濃香型白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替及其與理化指標(biāo)相關(guān)性

曾 波，饒家權(quán)，鄒永芳，文 靜，黃治國(guó),3，鄧 杰,3,*

（1.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；2.舍得酒業(yè)股份有限公司，四川 射洪 629000；3.中國(guó)輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒是中國(guó)白酒的典型代表，具有窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協(xié)調(diào)、回味悠長(zhǎng)等特征，深受消費(fèi)者青睞，其產(chǎn)量和銷(xiāo)量比例占整個(gè)白酒行業(yè)的70%[1]。酒醅是濃香型白酒生產(chǎn)的重要微生物來(lái)源之一，包括酵母、霉菌、細(xì)菌在內(nèi)的多種微生物對(duì)生產(chǎn)原料中大分子有機(jī)物分解能力較強(qiáng)，其代謝產(chǎn)物也可以作為白酒呈香物質(zhì)的前體物，對(duì)白酒生產(chǎn)過(guò)程中香味物質(zhì)的形成起關(guān)鍵作用[2]。因此，對(duì)白酒酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究成為近幾年白酒領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

由于濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中窖內(nèi)環(huán)境的變化，酒醅微生物呈動(dòng)態(tài)、有規(guī)律的演變[3]。肖辰等[4]通過(guò)對(duì)濃香型酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，酒醅中乳桿菌屬（Lactobacillus）在發(fā)酵初期迅速增長(zhǎng)，發(fā)酵中后期相對(duì)豐度呈緩慢上升趨勢(shì)，是酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。田瑞杰等[5]采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)濃香型白酒窖池酒醅微生物的差異表達(dá)基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)酒醅微生物的代謝差異富集在RNA降解與糖酵解，且下層酒醅的微生物對(duì)代謝活動(dòng)的貢獻(xiàn)最大，酒醅發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成不同，其代謝也會(huì)有所差異。Qian Wei等[6]對(duì)酒醅與窖泥微生物在濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸代謝的分工進(jìn)行研究，結(jié)果表明，與乙酸、乳酸代謝相關(guān)的酶主要富集在酒醅中，這些酸隨后被窖泥菌群代謝為己酸和丁酸，酒醅與窖泥微生物合力推動(dòng)濃香型白酒風(fēng)味的形成。目前的研究主要是對(duì)酒醅發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)解析，許多研究表明，乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、片球菌屬、地芽孢桿菌屬等是酒醅中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬[7-8]，哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、伊薩酵母屬等是酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌屬[9-10]，但濃香型酒醅中微生物的代謝尚不清晰，對(duì)不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的濃香型白酒酒醅微生物的演替規(guī)律對(duì)代謝功能的影響研究較少，對(duì)微生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、多樣性及動(dòng)態(tài)變化情況等方面認(rèn)識(shí)不足。

本研究以四川某濃香型窖池不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的酒醅作為研究對(duì)象，測(cè)定酒醅樣品發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化規(guī)律，并借助高通量測(cè)序技術(shù)分析酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)，使用冗余分析（redundancy analysis，RDA）、相關(guān)性分析研究微生物群落結(jié)構(gòu)與理化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，并利用PICRUSt分析發(fā)酵過(guò)程中酒醅微生物群落代謝的差異，旨在為明確濃香型白酒的釀造機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，及為釀造過(guò)程中微生物的調(diào)控和代謝機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：酒醅樣品取自四川某濃香型白酒廠(chǎng)生產(chǎn)窖池，每個(gè)樣品分別于窖池的上、中、下3 層采集（圖1），合并混合均勻后作為該發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的酒醅樣品（約200 g）。在60 d發(fā)酵期內(nèi)，分別從同一窖池取發(fā)酵5、10、15、20、30、40、50、60 d的樣品。樣品采集后暫存于-20 ℃，并及時(shí)進(jìn)行酒醅微生物基因組DNA提取和理化檢測(cè)，每個(gè)樣品的理化指標(biāo)檢測(cè)3 次。

