最低，僅為0.002 7%。僅有甘肅黃芪的甲苷含量測(cè)定結(jié)果符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。分析認(rèn)為藥材生長(zhǎng)年限是導(dǎo)致內(nèi)蒙古黃芪與甘肅黃芪、山西黃芪甲苷含量之間差異較大的主要原因。該研究為黃芪種植、資源開發(fā)及合理使用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃芪多糖；黃芪甲苷；含量；苯酚-硫酸法；HPLC法；質(zhì)量評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S567? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2097-2172（2024）03-0251-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.03.012

Comparision Study on Contents of Astragaloside and Polysaccharide in Astragali radix Slices from Different Areas

ZHANG Lijun 1， 2， WANG Guoxiang 1， 2

（1. Institute of Industrial Crops and Malting Barley， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;

2. Institute of Chinese Herbal Medicines， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： Astragali radix is one of the commonly used Qi-invigorating herbal medicines， with astragalus polysaccharides and astragalus saponins being the material basis for its medicinal effects. In this experiment， astragalus polysaccharide and astragalus saponins were used as evaluation parameters to compare the quality differences of Astragali radix slices from three different production areas： Gansu， Inner Mongolia， and Shanxi. Results showed that polysaccharide content of astragalus from Gansu， Inner Mongolia， and Shanxi was 22.87%， 20.02%， and 22.29%， respectively. Gansu Astragali radix had the highest astragalus saponins content at 0.049% followed by Shanxi Astragali radix at 0.026%， and Inner Mongolia Astragali radix had the lowest at only 0.002 7%. Only the astragalus saponins content of Gansu Astragali radix met the pharmacopoeia standards. The analysis suggested that the growth period of the medicinal materials was the main reason for the significant difference in astragalus saponins content between Astragali radix from Inner Mongolia and those from Gansu and Shanxi. This study provides a reference for the cultivation， resource development， and rational use of Astragali radix.

Key words： Astragalus polysaccharide; Astragaloside; Content; Phenol-sulfuric acid method; HPLC method; Quality evaluation

黃芪為豆科植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.） Hsiao］ 或膜莢黃芪［Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.］的干燥根，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江等地。春秋二季采挖，除去須根和根頭，曬干［1 ］。黃芪味甘、微溫，歸肺、脾經(jīng)，有補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗之功，是常用的補(bǔ)氣藥。黃芪的有效成分大約有十幾種，主要為黃芪皂苷，黃芪多糖、黃酮類化合物和氨基酸等。黃芪應(yīng)用歷史悠久，南北朝以前，黃芪以產(chǎn)地甘肅為佳，四川、陜西等地次之。唐代黃芪產(chǎn)地向東北遷徙至陜西中部和寧夏南部。宋代甘肅和陜西所產(chǎn)黃芪質(zhì)量較好，元代山西是黃芪的道地產(chǎn)地［2 ］。古代黃芪的產(chǎn)地，從甘肅、四川向陜西、山西過渡，至清代時(shí)黃芪的道地產(chǎn)區(qū)已移至山西、蒙古。近代主要認(rèn)為山西渾源、應(yīng)縣和甘肅隴西等地為黃芪優(yōu)良產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)［3 - 4 ］。黃芪在20世紀(jì) 70 年代以前多為野生資源，70 年代后開始有人工種植，其產(chǎn)地近50 a來(lái)不斷擴(kuò)展，在全國(guó)各地的適宜生長(zhǎng)區(qū)均有種植，但由于氣候環(huán)境、栽培方式、田間管理的不同，不同產(chǎn)區(qū)的黃芪在具體成分含量上存在差異。

黃芪多糖是黃芪的重要活性成分之一，是評(píng)價(jià)黃芪質(zhì)量的主要指標(biāo)，其具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖、抗衰老和抗炎等藥理作用，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)［5 ］。黃芪甲苷是黃芪所含皂苷類成分中的主要單體活性物質(zhì)，也是評(píng)價(jià)黃芪質(zhì)量的主要指標(biāo)和發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)［6 ］，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)代謝等藥理作用，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)一步抑制肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌、 卵巢癌等癌癥發(fā)展［7 ］，其抗腫瘤作用機(jī)制主要有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲等，還能在一定程度上增強(qiáng)抗腫瘤藥物敏感性和提高機(jī)體免疫力［8 ］。由于黃芪甲苷可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，在抗腫瘤治療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景［9 ］。為考察市場(chǎng)流通的黃芪飲片質(zhì)量，選用產(chǎn)地分別標(biāo)注為甘肅、山西、內(nèi)蒙古的黃芪飲片，以黃芪多糖、黃芪甲苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別用苯酚-硫酸法測(cè)定黃芪多糖含量，HPLC技術(shù)外標(biāo)法測(cè)定黃芪甲苷含量，比較甘肅、內(nèi)蒙古、山西3個(gè)不同產(chǎn)地的黃芪飲片的質(zhì)量差異，以期為黃芪種植、資源開發(fā)及合理使用提供參考依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料與儀器

