黃皮新肉桂酰胺B的小鼠降脂活性及毒副作用

陳丹妮，王賽男，尹朝春，許澤文，郭曉敏，李康瑗，王嘉煒，陳立平，曹 庸，肖蘇堯,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.華潤怡寶飲料（中國）有限公司，廣東 深圳 518055）

肥胖是能量消耗與熱量攝入之間的失衡，是導(dǎo)致II型糖尿病和心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險因素[1]。肥胖與機體脂質(zhì)積累有關(guān)，一旦機體中脂質(zhì)獲取過多而分解不完全則會導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂和血漿膽固醇偏高[2]，長期積累可能導(dǎo)致高脂血癥、脂肪肝、腦動脈硬化和II型糖尿病等多種慢性疾病[3]。在肝臟中，脂質(zhì)蓄積與胰島素抵抗的發(fā)展有關(guān)，胰島素抵抗是II型糖尿病的早期標(biāo)志[4]。臨床上減肥降脂常用藥物是奧利司他、芬特明-托吡酯等，但長期攝入藥物會產(chǎn)生一定副作用，如攝入奧利司他會導(dǎo)致胃腸道紊亂[5]，服用芬特明-托吡酯會導(dǎo)致心率加快[6]。眾多研究表明，植物天然活性物質(zhì)如多酚、生物堿、多糖等具有一定的減肥降脂功效，能夠顯著降低體質(zhì)量和血脂水平，調(diào)節(jié)胰島素抵抗和脂肪合成代謝以及改善腸道菌群紊亂[7]。因此利用天然產(chǎn)物活性物質(zhì)對肥胖高脂相關(guān)疾病進行治療干預(yù)是藥食同源物質(zhì)綜合醫(yī)學(xué)上的一項重大突破。

黃皮被譽為“嶺南佳果”，含有酰胺、多酚等多種生物活性物質(zhì)。黃皮新肉桂酰胺B（lansiumamide B，LB）是從雞心黃皮果核中提取得到的一種酰胺類化合物，約占果核干質(zhì)量的千分之一，含量極為豐富[8]，且具有較強生物活性功能[9]，如能夠顯著抑制酪氨酸酶[10]、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶[11]的活性。據(jù)報道，LB對胰脂肪酶具有明顯抑制效果，還發(fā)現(xiàn)LB能夠顯著降低油酸誘導(dǎo)后HepG2細(xì)胞中的血脂水平和肝功能關(guān)鍵酶活力，該研究表明LB具有較好的降血脂功效[12]。但目前針對LB降血脂活性的相關(guān)動物模型研究較少，因此對于LB的動物體內(nèi)毒副作用及降血脂活性的進一步探究具有重要研究意義，為開發(fā)其成為天然降脂藥物提供理論依據(jù)。

經(jīng)口急性毒性實驗是評價物質(zhì)毒性作用的基本實驗，探究物質(zhì)24 h內(nèi)一次或多次經(jīng)口給藥后在7 d內(nèi)的毒性表現(xiàn)及死亡數(shù)量。英國毒理學(xué)會于1989年發(fā)表聲明：急性毒性實驗不再完全以動物死亡為終點，而是以“表現(xiàn)嚴(yán)重中毒，如再升高劑量則將會死亡”的效應(yīng)為實驗評價的依據(jù)[12]，因此可依據(jù)無可見有害作用水平（no observed adverse effect level，NOAEL）作為進一步實驗劑量的選擇，NOAEL是在規(guī)定實驗條件下未觀察到任何與給藥物質(zhì)有關(guān)的毒性作用的最大染毒劑量[13]。亞慢性毒性實驗是監(jiān)測實驗動物連續(xù)多日接觸大劑量給藥物質(zhì)出現(xiàn)的中毒效應(yīng)[14]。因此本研究通過經(jīng)口急性毒性實驗得到LB的NOAEL，并以該水平作為降脂實驗藥物劑量，采用C57BL/6J小鼠建立高脂飲食模型，基于動物模型較系統(tǒng)地研究LB的降血脂活性，為其廣泛應(yīng)用提供進一步安全性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2019-0048，動物實驗及操作按照歐盟制定的實驗動物保護指導(dǎo)原則，經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心倫理委員會批準(zhǔn)后開展（倫理申請?zhí)枺?021b189）。小鼠飼養(yǎng)在SPF級動物房，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%，12 h/12 h晝夜光照循環(huán)（自動照明7:00—19:00），飼養(yǎng)過程中嚴(yán)格保持環(huán)境清潔，所有小鼠均自由采食和飲水。使用健康SPF級C57BL/6J小鼠，其中藥物急性毒性實驗組為8 周齡雄性小鼠12 只，體質(zhì)量（30.0±1.0）g；高脂實驗組為4 周齡雄性小鼠60 只，體質(zhì)量（17.0±2.0）g；均購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心（實驗動物合格證明編號：44007200098041）。小鼠生長專用飼料由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心提供，高脂飼料購于美國Research Diets公司，飼料主要高脂成分：豬油245 g/kg、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%、能量21.93 kJ/g。