圖1 取樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of sampling sites

E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒 上海晶諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DL-1電子萬(wàn)用爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；PiCo21臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；NanoDrop2000 DNA含量測(cè)定儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅理化檢測(cè)方法

水分含量采用常壓干燥法測(cè)定；酸度參照DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》采用酸堿滴定法測(cè)定；淀粉與還原糖含量采用菲林試劑法[11]測(cè)定。

1.3.2 酒醅DNA的提取

細(xì)菌根據(jù)E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000 DNA含量測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。真菌根據(jù)十六烷基三甲基溴化銨法，將提取的DNA加適量含10 ng/μL RNase的100 μL超純水溶解，37 ℃孵育1 h，分裝2 管，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴(kuò)增

細(xì)菌用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶、10 ng DNA模板。真菌通用引物ITS1FI2（5′-GAACCWGCGGARGGATCA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）用于真菌ITS序列的擴(kuò)增，序列長(zhǎng)度205 bp。PCR擴(kuò)增體系為：模板DNA 100 ng，ITS1FI2（0.5 μmol/L）和ITS2（0.5 μmol/L）各2.5 μL，Premix ExTaqTMHot Start Version 12.5 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR程序：98 ℃預(yù)變性10 s；98 ℃變性10 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[12]。全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用于后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類(lèi)，并在聚類(lèi)過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），參考京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/），采用PICRUSt（https://cloud.majorbio.com/）工具對(duì)導(dǎo)入的OTU分類(lèi)信息文件進(jìn)行在線(xiàn)功能預(yù)測(cè)，基于KEGG注釋結(jié)果，將擴(kuò)增子序列變體（amplicon sequence variant，ASVs）與其內(nèi)參序列比對(duì)，把ASVs置入相應(yīng)的參考樹(shù)中，推斷每個(gè)ASV基因家族的拷貝數(shù)，預(yù)測(cè)每個(gè)ASV的基因含量，結(jié)合MinPath確定每個(gè)樣本基因家族的豐度；將基因家族信息與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)應(yīng)的功能進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)樣本的功能信息和豐度信息，繪制代謝途徑，根據(jù)酶的豐度信息繪制氣泡圖。利用Origin軟件分析理化指標(biāo)的變化規(guī)律，酒醅理化數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過(guò)Origin軟件及R語(yǔ)言進(jìn)行微生物群落的變化規(guī)律分析、理化指標(biāo)相關(guān)性分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅理化指標(biāo)的變化規(guī)律

如圖2所示，淀粉含量在發(fā)酵前期呈持續(xù)下降趨勢(shì)，30 d后趨于平穩(wěn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)維持在7.8%，酒醅在發(fā)酵前期淀粉含量較高，細(xì)菌、霉菌等迅速繁殖使得糖化酶活力增高，導(dǎo)致還原糖含量升高，但還原糖含量變化在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，可能是由于5 d后酵母菌等大量兼性厭氧微生物大量繁殖，還原糖被迅速利用[13]。發(fā)酵后期微生物發(fā)酵能力減弱，還原糖與淀粉含量趨于平穩(wěn)；發(fā)酵初期，酒醅中淀粉含量較高，微生物在利用淀粉時(shí)產(chǎn)生大量的熱量，同時(shí)糖化作用會(huì)產(chǎn)生大量水分，導(dǎo)致酒醅中的水分含量從發(fā)酵初期持續(xù)上升，水分含量在60 d達(dá)到最高，為74.01%；同時(shí)適宜的水分可以調(diào)節(jié)窖內(nèi)溫度和降低發(fā)酵酒醅的酸度，影響酒醅發(fā)酵的質(zhì)量[14]。酒醅中的有機(jī)酸是酒體重要的風(fēng)味物質(zhì)并且參與酯化過(guò)程，適宜的酸度可以抑制部分有害雜菌的繁殖[15]。酸度在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，在30 d后趨于平穩(wěn)，60 d時(shí)酸度最高，為3.57 mmol/10 g，窖內(nèi)厭氧與兼性厭氧微生物代謝旺盛是酸度升高的原因之一。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中酒醅理化指標(biāo)的變化Fig.2 Changes in physicochemical indicators of fermented grains during fermentation process