供試材料為山西黃芪（產(chǎn)地：山西，生產(chǎn)商：山西渾源萬(wàn)生黃芪開發(fā)有限公司）、內(nèi)蒙古黃芪（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，生產(chǎn)商：榆林市廣濟(jì)堂中藥開發(fā)有限責(zé)任公司）、甘肅黃芪（產(chǎn)地：甘肅，生產(chǎn)商：蘭州安泰堂中藥飲片有限公司）。對(duì)照品為無(wú)水葡萄糖、黃芪甲苷（均購(gòu)自陜西寶雞辰光生物科技有限公司）。供試試劑苯酚、香草醛、95%乙醇、甲醇、正丁醇、濃硫酸均為市售分析純。

供試儀器有高效液相色譜儀（島津LC-20AT）、紫外分光光度計(jì)（UV Bluestar 300424，北京萊伯泰科儀器有限公司）、HX203T電子天平（慈溪市田東衡器廠制）、R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、微孔濾膜（0.45 μm）等。

1.2? ?測(cè)定方法

1.2.1? ? 黃芪多糖含量測(cè)定? ? ①多糖樣品制備。將每個(gè)產(chǎn)地黃芪飲片分別制備3份多糖樣品，即取黃芪飲片約50 g精密稱定3份，各加8倍量水，浸泡10 min，煎煮提取3次，每次煎煮30 min，過濾去渣，煎煮液合并抽濾，濃縮至100 mL。加入無(wú)水乙醇使含醇量達(dá)到80%，沉淀靜置過夜，醇沉初期可見黃芪多糖懸浮在80%乙醇液中，形似豆花。抽濾收集淡黃色沉淀物，用無(wú)水乙醇洗滌，置60 ℃烘箱干燥6 h，即得黃芪粗多糖樣品，均為淡黃色粉末［10 ］。②標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制參考陳芳艷等［11 ］的方法略有改進(jìn)，具體如下：取葡萄糖對(duì)照品10 mg，精密稱定，加蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中定容，配制成濃度0.100 mg/mL葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液。參照陳芳艷等［11 ］設(shè)計(jì)的濃度梯度，配制的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL系列濃度，顯色并測(cè)定吸光度（A），以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。③樣品溶液的配制及含量測(cè)定。取黃芪粗多糖約10 mg精密稱定3份，各加適量蒸餾水溶解，過濾，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中稀釋至刻度。精密吸取黃芪多糖樣品溶液2.0 mL，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻后加入濃硫酸顯色并測(cè)定吸光度［11 ］，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖樣品溶液濃度。

R（%）=［（C×V1×V2×N）/（V3×M×106）］×100

式中，R為多糖提取率，C是比色液濃度（mg/mL），V1是比色液體積（mL），V2是定容體積（mL），N表示稀釋倍數(shù)，V3是提供樣品體積（mL），M為試驗(yàn)樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2? ? 黃芪甲苷含量測(cè)定? ? ①黃芪甲苷樣品制備。同1.2.1項(xiàng)操作，取黃芪飲片水煎煮提取后用正丁醇萃取黃芪總皂苷，水浴揮去正丁醇，用甲醇溶解定容。②標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。色譜條件： ZHROBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm×5.0 μm） 色譜柱，流動(dòng)相為乙腈∶水（35∶65），柱溫25 ℃，檢測(cè)器為示差光學(xué)檢測(cè)器，溫度32 ℃，流速1.0 mL/min。黃芪甲苷對(duì)照品的配制：取黃芪甲苷對(duì)照品1 mg，加甲醇溶解定容。取對(duì)照品溶液，分別加甲醇稀釋成濃度為0.032、0.063、0.125、0.250、0.500 μg/mL的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分別取樣10 μL，注入高效液相色譜法色譜儀中。以對(duì)照品溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。③樣品測(cè)定。精密吸取黃芪甲苷樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄HPLC色譜圖，根據(jù)黃芪甲苷的峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃芪甲苷含量。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?多糖含量