LB（純度98.7%）實驗室自行分離純化；中鏈甘油三酯（medium chain triglyceride，MCT）上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（glucose，Glu）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、丙二醛（mondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力測定試劑盒以及小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；多聚甲醛 北京雷根生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、氯化鈉、鹽酸等（均為分析純）廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Enspire 2300多功能酶標(biāo)儀 美國PerkinElmer公司；5415R低溫高速離心機 德國Eppendorf生命科學(xué)公司；SXL-1008T馬弗爐 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；220FS火焰原子吸收分光光度計 德國耶拿分析儀器公司；ME204分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CX 41光學(xué)顯微鏡 廣州市明美光電技術(shù)有限公司；JXFSTPR-32全自動樣品快速研磨儀上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LB急性毒性實驗

分別稱取20、200 mg LB，加入2 mL MCT，超聲10 min輔助溶解，配制成10、100 mg/mL的LB溶液。將小鼠分為2 組，按0.2 mL/10 gmb（即LB劑量200 mg/kgmb和2 g/kgmb）灌胃1 次后，連續(xù)觀察7 d記錄小鼠臨床表現(xiàn)及死亡情況，得到LB的NOAEL。

1.3.2 C57BL/6小鼠高脂飲食模型建立

將60 只C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機分為5 組：正常對照（normal control，NC）組、高脂飲食模型（high fat diet，HFD）組、LB低劑量（LLB）組（20 mg/kgmb，即1/100 NOAEL）、LB中劑量（MLB）組（40 mg/kgmb，即1/50 NOAEL）以及LB高劑量（HLB）組（80 mg/kgmb，即1/25 NOAEL），每組12 只。根據(jù)1.3.1節(jié)方法分別配制1、2、4 mg/mL的LB溶液，按0.2 mL/10 gmb對小鼠進行灌胃。NC組采用小鼠生長專用飼料，HFD組和LB藥物組采用高脂飼料飼養(yǎng)，造模8 周后，LB藥物組灌胃給藥4 周，NC組和HFD組均給予等體積藥物溶劑MCT，實驗總周期為12 周。自由飲水，每日更換墊料及飼料。

1.3.3 小鼠臨床表現(xiàn)觀察

給藥期間，每天灌胃藥物并更換飲水和飼料，觀察記錄其表觀變化并稱水和飼料質(zhì)量；每隔3 d測量小鼠體質(zhì)量，記錄活躍程度、攀爬能力、進食狀況和被毛光滑程度等臨床表現(xiàn)。

1.3.4 小鼠臟器指數(shù)測定

實驗結(jié)束后，采用吸入式麻醉方法，將小鼠置于呼吸箱后通入一定量CO2氣體麻醉，之后對小鼠進行心臟體外穿刺取血。取血后迅速解剖，取出心、肝、脾、肺、腎、腦等主要器官并稱其質(zhì)量，臟器系數(shù)和Lee’s指數(shù)分別按式（1）、（2）計算。

式中：m1為臟器質(zhì)量/g；m為小鼠體質(zhì)量/g；L為小鼠體長/cm。

1.3.5 機體指標(biāo)測定

口服葡萄糖耐量測定：灌胃給藥第3周末，對小鼠進行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）。小鼠禁食不禁水12 h后，尾靜脈取血，檢測小鼠基礎(chǔ)血糖水平，然后按2 g/kgmb灌胃葡萄糖溶液。分別在灌胃后30、60、90、120 min采集小鼠靜脈血樣本，測定血糖水平，并計算OGTT曲線下面積（area under the curve，AUC）。胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）按式（3）計算。