2.2 酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的α多樣性分析

經(jīng)測(cè)序數(shù)據(jù)的處理，8 個(gè)酒醅樣品共得到445 296 條真菌有效序列和602 328 條細(xì)菌有效序列，由表1可知，所有樣品的覆蓋率均達(dá)到99.84%以上，表明酒醅樣品的測(cè)序結(jié)果能反映微生物群落全部信息，經(jīng)分析，酒醅中的細(xì)菌OTU數(shù)量為134～481，真菌OTU數(shù)量為135～293，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌的物種豐富度高于真菌。細(xì)菌Shannon指數(shù)為1.16～2.44，真菌Shannon指數(shù)為1.42～2.04，Shannon指數(shù)用于衡量物種多樣性，隨著發(fā)酵進(jìn)行，酒醅中細(xì)菌的Shannon指數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，這與王鵬[16]、Zhang Yanyan[17]等研究結(jié)果相似，這可能是酒醅發(fā)酵前期存在大量來(lái)源于大曲的微生物，且酒醅營(yíng)養(yǎng)豐富，適宜的酸度使酒醅微生物大量繁殖，導(dǎo)致酒醅細(xì)菌多樣性在10 d前增加，真菌的Shannon指數(shù)變化較小。酒醅中細(xì)菌的Chao1指數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，而真菌的Chao1指數(shù)波動(dòng)變化，表明酒醅發(fā)酵過(guò)程中真菌和細(xì)菌的豐度在不斷變化。

表1 酒醅中微生物的α多樣性Table 1 α-Diversity of microbial communities in fermented grains

2.3 酒醅發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落演替規(guī)律

如圖3 所示，細(xì)菌群落中的厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteriota）占主導(dǎo)地位；濃香型發(fā)酵酒醅主要存在12 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度＞1%），分別為L(zhǎng)actobacillus、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、unclassified_f_Enterobacteriaceae、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、高溫放線(xiàn)菌屬（Thermoactinomyces）、Kroppenstedtia、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、片球菌屬（Pediococcus）等，在窖內(nèi)發(fā)酵前期，Lactobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Weissella、Pseudomonas、Klebsiella等是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，Bacillus和Staphylococcus的相對(duì)豐度分別為5.3%～13.9%和0.4%～15.6%，隨著酒醅發(fā)酵進(jìn)行，Thermoactinomyces、Weissella的相對(duì)豐度迅速下降。發(fā)酵15 d后，Bacillus、Staphylococcus等菌屬的相對(duì)豐度降低，Lactobacillus在發(fā)酵15～20 d相對(duì)豐度增加29%，15 d后成為酒醅發(fā)酵過(guò)程中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度＞89.6%），Lactobacillus在酒醅整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中占據(jù)絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位，相對(duì)豐度維持在47%以上，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與高江婧[18]、翟磊[19]等研究結(jié)果一致。

圖3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門(mén)水平（A）和屬水平（B）組成分布Fig.3 Distribution of bacterial community structure at phylum (A) and genus (B) levels

