沙眼衣原體質(zhì)粒編碼蛋白3 的致病性及免疫保護(hù)性研究

鄧晗，程瑞琴，陳土地，宋雅欣，梁銀迎，李平露，趙婉星，馬璟玥，王惠平，侯淑萍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052；2.天津河西區(qū)瑞普眼科醫(yī)院，天津 300204）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性致病菌，是性傳播疾病的主要原因之一[1]。據(jù)估計(jì)全球每年有1.27 億人感染CT，CT 已成為世界性的公共衛(wèi)生問題[2]。CT 根據(jù)主要外膜蛋白（Major outer membrane protein，MOMP）變化分為多種血清型，血清A～C 型可引起沙眼、致盲；血清D～K 型可引起性傳播疾病，并可導(dǎo)致不孕癥、異位妊娠和盆腔炎等并發(fā)癥；血清L1～L3 可從生殖道擴(kuò)散至淋巴系統(tǒng)，導(dǎo)致性病性淋巴肉芽腫[3]，其中L2 型進(jìn)一步被分為L2a、L2b 型，且L2b 型在男性行為者中高度流行[4]。

CT 含有1 個(gè)長度約為7.5 kb 的隱性質(zhì)粒，編碼8 個(gè)開放閱讀框，通常稱為質(zhì)粒編碼蛋白1-8（Pgp1-8），不同質(zhì)粒蛋白在其生命周期和致病機(jī)制中發(fā)揮不同的作用[5]。Pgp3 是唯一分泌到宿主胞質(zhì)中的質(zhì)粒編碼蛋白，已被鑒定為CT 感染的關(guān)鍵毒力蛋白之一[6]。Pgp3 是一種穩(wěn)定的三聚體，通過其M段與人抗菌肽多肽-37（LL-37）結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而抑制LL-37 的抗衣原體活性[7]，并利用LL-37 增強(qiáng)其自身的促炎活性發(fā)揮致病作用[8]。另外，CT 為了維持其胞內(nèi)生存周期，通過多種途徑來改善宿主細(xì)胞的生存狀態(tài)，其中抑制細(xì)胞凋亡是CT 延長宿主細(xì)胞壽命的重要策略之一。有研究表明，Pgp3 可通過上調(diào)帕金森病蛋白（DJ-1）表達(dá)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK 1/2）信號(hào)通路來抑制宿主細(xì)胞凋亡[9]，還可能通過激活核因子相關(guān)因子2/醌氧化還原酶（Nrf2/NQO1）信號(hào)通路調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，其誘導(dǎo)的抗氧化作用促進(jìn)CT 的傳染性[10]。Pgp3 是衣原體優(yōu)勢(shì)抗原，有研究表明，Pgp3 DNA 疫苗可以抑制D 型CT 感染并且產(chǎn)生免疫保護(hù)作用[11]；重組D 型Pgp3 蛋白疫苗能抑制鼠肺炎衣原體（Chlamydia muridarum，CM）上行感染，減少輸卵管積水的發(fā)生[12]。