血樣制備：將血樣于低溫高速離心機（4 ℃、10 000 r/min）離心15 min，分離取上層血清用于后續(xù)實驗，避免反復(fù)凍融。肝臟勻漿制備：稱取50 mg肝臟組織，加入450 μL 0.9 g/100 mL生理鹽水低溫研磨后于低溫高速離心機（4 ℃、10 000 r/min ）離心15 min后吸取上清液用于后續(xù)實驗。利用試劑盒，按相應(yīng)操作說明測定血清和肝臟勻漿蛋白濃度、TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、CAT、MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.3.6 組織切片觀察

稱量肝臟組織、測量結(jié)腸長度后，將肝臟組織和結(jié)腸切取適宜大小，迅速置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，制備組織石蠟切片，再使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）進行染色，在400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)，從而評價其組織病理學(xué)變化情況。

1.3.7 骨性能指標(biāo)測定

降脂實驗結(jié)束后，用直尺對麻醉后的小鼠進行測量，得到小鼠體長（H）；剖離小鼠雙腿肌肉組織和筋膜組織，分別取出股骨和脛骨：1）骨長和骨徑：用直尺測量剖解后的骨骼，得到骨長和骨徑；2）骨骼濕質(zhì)量、干質(zhì)量及骨骼指數(shù)：稱量剖解后的股骨和脛骨質(zhì)量，得到骨骼濕質(zhì)量，之后將骨骼于100 ℃干燥12 h后，用乙醇-苯（2∶1，V/V）浸泡96 h，經(jīng)105 ℃烘干至恒質(zhì)量，得到脫脂后的骨骼干質(zhì)量（m2），按式（4）計算骨骼指數(shù)；3）骨骼灰分與鈣含量：脫脂脛骨樣品在550 ℃馬弗爐中燃燒處理16 h，將灼燒得到的骨骼灰分用研缽充分研磨得到灰分粉末，混勻后稱質(zhì)量即為骨骼灰分質(zhì)量；將灼燒所得的骨骼灰分用6 mol/L HCl溶解，于容量瓶中定容至100 mL[15]，用火焰原子吸收分光光度計測定骨骼灰分中鈣含量[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗至少進行3 次獨立重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，t檢驗比較2 組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計學(xué)差異，單因素方差分析比較多組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05表明組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。用GraphPad Prism 8.0、Origin 2023軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LB的經(jīng)口急性毒性結(jié)果

將LB以200 mg/kgmb和2 g/kgmb的劑量分別灌胃小鼠后，觀察7 d內(nèi)小鼠情況。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，灌胃LB后小鼠均狀態(tài)良好，2 組小鼠灌胃一次后在7 d觀察期間均行為正常、被毛光滑、未見明顯中毒癥狀及死亡，由此可以初步判斷LB的NOAEL為2 g/kgmb。

2.2 LB對小鼠生長發(fā)育的影響

經(jīng)觀察記錄，在整個灌胃給藥期間，5 組小鼠的精神狀態(tài)良好、未出現(xiàn)打架撕咬情況、皮膚富有彈性、被毛光滑明亮、食欲正常、運動情況較活躍、攀爬能力佳、沒有出現(xiàn)死亡情況。由圖1A、C可知，經(jīng)過8 周高脂飲食喂養(yǎng)造模后，HFD和LB給藥組與NC組之間的體質(zhì)量差異高度顯著（P＜0.001），4 組平均值比NC組提高23.68%，大于20%，即認(rèn)為高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型造模成功[17]；造模8 周后開始灌胃LB，給藥4 周后LB給藥組的體質(zhì)量均相較于HFD組下降，且差異顯著（P＜0.01，P＜0.001），其中HLB與HFD組相比體質(zhì)量下降15.51%（圖1B、D），接近NC組，說明LB能夠顯著減少高脂飲食帶來的體質(zhì)量上升。