2.1.1? ? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線? ? 從表1可以得出，不同濃度葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度測(cè)定結(jié)果繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為A= 9.987 5c-0.016 98（R2=0.998 6），可見葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.01～0.10 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2? ? 黃芪多糖含量? ? 各黃芪粗多糖樣品分別顯色測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。從測(cè)定結(jié)果（表2）可以看出，供試3個(gè)樣品的黃芪粗多糖含量由大到小依次為內(nèi)蒙古黃芪（2.381 g）、甘肅黃芪（2.313 g）、山西黃芪（1.880 g），根據(jù)粗多糖量和多糖含量測(cè)定數(shù)據(jù)，計(jì)算不同產(chǎn)地黃芪藥材中多糖含量為甘肅（22.87%）>山西（22.29%）>內(nèi)蒙古（20.02%）。經(jīng)分析認(rèn)為，甘肅、內(nèi)蒙古、山西黃芪的產(chǎn)地氣候條件、降水量等均有很大的差異，可能是影響所生產(chǎn)黃芪中多糖含量的因素之一。

2.2? ?黃芪甲苷含量

2.2.1? ? 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線? ? 分別吸取不同濃度黃芪甲苷對(duì)照品溶液，注入色譜儀，記錄峰面積見表3，其中以0.500 mg/mL黃芪甲苷對(duì)照品溶液HPLC色譜圖為例（圖1）。利用黃芪甲苷對(duì)照品溶液濃度及其峰面積得出黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=144 956x+ 3 229.06（R2=0.997 7），說(shuō)明在0.032～0.500 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系表現(xiàn)良好。

2.2.2? ? 黃芪甲苷含量比較? ? 取不同產(chǎn)地黃芪甲苷樣品，配制成不同濃度樣品溶液，HPLC進(jìn)樣測(cè)定，黃芪甲苷峰面積如下：甘肅黃芪分別為3 517、8 555、61 836，內(nèi)蒙古黃芪分別為3 202、0、? ? ? 5 756，山西黃芪分別為10 553、21 340、9 075（圖2）。 根據(jù)黃芪甲苷樣品的HPLC色譜圖中峰面積的平均值，按照黃芪甲苷對(duì)照品的線性回歸方程，計(jì)算制備的不同產(chǎn)地樣品中黃芪甲苷含量，通過計(jì)算得到3個(gè)不同地區(qū)黃芪藥材中黃芪甲苷含量（表4）。

由表4可見，甘肅黃芪、山西黃芪的3個(gè)樣品中黃芪甲苷均有檢出。3個(gè)不同產(chǎn)地黃芪飲片中黃芪甲苷的含量以甘肅黃芪最高，為0.049%；其次是山西黃芪，含量為0.026%，內(nèi)蒙古黃芪中黃芪甲苷的含量最低，僅為0.002 7%。按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）黃芪藥材含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定，“按干燥品計(jì)算，含黃芪甲苷（C41H68O14）不得少于0.040%”［1 ］。可知甘肅黃芪的含量測(cè)定結(jié)果符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

3? ?討論與結(jié)論

選用水提醇沉法進(jìn)行黃芪多糖提取，多糖的含量直接測(cè)定方法有苯酚-濃硫酸比色法和蒽酮-濃硫酸比色法，苯酚-硫酸法可測(cè)定甲基化的糖、戊糖和多聚糖，而蒽酮-硫酸法測(cè)定的是溶液中全部碳水化合物的總量，所測(cè)值一般高于苯酚-硫酸法［12 - 13 ］。本研究采取苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，結(jié)果顯示，甘肅產(chǎn)黃芪飲片多糖含量（22.87%）與山西產(chǎn)黃芪飲片多糖含量（22.29%）接近，均高于內(nèi)蒙古產(chǎn)黃芪飲片多糖含量（20.02%）。

黃芪甲苷樣品的制備及高效液相流動(dòng)相配比有較多文獻(xiàn)報(bào)道［14 - 18 ］，根據(jù)實(shí)驗(yàn)儀器所得樣品色譜圖比較，選擇乙腈-水（35∶65）進(jìn)行洗脫。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地黃芪質(zhì)量確實(shí)存在明顯差異，以黃芪多糖和黃芪甲苷為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，產(chǎn)地標(biāo)示為甘肅隴西的黃芪質(zhì)量最好，產(chǎn)地標(biāo)示為內(nèi)蒙古的黃芪質(zhì)量最差。這一結(jié)果與姚靜等［19 - 20 ］的報(bào)道基本一致，山西產(chǎn)黃芪的皂苷含量與甘肅產(chǎn)樣品中相近，顯著高于內(nèi)蒙古產(chǎn)樣品。楊長(zhǎng)華等［21 ］的研究結(jié)果顯示內(nèi)蒙古黃芪的總皂苷、甲苷含量均高于甘肅和山西，比較分析后發(fā)現(xiàn)，兩者的試驗(yàn)樣品制備時(shí)所用溶劑和操作方法均不同，分別使用甲醇回流提取和水煎煮提取，這也反映出溶劑和方法對(duì)樣品制備和含量檢測(cè)結(jié)果有很大影響。