本課題組前期的研究表明，L2 構(gòu)建株（GFP）Pgp3 蛋白表達(dá)水平高于L2 野生株（WT），其余蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外L2 型CT 與D型CT 在小鼠體內(nèi)致病性相似，且L2 型CT 體外更易培養(yǎng)，因此本研究將L2 GFP 作為研究對(duì)象，旨在探索內(nèi)源性Pgp3 的致病性及免疫保護(hù)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細(xì)胞株和菌株 Hela 細(xì)胞株和人輸卵管上皮細(xì)胞株保存于天津市性傳播疾病研究所；L929 細(xì)胞株、L929-Pgp3 細(xì)胞株（轉(zhuǎn)染Pgp3 的L929 細(xì)胞）、L2 GFP、L2 WT 和L2 PF 菌株均由美國德克薩斯大學(xué)圣安東尼奧健康科學(xué)中心鐘光明教授提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗CT 抗體購自美國Bio-Rad 公司；鼠抗Pgp3mAb 和MOMPmAb 實(shí)驗(yàn)室保存；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白（IgG）和Alexa Fluor 594 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自中山金橋公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自美國Abcam 公司；4’，6-聯(lián)脒-2’-苯基吲哚（DAPI）及二苯甲亞胺（Hoechest）33258購自北京索萊寶公司；磷脂結(jié)合蛋白標(biāo)記的藻紅蛋白（PE-Annexin V）細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國BD 公司；組氨酸標(biāo)記的Pgp3（His-Pgp3）蛋白購自北京愛必信生物技術(shù)有限公司；胎牛血清及DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；熒光顯微鏡購自德國蔡司公司，化學(xué)發(fā)光成像儀購自美國伯樂公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.1.3 小鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 5～6 周齡雌性無特定病原（SPF）級(jí)C3H 小鼠購于北京華阜康生物科技有限公司[質(zhì)量合格編號(hào)：SCXK（京）2019-0008]，飼養(yǎng)于天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司空港分公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK2021-0004），按照實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分5 組，每組5 只，包括感染組：L2 GFP組、L2 WT 組、L2 PF 組；攻毒組：L2 GFP 組和L2 WT組。倫理編號(hào)：IRB2022-DWFL-129。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及CT 培養(yǎng) 將1×105個(gè)/mL Hela細(xì)胞、L929 細(xì)胞和L929-Pgp3 細(xì)胞接種至24 孔板，待細(xì)胞生長密度至80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基。30 μg/mL的二乙氨乙基葡聚糖（DEAE-D）液處理30 min，換不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，將各菌株接種于24孔板，細(xì)胞孵箱放置1 h，32 ℃，離心半徑為7.6 cm，1 500 r/min 離心1 h，更換含10%胎牛血清和放線菌酮（終濃度為1 μg/mL）的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 Pgp3 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）測(cè)定L2 GFP、WT 和PF 中Pgp3蛋白表達(dá)。各菌株按照上述方法感染Hela 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 和44 h 時(shí)分別收集細(xì)胞，4 ℃，離心半徑為9.8 cm，10 000 r/min 離心5 min，取上清經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入鼠抗Pgp3mAb 和MOMPmAb，4 ℃孵育過夜后，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37 ℃下孵育1 h，洗膜顯色。

間接免疫熒光法（IFA）檢測(cè)L2 GFP、WT 和PF菌株中Pgp3 蛋白的表達(dá)。各菌株感染Hela 細(xì)胞36 h后經(jīng)預(yù)冷的4%多聚甲醛固定，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）室溫處理10 min，PBS 洗滌3 次；用含10%胎牛血清的DMEM 封閉處理1 h；兔抗CT（1∶2 000 稀釋）和鼠抗Pgp3mAb（1∶2 000 稀釋）Ⅰ抗37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌3 次后加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（綠色，1∶300 稀釋）、Alexa Fluor 594 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（紅色，1∶300 稀釋）Ⅱ抗和DAPI 染色，37 ℃避光孵育1 h；PBS 洗滌3 次，在熒光顯微鏡下觀察Pgp3 表達(dá)。