圖1 實驗期間不同處理組小鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body mass of mice from different treatment groups during the experiment

由圖2A可知，高脂飲食的4 組小鼠攝食量低于NC組，差異高度顯著（P＜0.001）。由圖2B可知，高脂飲食的4 組小鼠能量攝入高于NC組，差異高度顯著（P＜0.001），可能是由于高脂飼料所含脂肪和熱量較高，而4 組高脂飼料喂養(yǎng)組間攝食量并無組間差異，表明LB并不通過抑制食欲從而起到降脂效果。Lee’s指數(shù)常用來評價小鼠肥胖程度，Lee’s指數(shù)越大，則肥胖程度越高[18]。由圖2C可知，HFD組的Lee’s指數(shù)比NC組增加6.70%，差異高度顯著（P＜0.001），而LB低、中、高劑量組的Lee’s指數(shù)比HFD組分別降低2.87%、3.20%、3.25%，表明LB可以顯著改善小鼠由于高脂飲食引起的肥胖（P＜0.05）；5 組小鼠的體長（圖2D）在組間無顯著差異，表明LB不會延緩小鼠的正常生長發(fā)育。綜合圖1、2結(jié)果可以初步判定LB攝入對小鼠正常發(fā)育無明顯毒副作用，具有一定的降脂活性且存在劑量依賴關(guān)系。

圖2 LB對小鼠攝食量（A）、能量攝入（B）、Lee’s指數(shù)（C）和體長（D）的影響Fig.2 Effect of LB on food intake (A),energy intake (B),Lee’s index (C) and body length (D) of mice from different groups

2.3 LB對小鼠臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)是毒理實驗常用指標(biāo)，在正常生理條件下比較穩(wěn)定，其變化可以體現(xiàn)藥物對小鼠生長的改變情況。臟器系數(shù)變大表示臟器充血、水腫等，反之則表示臟器出現(xiàn)萎縮亦或延緩發(fā)育等退行性變化[19]。由圖3可知，5 組小鼠的心臟、脾、肺和腎臟系數(shù)均無顯著差異，但HFD組肝臟、腦系數(shù)顯著低于NC組（P＜0.001，P＜0.05），可能是高脂飲食帶來的肥胖引起臟器萎縮。結(jié)果表明，LB對于小鼠除肝臟和腦以外的臟器組織正常發(fā)育沒有肥大或萎縮的不良影響[20]。

圖3 不同處理組小鼠的臟器系數(shù)Fig.3 Organ coefficients of mice from different treatment groups

2.4 LB對小鼠血脂4 項水平的影響

血脂水平可以直接反映機體的脂代謝變化，其中TG和TC是檢測血脂水平最靈敏的指標(biāo)[21]。由圖4A～C可知，HFD組小鼠血清TG、TC和LDL-C濃度分別是NC組的1.72、1.28、7.21 倍，表明小鼠存在顯著血脂代謝異?，F(xiàn)象[22]；與HFD組相比，經(jīng)給藥后，LB各劑量組小鼠血清TG、TC和LDL-C濃度均顯著下降，其中HLB組TG、TC和LDL-C濃度較HFD組分別降低30.05%、28.67%和65.81%。HDL-C可以通過清道夫B類I型受體和低密度脂蛋白受體的作用從體內(nèi)清除，促進膽固醇代謝，從而抑制膽固醇在血管壁的蓄積[23]。長期高脂飲食使血清HDL-C濃度降低，而灌胃LB后HLB組血清HDL-C濃度較HFD組高度顯著升高38.04%（P＜0.001）（圖4D）。以上結(jié)果表明，LB能夠有效改善由高脂飲食造成的血脂水平紊亂。

2.5 LB對小鼠肝臟脂質(zhì)沉積和肝功能的影響

由圖5A、B可知，LB給藥組肝臟TG、TC水平均高度顯著低于HFD組（P＜0.001）。肝臟脂質(zhì)過度沉積會導(dǎo)致其功能受損，當(dāng)肝細(xì)胞壞死時，ALT與AST會快速釋放到血液中，其上升水平和肝細(xì)胞損傷水平成正比，因此可依據(jù)二者水平判斷肝功能及其受損程度[24]。由圖5C、D可知，HFD組的ALT和AST活力分別是NC組的1.27、1.55 倍；與HFD組相比，LB給藥后ALT和AST活力均高度顯著降低（P＜0.001），其中HLB組的AST和ALT活力分別下降39.35%和42.40%。結(jié)果表明，LB能夠一定程度改善高脂飲食造成的肝損傷。