試驗(yàn)所用黃芪飲片分別購(gòu)自不同生產(chǎn)廠家，標(biāo)示產(chǎn)地也不同。觀察飲片外觀，甘肅、內(nèi)蒙古和山西等3個(gè)不同產(chǎn)區(qū)黃芪飲片直徑有一定的差異，其中內(nèi)蒙古黃芪的直徑最大，約1.2～1.5 cm；其次是甘肅黃芪，直徑約0.8～1.0 cm；最次是山西黃芪，直徑為0.5～0.8 cm。經(jīng)分析，黃芪直徑的大小與所含黃芪多糖和黃芪皂苷有一定的關(guān)系，黃芪主根和側(cè)根中有效成分含量也會(huì)有明顯的差異，黃芪側(cè)根有效成分的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黃芪主根［22 ］。楊少杰等［23 ］研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)年限對(duì)蒙古黃芪質(zhì)量有顯著影響，主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、蘆頭直徑等外觀質(zhì)量指標(biāo)前3 a增長(zhǎng)快， 從第4年開始增長(zhǎng)變緩；水溶性浸出物含量和黃芪甲苷含量前4年增加快， 從第5年開始含量反而有所下降。張瑞等［24 ］也認(rèn)為生長(zhǎng)年限是影響黃芪藥材內(nèi)外在質(zhì)量的關(guān)鍵因素。由于文獻(xiàn)及本試驗(yàn)結(jié)果均反映出不同產(chǎn)地的黃芪飲片中多糖和皂苷含量存在差異，建議種植者要嚴(yán)格按照最佳生長(zhǎng)年限采收，飲片加工企業(yè)應(yīng)把好原料關(guān)，為市場(chǎng)提供合格的黃芪飲片。國(guó)家推行的《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》對(duì)不同產(chǎn)地的栽培管理提出明確要求，實(shí)行“六統(tǒng)一”（統(tǒng)一規(guī)劃生產(chǎn)基地；統(tǒng)一供應(yīng)種子種苗或其它繁殖材料；統(tǒng)一肥料、農(nóng)藥或者飼料、獸藥等投入品管理措施；統(tǒng)一種植或者養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)程；統(tǒng)一采收與產(chǎn)地加工技術(shù)規(guī)程；統(tǒng)一包裝與貯存技術(shù)規(guī)程），黃芪作為大宗藥食兩用藥材，進(jìn)一步完善其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。

本研究結(jié)果表明，甘肅、內(nèi)蒙古、山西產(chǎn)黃芪多糖含量分別為22.87%、20.02% 、22.29%。甘肅黃芪的黃芪甲苷含量最高，為0.049 0%；其次是山西黃芪，黃芪甲苷含量為0.026 0%；內(nèi)蒙古黃芪中黃芪甲苷含量最低，僅為0.002 7%。僅有甘肅黃芪的甲苷含量測(cè)定結(jié)果符合藥典標(biāo)準(zhǔn)（按干燥品計(jì)，含黃芪甲苷不得少于0.040 0%）。分析認(rèn)為，甘肅、內(nèi)蒙古、山西產(chǎn)黃芪的黃芪甲苷含量差異的主要原因是受藥材生長(zhǎng)年限影響。

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［18］ 黃亞非，劉? ?杰，黃際薇，等.? HPLC測(cè)定黃芪藥渣中黃芪甲苷含量［J］.? 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2009，48（2）：146-148.

［19］ 姚? ?靜，楊曉寧，朱? ?平， 等.? HPLC-CAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地黃芪質(zhì)量［J］.? 中成藥，2022，44（10）：3214-3219.

［20］ 姚? ?靜，孫欣光，董? ?蓉，等.? HPLC-CAD一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定黃芪中６種成分含量［J］.? 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2021，56（2）：557-564.

［21］ 楊長(zhǎng)花，程? ?芬，李? ?慧，等.? ?4 個(gè)主要黃芪產(chǎn)地黃芪質(zhì)量比較［J］.? 西部中醫(yī)藥，2019，32（1）：27-31.

［22］ 韓亞紅，李鴻雁.? 黃芪甲苷在黃芪主根側(cè)根的分布［J］.? 北方藥學(xué)，2006，3（3）：25-26.

［23］ 楊少杰，樊良帥，晉小軍，等.? 生長(zhǎng)年限對(duì)蒙古黃芪質(zhì)量的影響［J］.? 中國(guó)野生植物資源，2021，40（1）：60-64.

［24］ 張? ?瑞，曹慶偉，李? ?科，等.? 黃芪藥材性狀和化學(xué)特征與絕對(duì)生長(zhǎng)年限的相關(guān)性分析研究［J］.? 中草藥，2020，51（2）：451-460.