2.4 酒醅發(fā)酵過(guò)程中真菌群落演替規(guī)律

如圖4 所示，真菌群落中的子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）占主導(dǎo)地位；濃香型發(fā)酵酒醅中主要存在12 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬（相對(duì)豐度＞1%），分別為Kazachstania、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、青霉屬（Penicillium）、unclassified_f_Aspergillaceae、季也蒙酵母屬（Meyerozyma）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、假絲酵母菌屬（Candida）、unclassified_f__Dipodascaceae、曲霉菌屬（Aspergillus）、Thermoascus等。其中，Kazachstania、Wickerhamomyces是濃香型白酒酒醅整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬，在發(fā)酵5～10 dKazachstania的相對(duì)豐度為47%～53%，10 d后開(kāi)始降低，但始終高于14%；Penicillium在發(fā)酵30 d相對(duì)豐度達(dá)到最高（12%），與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同的是酒醅發(fā)酵過(guò)程中真菌存在多個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，Meyerozyma在發(fā)酵5～10、40～60 d是優(yōu)勢(shì)菌屬，Debaryomyces在10～15 d相對(duì)豐度由0.4%增加到17.0%，Candida在10～15、40～60 d是優(yōu)勢(shì)菌屬之一，此外Aspergillus、Thermoascus、嗜熱真菌屬（Thermomyces）等微生物均為濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖4 真菌群落結(jié)構(gòu)門(mén)水平（A）和屬水平（B）組成分布Fig.4 Distribution of fungal community structure at phylum (A) and genus (B) levels

綜上，濃香型酒醅細(xì)菌以L(fǎng)actobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces為主，真菌以Kazachstania、Wickerhamomyces、Penicillium、Meyerozyma、Debaryomyces、Candida、Aspergillus為主，其中Lactobacillus、Kazachstania、Wickerhamomyces占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

由上述濃香型酒醅微生物群落演替規(guī)律可知，酒醅發(fā)酵前期與后期的微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，15～20 d是微生物群落結(jié)構(gòu)劇烈變化的時(shí)期，Lactobacillus在發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度不斷升高，該菌具有較強(qiáng)的碳水化合物代謝能力，能夠?qū)⑻穷?lèi)轉(zhuǎn)化為乳酸，這可能是酒醅發(fā)酵過(guò)程中酸度不斷升高的原因，同時(shí)乳酸能與乙醇通過(guò)酯化反應(yīng)生成濃香型白酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)乳酸乙酯，還可以作為其他脂肪酸的底物[20]。Kazachstania、Wickerhamomyces等真菌屬在酒醅發(fā)酵過(guò)程中保持較高的豐度，Kazachstania廣泛分布于酸面團(tuán)、泡菜、青貯飼料等植物乳酸發(fā)酵過(guò)程，同化乳酸，并水解葡萄糖醛酸苷作為異型發(fā)酵乳酸菌的代謝底物，促進(jìn)其利用果糖產(chǎn)乙酸[21]。Kazachstania也是濃香型白酒酒醅微環(huán)境的標(biāo)志性酵母種屬之一，對(duì)濃香型白酒風(fēng)味有重要影響[22]。Jood等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Kazachstania對(duì)酒體風(fēng)味的貢獻(xiàn)主要體現(xiàn)在異丙醇和異戊醇。研究表明，濃香型白酒的發(fā)酵過(guò)程主要是微生物間的共同發(fā)酵，通過(guò)互相協(xié)調(diào)和抑制實(shí)現(xiàn)釀造過(guò)程中的微生物動(dòng)態(tài)平衡[24]，微生物在發(fā)酵過(guò)程中的演替使酒醅菌群代謝更完整，同時(shí)與窖內(nèi)酒醅的理化環(huán)境密切相關(guān)。

2.5 酒醅理化指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

根據(jù)微生物群落結(jié)構(gòu)的組成，將不同發(fā)酵時(shí)間的酒醅分為2 個(gè)階段（5～15 d和20～60 d），通過(guò)相關(guān)性分析闡明酒醅樣品、發(fā)酵參數(shù)與微生物之間的關(guān)系。如圖5A、B所示，RDA結(jié)果顯示了細(xì)菌群落與真菌群落在樣品中的分布，解釋了不同發(fā)酵時(shí)期理化指標(biāo)與酒醅樣品96.15%和65.27%的關(guān)系，說(shuō)明樣品的分布與理化指標(biāo)存在一定的相關(guān)性。水分、還原糖、淀粉含量對(duì)濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)具有強(qiáng)烈影響[25]，RDA表明，發(fā)酵前期細(xì)菌群落和真菌群落主要受到淀粉與還原糖的影響，Bacillus、Pseudomonas、unclassified_f_Enterobacteriaceae、Kazachstania、Wickerhamomyces與還原糖、淀粉含量呈正相關(guān)，發(fā)酵后期細(xì)菌群落和真菌群落主要受到水分含量與酸度的影響，Lactobacillus、Penicillium、unclassified_f_Aspergillaceae與水分含量、酸度呈正相關(guān)，可見(jiàn)在濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵參數(shù)的驅(qū)動(dòng)力可能會(huì)影響微生物的組成結(jié)構(gòu)。