圖5 LB對小鼠肝臟TG（A）、TC（B）含量及血清ALT（C）、AST（D）活力的影響Fig.5 Effect of LB on the contents of TG (A),TC (B),and activity of ALT (C),AST (D) in liver tissues of mice

2.6 小鼠肝臟組織病理學(xué)切片觀察

肝臟是人體最大的代謝器官，肝毒性問題會造成藥物代謝障礙和肝臟損傷[25]。根據(jù)文獻切片結(jié)果比較判定，由圖6可知，NC組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整且大小正常[26]，細(xì)胞核大而圓，周圍未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤[27]，而HFD組肝臟組織中有大量明顯空泡，細(xì)胞核邊緣變得模糊[28]；LB給藥組肝臟空泡現(xiàn)象明顯，但隨LB劑量的增加而減輕，細(xì)胞核邊緣逐漸變得清晰，且HLB組接近于NC組，表明LB對小鼠肝臟無傷害且能夠有效抑制高脂飲食造成的肝臟組織空泡和炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象[29]。

圖6 不同處理組小鼠肝臟HE染色圖（400×）Fig.6 HE staining sections of liver tissues of mice in different treatment groups (400 ×)

2.7 LB對小鼠胰島素調(diào)節(jié)作用的影響

長期攝入高脂飲食會誘發(fā)機體胰島素抵抗，初期表現(xiàn)為胰島素敏感性，OGTT可以體現(xiàn)機體對血糖的調(diào)控能力[17]。由圖7A、B可知，在灌胃葡萄糖30 min后各組小鼠血糖濃度均急劇升高，其中HFD組小鼠血糖濃度相比NC組提高29.01%，AUC高度顯著大于NC組（P＜0.001），說明高脂飲食降低了機體對血糖的調(diào)節(jié)能力，造成糖代謝紊亂[30]。LB給藥組灌胃葡萄糖后30 min，LLB、MLB、HLB組OGTT血糖濃度最大值相較于HFD組分別降低14.97%、24.36%、24.97%。胰島素抵抗會造成血液中的葡萄糖進入細(xì)胞受阻，導(dǎo)致機體血糖水平上升，同時機體的代償性分泌又會使胰島素含量上升[31]。HFD組小鼠空腹血糖濃度（8.28 mmol/L）和胰島素水平（18.16 mIU/L）高度顯著高于NC組（P＜0.001），分別提高74.29%和84.66%，表明高脂飲食使小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗（圖7C、D）。由圖7E可知，HFD組的HOMA-IR為6.68，是NC組的2.25 倍；而與HFD組相比，3 組LB給藥后小鼠的空腹血糖濃度、空腹胰島素水平及HOMA-IR均顯著下降（圖7C～E），其中LLB組相比HFD組分別下降19.37%、15.09%、30.36%。上述結(jié)果表明，LB可以顯著改善由高脂飲食誘發(fā)的血糖調(diào)節(jié)能力下降和降低機體胰島素抵抗。

圖7 LB對小鼠OGTT及胰島素抵抗的影響Fig.7 Effect of LB on oral glucose tolerance and insulin resistance in mice

2.8 LB對小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，也是氧化應(yīng)激的重要生物標(biāo)志物[32]。CAT、SOD、GSH-Px通常用于評價機體的抗氧化能力，而MDA是氧自由基與脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的一種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物[33]，反映組織中自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度。正常情況下，機體具有較好的抗氧化應(yīng)激能力，CAT、SOD和GSH-Px活力相對較高，MDA含量則較低；而機體一旦受到損傷則相反。由圖8可知，與NC組相比，小鼠飼喂高脂飼料后，肝臟與血清中的CAT、SOD和GSH-Px活力均高度顯著降低（P＜0.001），MDA含量則高度顯著增高（P＜0.001），HFD組血清MDA含量較NC組提高82.72%。與HFD組相比，LB給藥后小鼠肝臟和血清中抗氧化酶活力顯著提高，其中，HLB組肝臟SOD、GSH-Px和CAT活力分別較HFD組提高41.86%、41.95%和105.50%，而MDA含量高度顯著降低（P＜0.001）。與HFD組相比，3 組給藥組的血清MDA含量分別下降20.21%、21.84%和25.87%，肝臟MDA含量則分別下降15.76%、22.58%、30.97%，表明LB能夠有效改善小鼠由于高脂飲食產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷。