1.2.3 小鼠生殖道L2 感染模型建立 C3H 小鼠在感染前5 d 皮下注射2.5 mg 孕酮，以促進(jìn)小鼠對(duì)CT的易感性，將2×105包涵體形成單位（IFU）的菌株懸浮于10 μL 蔗糖-磷酸-谷氨酸（SPG）緩沖液中，經(jīng)陰道接種于小鼠下生殖道。每隔3 d 或7 d 用醫(yī)用拭子收集陰道脫落細(xì)胞，每個(gè)拭子浸入500 μL 冷蔗糖-磷酸-谷氨酸（SPG）中，玻璃珠渦旋振蕩并稀釋，接種到單層HeLa 細(xì)胞中，經(jīng)IFA 計(jì)算IFU 數(shù)量，并以Log10 表示。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) His-Pgp3 刺激人輸卵管上皮細(xì)胞24 h 后固定細(xì)胞，每孔加入200 μL 二苯甲亞胺（Hoechest）33258，避光染色5 min 后用PBS 清洗，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。接種人輸卵管上皮細(xì)胞的24 孔板，加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，50 μg/mL 的His-Pgp3 刺激細(xì)胞，放入孵箱培養(yǎng)24 h 后胰酶消化收集細(xì)胞，加入100 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中避光加入5 μL PE Annexin V 和5 μL 7-氨基放線菌素（7-ADD），染色15 min 后加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，1 h 內(nèi)流式上機(jī)檢測(cè)凋亡情況。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)IFU 和細(xì)胞核 將拭子收集的小鼠陰道脫落細(xì)胞接種至Hela 細(xì)胞，36 h 后Hela 細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的4%多聚甲醛固定，PBS 洗滌3次，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）室溫處理10 min，PBS 洗滌3 次；用含10%胎牛血清的DMEM 封閉處理1 h；兔抗CT Ⅰ抗（1∶2 000 稀釋）37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌3 次后加入FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG Ⅱ抗（綠色，1∶300 稀釋）和DAPI 染色，37 ℃避光孵育1 h；PBS 洗滌3 次，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)包涵體數(shù)量。L929 和L929-Pgp3 細(xì)胞感染L2 WT后，按照上述方法分別在30、60 和80 h 固定細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞核和IFU 數(shù)量。

1.2.6 內(nèi)源性Pgp3 免疫保護(hù)性檢測(cè) 以2×105IFU的L2 GFP 和WT 經(jīng)陰道感染小鼠，每隔3 d 或7 d測(cè)定下生殖道IFU 數(shù)量。感染50 d 后，以1×106IFU的L2 WT 菌株再次攻毒小鼠，攻毒后在不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)估小鼠下生殖道IFU 數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素ANOVA 方法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 L2 GFP Pgp3 表達(dá)水平高于L2 WT 和PF L2 GFP、WT、和PF 菌株分別感染Hela 細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白做Western blotting 分析，結(jié)果顯示：在不同時(shí)間點(diǎn)，L2 GFP 和WT 均在28 ku（Pgp3）出現(xiàn)條帶，L2 PF 則無條帶顯示，且L2 GFP 菌株P(guān)gp3 蛋白表達(dá)水平始終高于L2 WT 菌株，見圖1A。L2 GFP、WT和PF 菌株感染Hela 細(xì)胞36 h 后熒光染色，結(jié)果顯示：L2 GFP 比L2 WT 表達(dá)更多Pgp3 蛋白而L2 PF無Pgp3 蛋白表達(dá)，見圖1B，這與Western blotting 結(jié)果一致。

圖1 不同L2 菌株P(guān)gp3 表達(dá)情況

2.2 小鼠下生殖道L2GFP感染力高于WT 和PF 將等量L2 GFP、WT 和PF 經(jīng)陰道感染C3H/HeJ 小鼠，不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)估各菌株在小鼠下生殖道的生長增殖情況。結(jié)果顯示：在感染后第3、7、10 和14 天，L2 GFP組生殖道載菌量始終高于L2 WT 和PF 組；L2 WT和PF 組在下生殖道感染持續(xù)時(shí)間明顯短于L2 GFP組，L2 GFP 組感染時(shí)間持續(xù)至第35 天，L2 PF 組持續(xù)到第10 天，L2 WT 組感染時(shí)間持續(xù)至第14 天，見圖2。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)小鼠下生殖道感染情況

