基于網絡藥理學和分子對接技術探討雷公藤治療關節(jié)病型銀屑病的作用機制

顧東彥，王子雯，許孟月，楊彤，陳姣，劉學偉

（河南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，河南 鄭州 450046）

關節(jié)病型銀屑?。≒soriasis arthropathica）或稱銀屑病關節(jié)炎（Psoriatic arthritis，PsA）是銀屑病的一種特殊類型，主要臨床表現(xiàn)為在尋常型銀屑病的皮損上伴有外周、中軸關節(jié)不同程度受累，嚴重影響患者的生活質量與身心健康[1]。有研究顯示，PsA 在我國的發(fā)生率為5.8%[2]，國外報告PsA 在銀屑病中約占6%～41%[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學主要采用非甾體抗炎藥、激素和生物制劑進行治療，但存在治愈率低、不良反應大的風險[1]。中醫(yī)認為濕熱毒邪痹阻經絡是本病的主要病因，而以雷公藤為主的中藥提取物能有效改善類風濕性關節(jié)炎與銀屑病的臨床癥狀，緩解患者疼痛，提高生活質量，相關作用機制有待進一步探索[4]。

網絡藥理學基于系統(tǒng)生物學、多項藥理學和蛋白組學，對生物系統(tǒng)進行網絡分析，強調信號通路的多途徑調節(jié)，提高藥物的治療效果，闡釋藥物的藥理作用和疾病的發(fā)病機制[5]。本研究采用網絡藥理學方法分析中藥雷公藤治療PsA 的作用機制，為進一步的臨床運用和實驗研究提供客觀科學依據。

1 資料與方法

1.1 雷公藤活性成分與潛在靶點收集 采用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“雷公藤”為檢索詞，以化合物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，篩選符合條件的活性成分及對應蛋白靶點，并使用Uniprot 數據庫進行標準化。

1.2 PsA 疾病靶點收集 通過GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）、DrugBank（http：//go.drugbank.com）數據庫，以“psoriasis arthropathica”、“psoriatic arthritis”為關鍵詞進行檢索，取交集并刪除重復靶點，獲取疾病靶點。

1.3 藥物-靶點網絡圖構建 將雷公藤活性成分及潛在作用靶點在Excel 中構建對應關系，利用Cytoscpe3.7.2 軟件繪制“藥物活性成分-靶點”網絡圖?；钚猿煞峙c靶點以“節(jié)點”表示，節(jié)點之間的相互作用以“邊”表示。

1.4 蛋白互作網絡圖（PPI）構建 將雷公藤與PsA共同作用靶點導入STRING（http：//string-db.org）在線數據庫，以置信度分數＞0.9 為條件篩選，將所得結果以文本形式結合Cytoscape3.7.2 軟件，構建PPI網絡圖并獲取核心靶點。

1.5 基因本體（GO）富集和京都基因與基因組數據庫（KEGG）通路分析 將交集靶點導入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）數據庫，以P＜0.05 為篩選條件，進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，進一步闡明雷公藤治療PsA 的作用機制。GO 富集分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞組成、分子功能和生物過程；KEGG 富集分析可以得到雷公藤和PsA 共同靶點富集的主要信號通路。

1.6 活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證 從RCSB PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb）下載靶點蛋白的晶體結構，保存為PDB 格式，使用PyMOL軟件去配體，再用AutoDock1.5.6 軟件去水加氫分配原子，計算電荷，保存為PDBQT 格式，從TCMSP數據庫下載化合物的三維結構，用CHEM3D 軟件做力場分析，最小能量化，進行靶點蛋白與化合物的對接，使用Discovery2016 軟件進行數據可視化。

2 結果

2.1 雷公藤活性成分 采用TCMSP 數據庫進行篩選后，得到雷公藤活性成分51 個，刪除重復化合物和無對應靶點的化合物，共獲得28 個活性成分和132 個靶點。

2.2 PsA 疾病靶點 在疾病靶點數據庫（GeneCards、OMIM、DrugBank）檢索PsA 的作用靶點，刪除重復值后，共計得到1 393 個靶點。并利用Venny2.1.0 軟件繪制藥物-疾病韋恩圖，獲得藥物疾病交集靶點70 個，見圖1。

圖1 雷公藤-關節(jié)型銀屑病韋恩圖

2.3 雷公藤活性成分-靶點網絡分析 運用Cytoscape3.7.2 軟件構建化合物活性成分-靶點網絡并進行拓撲分析，度值（Degree）越大的節(jié)點在網絡中的重要性越大。結果顯示，網絡中有160 個節(jié)點，414 條邊，見圖2。其中Degree 值前5 名的活性成分為山奈酚、β-谷固醇、雷公藤甲素、諾必列汀和豆甾醇等。網絡分析顯示，雷公藤通過多成分、多靶點、多途徑共同作用的方式發(fā)揮藥效。