圖5 酒醅發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)與微生物相關(guān)性分析Fig.5 Analysis of correlation between physicochemical indicators and microbial communities

為了解理化指標(biāo)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬的影響，通過(guò)Spearman系數(shù)評(píng)估微生物與理化指標(biāo)的相關(guān)性，如圖5C、D所示，水分含量、酸度與Lactobacillus呈顯著正相關(guān)（P＜0.0 5），但與10 個(gè)細(xì)菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；還原糖含量與Lactobacillus呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與Pseudomonas、Enterobacter等8 個(gè)細(xì)菌屬呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；淀粉含量與Bacillus、Staphylococcus等8 個(gè)細(xì)菌屬呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。淀粉和還原糖含量與真菌中的Kazachstania呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與其他菌屬呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，水分含量和酸度與Kazachstania呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），可見(jiàn)濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)對(duì)真菌群落的影響較小，相關(guān)性分析表明，酒醅的酸度、水分、淀粉、還原糖含量與微生物菌群顯著相關(guān)，有研究表明，水分、還原糖、淀粉含量可作為酒醅微生物調(diào)控和香氣調(diào)控的指標(biāo)，從而間接調(diào)節(jié)白酒的風(fēng)味和品質(zhì)，理化指標(biāo)對(duì)濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響通過(guò)微生物代謝實(shí)現(xiàn)[26]。

2.6 酒醅發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝的變化

結(jié)合酒醅微生物物種注釋結(jié)果和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)繪制代謝圖，濃香型白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中微生物主要參與的代謝包括糖酵解、乙醇合成、酸代謝等（圖6A），不同發(fā)酵時(shí)期的微生物群落組成結(jié)構(gòu)不同，解析不同發(fā)酵時(shí)期酒醅中微生物的潛在功能有利于了解發(fā)酵特性，通過(guò)PICRUSt標(biāo)記基因序列預(yù)測(cè)不同發(fā)酵階段酒醅微生物群落的功能酶及其豐度信息，并繪制氣泡圖，如圖6B所示，隨Penicillium、Aspergillus相對(duì)豐度的增加，糖原磷酸化酶（EC2.4.1.1）、磷酸葡萄糖變位酶（EC5.4.2.2）、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（EC5.3.1.9）、果糖二磷酸酶（EC3.1.3.11）等表達(dá)水平開(kāi)始上調(diào)，這些酶與淀粉代謝密切相關(guān)，這也解釋了淀粉含量在發(fā)酵10 d后迅速降低的原因，30 d后降低緩慢，淀粉會(huì)轉(zhuǎn)化為乙醇，可見(jiàn)前30 d是酒醅的主發(fā)酵期，發(fā)酵后期是微生物代謝產(chǎn)物的平衡。Lactobacillus在酒醅發(fā)酵過(guò)程中豐度不斷增加，與之相關(guān)的磷酸甘油酸激酶（EC2.7.2.3）、磷酸甘油酸變位酶（EC5.4.2.11、EC5.4.2.12）、磷酸烯醇式丙酮酸（EC4.2.1.11）、丙酮酸激酶（EC2.7.1.40）以及乳酸脫氫酶（EC1.1.1.27）多種酶的表達(dá)水平逐漸增高，表明可能是由于酒醅中乳酸脫氫酶的高表達(dá)積累了大量乳酸，使酒醅的酸度在發(fā)酵過(guò)程中不斷升高，Lactobacillus的存在可能影響糖酵解代謝過(guò)程中酶的表達(dá)。乙醛可以由乙醇脫氫生成，脫氫酶作為產(chǎn)乙醛途徑的關(guān)鍵酶，其在發(fā)酵中期的表達(dá)有利于乙醛的積累及濃香型白酒的酸代謝，該過(guò)程可能涉及Kazachstania、Sterigmatomyces的參與，這些菌屬能夠分泌淀粉酶及纖維素酶，也能夠在酒醅發(fā)酵前期為其他微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)與酵母之間的相互作用影響原料的出酒率[27]。