圖8 不同處理對小鼠血清及肝臟組織CAT、SOD和MDA水平的影響Fig.8 Effects of different treatments on the levels of CAT,SOD and MDA in serum and liver tissues of mice

2.9 LB對小鼠結(jié)腸形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道是人體吸收的主要器官，可能蓄積外來化合物，從而對腸道造成損傷[34]。由圖9A、B可知，HFD組結(jié)腸長度短于NC組，差異高度顯著（P＜0.001），而LB給藥組與NC組沒有顯著差異，且結(jié)腸表面均勻光滑、無水腫充血和萎縮現(xiàn)象。由圖9C可知，NC組小鼠結(jié)腸黏膜層完整，腺體細(xì)胞排列整齊；而HFD組小鼠結(jié)腸黏膜腺體缺失、出現(xiàn)大量炎癥并浸潤至肌層、部分隱窩和杯狀細(xì)胞消失、上皮層不完整[14]；LB給藥組的絨毛排列結(jié)構(gòu)隨著LB劑量增加有所改善，逐漸恢復(fù)至與NC組相似，其結(jié)腸黏膜除形成環(huán)狀襞外、絨毛結(jié)構(gòu)也趨于完整、整體結(jié)構(gòu)密集、排列有序，使得腸黏膜的表面積增加，更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[35]。綜合結(jié)腸的表觀與切片結(jié)果，可以判斷LB的攝入不會對小鼠結(jié)腸造成萎縮等損傷并能夠顯著改善由于高脂飲食對其帶來的腸黏膜腺體缺失等影響。

圖9 不同處理組小鼠結(jié)腸實際圖片（A）、結(jié)腸長度（B）及結(jié)腸HE染色切片圖（C）Fig.9 Photographs (A),length (B) and HE staining slices (C) of colon in mice from different treatment groups

2.10 LB對小鼠股骨與脛骨骨性能的影響

骨骼是人體內(nèi)最主要的鈣存儲部位，鈣對骨骼健康至關(guān)重要。當(dāng)體內(nèi)鈣含量降低時，一系列生理反應(yīng)（如誘導(dǎo)甲狀旁腺激素觸發(fā)骨鈣釋放、增加腸鈣吸收和增加腎鈣重吸收）將會啟動進而維持鈣分子體內(nèi)平衡[36]。由圖10可知，綜合骨性能檢測結(jié)果可以說明LB攝入12 周對于小鼠股骨與脛骨未造成顯著退行性變化，沒有毒副作用。

圖10 不同處理對小鼠股骨和脛骨骨性能的影響Fig.10 Effects of different treatments on femur and tibia properties of mice

3 結(jié)論

通過經(jīng)口急性毒性實驗對LB的NOAEL進行探究，為該植物源天然活性物質(zhì)的進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)，急性毒性實驗結(jié)果得出LB的NOAEL為2 g/kgmb?；诟咧嬍承∈竽Ｐ脱芯縇B的降脂活性，結(jié)果表明：LB具有良好降脂活性，能夠減輕體質(zhì)量、顯著改善高脂飲食造成的血脂水平紊亂，還能夠調(diào)節(jié)肝功能、體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷和血糖紊亂，降低機體胰島素抵抗；骨性能結(jié)果顯示，長期攝入LB不會對小鼠造成退行性變化，基本無毒副作用。綜合本研究結(jié)果認(rèn)為，LB在NOAEL內(nèi)的劑量對小鼠具有顯著降脂活性且無可見毒副作用，且LB對于肝臟脂質(zhì)沉積和代謝有積極作用，未來可著眼于研究LB在機體中膽固醇吸收轉(zhuǎn)運機制，進一步探索其具體降脂作用機制。