圖2 活性成分-靶點網絡圖

2.4 PPI 網絡圖 將70 個共同靶點導入STRING數據庫，根據設置參數，得到雷公藤治療PsA 潛在靶點網絡，將結果轉換為文本格式，利用Cytoscape3.7.2 軟件，運用Network Analyzer 插件進行拓撲分析，得到潛在靶點基因拓撲參數自由度，自由度表示節(jié)點所包含的邊的數目，靶點自由度越大，表明通過改該靶點發(fā)揮作用的可能性越大。根據2 倍Degree 值（12），得到核心靶點有11 個，見表1，相互作用關系，見圖3。

表1 核心靶點信息

圖3 雷公藤治療PsA 的PPI

2.5 GO 和KEGG 功能富集分析 在DAVID 數據庫中對雷公藤和PsA 的共同靶點進行富集分析，P＜0.05 為篩選標準，結果顯示，與生物過程（BP）相關條目270 個，主要涉及維生素D 生物合成過程的正調控、突觸傳遞的負調節(jié)，多巴胺能、氮素利用的調節(jié)、神經膠質細胞增殖的調控等；與細胞成分（CC）相關條目29 個，主要涉及孔復合體、CD40 受體復合物、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、膜筏、細胞器膜等；與分子功能（MF）相關條目57 個，主要涉及前列腺素-內過氧化物合酶活性、維生素D 24-羥化酶活性、9-順式視黃酸受體活性、一氧化氮合酶活性、一氧化氮合酶調節(jié)劑活性等。以條形圖展示，見圖4。相同方法篩選KEGG 相關條目105 個，主要涉及癌癥的途徑、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路、Toll樣受體（TLR）信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路、NF-κB 信號通路等，選取前20 個以氣泡圖可視化，見圖5。

圖4 雷公藤治療PsA 的GO 富集分析

圖5 雷公藤治療PsA 的KEGG 富集分析

2.6 分子對接結果 根據度值選取山奈酚和雷公藤甲素與靶點二聚體轉錄因子（JUN）、腫瘤壞死因子（TNF）進行分子對接，結果顯示結合能均為負值，表明受體與配體可以自發(fā)結合，能量＜-5 kcal/mol，提示二者之間有較強的結合活性，見表2，分子對接結果，見圖6。

表2 活性成分與靶點受體蛋白間的結合能

圖6 雷公藤治療PsA 分子對接結果

3 討論

關節(jié)病型銀屑病，皮膚表現(xiàn)在中醫(yī)上屬于“白疕”范疇，關節(jié)表現(xiàn)在中醫(yī)上屬于“歷節(jié)病”、“痹證”等范疇。致病原因多由機體陰陽失調，外邪侵襲所致。PsA 治療的目的在于緩解疼痛和延緩關節(jié)進一步的破壞，同時兼顧治療關節(jié)炎和銀屑病皮損。傳統(tǒng)中藥雷公藤，味苦，有大毒，有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結等功效，藥理研究證實，雷公藤有抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)等多種藥理活性[6]。Zhao 等[7]研究表明雷公藤通過抑制信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）磷酸化而抑制輔助性T 細胞17（Th17）功能，可明顯改善由咪喹莫特誘導的皮膚損傷。

本研究運用網絡藥理學的方法得到雷公藤治療PsA 的關鍵活性成分有山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素和豆甾醇等，以上活性成分可能是雷公藤治療PsA 的物質基礎。山奈酚是天然的黃酮類化合物，有抗氧化、抗癌、抗炎等多種生物學活性[8-9]。Liu等[10]觀察山奈酚能夠降低銀屑病型小鼠CD3+T 細胞的浸潤，下調皮膚中的促炎性核轉錄因子κB（NFκB）的信號傳導，在體外抑制T 細胞的增殖及絲氨酸蛋白激酶（mTOR）信號轉導。β-谷甾醇屬于植物甾醇的一種，有多種藥理活性，有研究表明其在抗氧化、抗高血脂、抗炎和免疫調節(jié)等方面有諸多藥理作用[11-12]。雷公藤甲素是中藥雷公藤的主要活性成分之一，有免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等生物活性[13]。有研究表明，雷公藤甲素對銀屑病有明顯改善作用[14]。豆甾醇是一種植物甾醇，營養(yǎng)價值高，生物活性強，有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降低膽固醇和改善記憶等生物活性[15]。