2.3 Pgp3 抑制宿主細(xì)胞凋亡并促進(jìn)CT 在細(xì)胞間播散感染 重組的His-Pgp3 刺激人輸卵管上皮細(xì)胞24 h，Hoechst 33258 染色，見圖3A，及流式細(xì)胞術(shù)，見圖3B，均顯示Pgp3 刺激組細(xì)胞凋亡率低于空白組（P＜0.05），見圖3C；在熒光顯微鏡下觀察CT 包涵體及宿主細(xì)胞核并計(jì)數(shù)，見圖4A，感染后30 h，L929-Pgp3 與L929 細(xì)胞中IFU 數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；感染后60 h 和80 h，L929-Pgp3 細(xì)胞中IFU高于L929 細(xì)胞中包涵體數(shù)量（P＜0.05，P＜0.01），見圖4B，且在L929-Pgp3 細(xì)胞中CT 形成子代感染并產(chǎn)生較大菌斑；感染后80 h，L929-Pgp3 細(xì)胞中宿主細(xì)胞消亡數(shù)量顯著低于L929 細(xì)胞（P＜0.000 1），見圖4C。表明外源性和內(nèi)源性Pgp3 均可抑制宿主細(xì)胞凋亡且內(nèi)源性Pgp3 可促進(jìn)CT 在細(xì)胞間的播散感染。

圖3 外源性Pgp3 刺激細(xì)胞凋亡情況

圖4 L2 WT 菌株感染L929 和L929-Pgp3 細(xì)胞情況

2.4 內(nèi)源性Pgp3 蛋白免疫保護(hù)性評(píng)估 小鼠感染L2 GFP 和WT 50 d 后，經(jīng)L2 WT 攻毒，攻毒后第3 天，L2 GFP 組小鼠生殖道IFU 數(shù)量顯著低于L2 WT 組，且L2 GFP 組感染周期明顯短于L2 WT 組，L2 GFP組僅在第3 天培養(yǎng)陽性，而L2 WT 組感染持續(xù)至第14 天，見圖5。

圖5 再次攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠下生殖道感染情況

3 討論

L2 GFP 菌株是將重組的GFP 標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到L2 PF 菌株，理論上，除表達(dá)綠色熒光外，L2 GFP與L2 WT 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但課題組前期研究顯示，L2 GFP 中Pgp3 蛋白表達(dá)水平高于L2 WT，但其他質(zhì)粒編碼蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。

CT 感染往往傾向于持續(xù)性，且Pgp3 在CT 持續(xù)感染中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]；PF[15]以及Pgp3 無效突變株[16]在小鼠生殖道感染模型中均表現(xiàn)出減弱的感染能力，且誘導(dǎo)輸卵管積水以及炎性浸潤的能力高度減弱，這與筆者的研究結(jié)果相似，L2 GFP 菌株因表達(dá)更多Pgp3 在小鼠下生殖道持續(xù)感染時(shí)間顯著長于其他菌株。CT 為在宿主體內(nèi)持續(xù)感染，必須調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。因此，CT 可通過多種機(jī)制抑制宿主凋亡，如可能通過激活磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDPK1-MYC）和增強(qiáng)己糖激酶Ⅱ的線粒體結(jié)合[17]以及可能通過絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（MAPK/ERK）生存途徑誘導(dǎo)抗凋亡蛋白基因（Bag-1）[18]來抑制宿主細(xì)胞凋亡。Pgp3 作為CT持續(xù)感染的重要毒力因子也有抑制宿主細(xì)胞凋亡作用，已有研究表明Pgp3 可能通過磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶（PI3K-AKT）介導(dǎo)的鼠雙微體基因2-p53（MDM2-p53）軸[19]以及可能通過增強(qiáng)抗凋亡蛋白（Bcl-2）降低胱天蛋白酶-3（Caspase-3）和促凋亡蛋白（Bax）的表達(dá)來抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。為研究Pgp3 抗凋亡作用，本研究將重組Pgp3 體外刺激人輸卵管上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示干預(yù)組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組；進(jìn)一步選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Pgp3 的L929 細(xì)胞，在感染L2 WT 80 h后，筆者認(rèn)為L929-Pgp3 細(xì)胞消亡數(shù)量顯著低于對(duì)照組，說明外源性Pgp3 和內(nèi)源性Pgp3 均可抑制宿主細(xì)胞凋亡。