圖6 酒醅微生物參與的代謝（A）及其相關(guān)酶的豐度變化（B）Fig.6 Metabolism involving microorganisms in fermented grains (A) and changes in the abundance of associated enzymes (B)

乙酰輔酶A是酸代謝途徑中合成脂肪酸的關(guān)鍵前體物質(zhì)，醋酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶（EC2.8.3.8）是己酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，該酶在發(fā)酵中期的表達(dá)水平較高，有利于濃香型白酒主體風(fēng)味己酸乙酯前體物質(zhì)己酸的合成，該過(guò)程可能涉及Bacillus、Staphylococcus等菌屬的參與，Bacillus是酒醅中的重要功能菌，為白酒釀造過(guò)程提供豐富的淀粉酶或蛋白酶，對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)具有重要影響[28]。黃治國(guó)等[29]將芽孢桿菌應(yīng)用于小曲酒發(fā)酵，降低了小曲酒的高級(jí)醇含量。Staphylococcus能夠豐富濃香型白酒的風(fēng)味，具有促進(jìn)乙醇、醛類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)合成的潛力。通過(guò)PICRUSt預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖酵解代謝相關(guān)的功能酶在發(fā)酵前期較活躍，酸代謝相關(guān)的功能酶在發(fā)酵中后期較活躍，并且這些酶與酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌屬相關(guān)，可見(jiàn)在發(fā)酵過(guò)程中酒醅微生物的演替有利于濃香型白酒風(fēng)味的形成。

3 結(jié)論

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)研究濃香型酒醅微生物的群落演替規(guī)律及潛在的代謝功能，結(jié)果表明：在門(mén)水平，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria、Actinobacteriota、Ascomycota、Basidiomycota是酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在屬水平，Lactobacillus是發(fā)酵15 d之后酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，Kazachstania、Wickerhamomyces是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中酒醅的優(yōu)勢(shì)真菌屬，細(xì)菌多樣性隨著發(fā)酵的進(jìn)行不斷降低，真菌多樣性在發(fā)酵過(guò)程中較為穩(wěn)定，理化指標(biāo)與細(xì)菌群落的相關(guān)性更強(qiáng)；通過(guò)功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Penicillium、Aspergillus主要參與糖酵解代謝，該過(guò)程葡萄糖被降解為丙酮酸，隨后在厭氧條件下被Lactobacillus還原成乳酸，Bacillus、Staphylococcus等涉及乙酸、丁酸、己酸的代謝，Kazachstania、Sterigmatomyces等涉及乙醇的合成，酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化影響糖酵解、酸代謝、乙醇合成相關(guān)的酶，說(shuō)明濃香型酒醅微生物的演替規(guī)律與風(fēng)味物質(zhì)代謝密切相關(guān)，目前關(guān)于濃香型酒醅微生物與風(fēng)味物質(zhì)代謝的機(jī)制尚不清晰，這將是后期研究的重點(diǎn)。綜上所述，本研究解析了濃香型白酒酒醅微生物的演替規(guī)律及其功能預(yù)測(cè)，為深入研究酒醅微生物在釀造過(guò)程中的作用提供了研究基礎(chǔ)。