根據雷公藤蛋白互作網絡圖分析，雷公藤治療PsA 的核心靶點有：STAT3、TNF、JUN、絲氨酸蛋白激活酶1（AKT1）、絲氨酸/蘇氨酸激酶14、8（MAPK14、MAPK8）、人源重組蛋白（RELA）、TP53 基因、趨化因子8（CXCL8）、血管內皮生長因子（VEGFA）、核蛋白轉錄因子（FOS）。STAT3 為STAT 家族的一員，STAT3 的激活是由多種細胞因子和生長因子引起的，在成熟的吞噬細胞中，STAT3 抑制TLR 信號轉導而抑制炎性反應[16]。TNF 超家族通路在細胞增殖、存活和死亡中起重要作用[17]。JUN 是一種二聚體轉錄因子，由c-JUN，c-Fos，和ATF 家族的蛋白質組成，TRPV1 刺激的細胞內功能依賴于刺激調節(jié)蛋白激酶和刺激反應性轉錄因子的激活[18]。AKT1 是AKT 在響應生長因子和其他細胞外刺激的信號通路中起著調節(jié)細胞功能的作用，包括營養(yǎng)代謝、細胞生長、細胞凋亡和存活[19]。MAPK 屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的大家庭，MAPK14 和MAPK8 屬于其中一員，主要構成了從細胞表面到細胞核的炎性反應信號通路[20]。RELA 是NF-κB 的關鍵成員，對炎性反應環(huán)境至關重要[21]。據國外研究報告，磷酸二酯酶4 能抑制磷酸化的NF-κB 亞基p65 的易位，促進細胞核周期蛋白D1 積累的丟失和細胞周期抑制劑p21 的增加，依那西普能夠使銀屑病患者皮損磷酸化的RELA 顯著下調，與表皮厚度減少，角質形成細胞分化相關[22-23]。研究顯示VEGF 在關節(jié)病型銀屑病患者中，其水平與紅細胞沉降率（ESR）、健康評估問卷殘疾指數（HAQ）、銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）和視覺模擬評分法（VAS）呈正相關[24]。CXCL8 屬于與血小板因子4 類似的結構相關的小型細胞因子家族，由吞噬細胞和間質細胞暴露于炎性刺激產生，并激活嗜中性白細胞誘導趨化性。

GO 功能富集分析顯示，雷公藤治療PsA 的基因功能主要體現(xiàn)在鐵對翻譯起始的正調控、維生素D 生物合成過程的正調控、神經膠質細胞增殖的調控、降鈣素1-單加氧酶活性的正調控等；孔復合體、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、膜筏、細胞器膜、核染色質等；前列腺素-內過氧化物合酶活性、維生素D 24-羥化酶活性、精氨酸結合、CCR5 趨化因子受體結合等。

KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，雷公藤活性成分治療PsA 的主要信號通路有：癌癥的途徑、TNF信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll 樣受體（TLR）信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路和NFκB 信號通路等。銀屑病可能與患癌癥的風險增加有關，與沒有銀屑病的患者比較，接受銀屑病治療的患者死于惡性腫瘤的風險增加41%[25]。TNF 及其超家族成員可以促進免疫細胞活性，限制炎性因子，TNF 阻滯劑在關節(jié)病型銀屑病中可有效抑制炎性反應和減輕癥狀[26]。Chimenti 等[27]觀察到賽妥珠單抗有效抑制人皮膚微血管內皮細胞血管生成黏附分子的表達，減少人皮膚微血管內皮細胞血管生成趨化因子的分泌，治療關節(jié)病型銀屑病效果明顯。有國外報告顯示，IL-9、IL-22 誘導的T 細胞增殖依賴于PI3K-Akt 通路，調節(jié)促炎因子[28-29]。TLR家族成員TLR7 和TIL8 拮抗劑對銀屑病的治療有較理想效果[30]。MAPK 激酶構成了3 個重要信號通路，p38，JNK，控制細胞增殖、分化，基因表達和細胞凋亡。表皮的廣泛增殖失衡導致銀屑病的發(fā)生[31]。Lories 等[32]報告顯示依那西普治療關節(jié)病型銀屑病可導致NF-κB，JNK 和ERK 顯著降低，但p38 激酶不會降低。

綜上，雷公藤通過多基因、多通路、多靶點發(fā)揮治療關節(jié)病型銀屑病的作用，這與中藥治療疾病多靶點、多途徑的特點是一致的。本研究利用網絡藥理學方法，系統(tǒng)分析了雷公藤治療關節(jié)病型銀屑病可能的作用機制，以期為中藥新藥的篩選和開發(fā)提供思路和方法。