Pgp3 在宿主體內(nèi)有促進(jìn)衣原體播散感染的作用。衣原體可從下生殖道通過宮頸屏障進(jìn)入子宮內(nèi)膜腔，再通過子宮輸卵管連接處進(jìn)入輸卵管，誘導(dǎo)輸卵管積水，因此上行感染輸卵管需要衣原體通過細(xì)胞裂解從一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)散到另一個(gè)細(xì)胞[21]。有研究顯示Pgp3 缺失的CM 株不能從生殖道播散到胃腸道[22]。課題組前期的研究表明Pgp3 在體外可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的吞噬功能，這可能有助于CT 在宿主體內(nèi)的播散感染[23]。本研究顯示在感染L2 WT 的L929-Pgp3 細(xì)胞中，CT 包涵體數(shù)量顯著高于L929 細(xì)胞組，且在感染后期形成較大的菌斑，提示內(nèi)源性Pgp3 可促進(jìn)CT 在細(xì)胞間播散感染。

CT 有許多免疫性蛋白，如多態(tài)膜蛋白（Pmps）、MOMP 和衣原體蛋白酶樣活性因子（CPAF），均被選為優(yōu)勢(shì)抗原[24-26]。目前CT 疫苗研究大多數(shù)集中在CT MOMP 上，但有研究表明單獨(dú)使用MOMP 應(yīng)用于衣原體感染的動(dòng)物模型中，效果欠佳，需要有效的載體傳遞系統(tǒng)或者高效的佐劑來輔助免疫應(yīng)答[27]。Pgp3 是CT 一種分泌型蛋白，有良好的免疫原性[28]，已有研究表明小鼠接種重組的Pgp3 蛋白，其血清可產(chǎn)生針對(duì)Pgp3 的特異性IgG 抗體，以及輔助型T細(xì)胞1（Th1）免疫反應(yīng)，如產(chǎn)生干擾素-γ（IFN-γ）[12]。有研究表明，使用鼠衣原體WT 免疫小鼠，56 d 后WT 再次攻毒小鼠生殖道，發(fā)現(xiàn)WT 可誘導(dǎo)小鼠生殖道產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，且衣原體感染周期較前縮短[29]。為了探究內(nèi)源性Pgp3 的免疫保護(hù)作用，本研究用L2 WT 攻毒小鼠，發(fā)現(xiàn)L2 GFP 組小鼠生殖道衣原體的載菌量比L2 WT 組的載菌量低，且L2 GFP 組感染周期比L2 WT 組感染周期更短，提示內(nèi)源性的Pgp3 可誘發(fā)較好的免疫保護(hù)作用。因此內(nèi)源性Pgp3 是否可作為潛在疫苗的研究對(duì)象呢？在之后的小鼠感染模型中，應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)小鼠血清的抗體水平及各種細(xì)胞因子水平，明確內(nèi)源性Pgp3是如何產(chǎn)生免疫保護(hù)機(jī)制，為衣原體的疫苗研發(fā)提供更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。另外，Pgp3 可以促進(jìn)CT 的傳播，造成CT 的持續(xù)感染，那么Pgp3 在小鼠體內(nèi)通過何種途徑促進(jìn)CT 的感染呢？在之后的研究中，不僅要評(píng)估小鼠下生殖道的衣原體載量，還要評(píng)估輸卵管的衣原體載量及其病理變化，進(jìn)一步闡明Pgp3 促進(jìn)CT 感染的致病機(jī)制，為衣原體疾病的預(yù)防及治療提供新的思路和策略。

綜上所述，本研究探索了CT Pgp3 的致病性及免疫保護(hù)性，通過研究確定了Pgp3 抑制宿主凋亡及促進(jìn)CT 在細(xì)胞間播散感染，且內(nèi)源性Pgp3 蛋白有良好的免疫保護(hù)性。