基于JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路探究八桂止痛散對脂多糖誘導(dǎo)脊髓星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響

廖承成,尹瑞文,張洪衛(wèi),張 爽,李 霞,彭國瑤,聶欣怡

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科,云南 昆明 650021;2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腦病科,云南 昆明 650021)

神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷引起的慢性繼發(fā)性疼痛[1]。神經(jīng)炎癥與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān),炎癥誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞包括小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展[2]。小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化與JNK、p38 MAPK活化過程有關(guān),使得MAPK家族成為神經(jīng)病理性疼痛研究的潛在靶點[3]。八桂止痛散主要由八角楓、透骨草、桂枝以及大黃等組成,具有通絡(luò)止痛、活血化瘀之功效,將其應(yīng)用于神經(jīng)病理性疼痛治療的研究甚少。八桂止痛膏與此成分相似,其在多種疼痛性疾病療效顯著,具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[4]。故推測八桂止痛散可能對神經(jīng)病理性疼痛治療有效,因此文章通過LPS誘導(dǎo)脊髓星形膠質(zhì)細胞建立細胞損傷模型,觀察八桂止痛散對細胞凋亡、炎癥以及相關(guān)機制的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞:自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買SD乳鼠(出生時間短于3 d),合格證號:SCXK(湘)2019-0004,使用碘伏和75%酒精進行小鼠全身消毒,在無菌超凈操作臺上固定,迅速剪掉乳鼠頭顱,置于冰上剪開背側(cè)以脊柱為中心的皮膚肌肉,將剪刀從頭側(cè)伸入胸腔沿脊柱剪斷肋骨,取出脊柱、剖開腹側(cè)椎骨,剝離椎骨,取出脊髓,用無菌剪將脊髓剪切成碎塊,加入胰蛋白酶消化,緩緩吹打混勻,消化30 min后終止消化,吸管吹散至組織塊消失,制備單細胞懸液,離心、去上清液,收集細胞接種于培養(yǎng)瓶中,置于細胞孵育箱中進行培養(yǎng),待細胞融合度達到90%以上時,再進行消化傳代培養(yǎng)。生長到第3～4代時,可得到成熟且純化度達到90%以上的脊髓星形膠質(zhì)細胞,使用免疫熒光法染色鑒定。

1.1.2 實驗試劑:Med Chem Express公司提供p38 MAPK激活劑-Anisomycin;上海酶聯(lián)科技有限公司提供白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒;碧云天公司提供RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒;Thermo Fisher公司提供GFAP抗體;Abcam公司提供JNK、p38 MAPK、NF-κB p65、p-JNK、p-p38 MAPK和p-NF-κB p65一抗。

1.1.3 實驗儀器:奧林巴斯提供BX53熒光顯微鏡;Tanon提供凝膠成像儀;BIO-RAD提供垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)膜槽;美國Molecular公司提供SPECTCA MAX190酶標儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫熒光法染色鑒定星形膠質(zhì)細胞:在培養(yǎng)板中將爬片用PBS浸洗,多聚甲醛固定、Triton X-100通透,5%正常羊血清封閉,加入GFAP一抗,PBST漂洗,加入合適濃度的熒光標記二抗,滴加50 μl的抗淬滅封片劑(含DAPI)封片,熒光顯微鏡下拍照。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活:將對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細胞制備成5×104/ml的細胞懸液,以每孔100 μl的量接種于96孔板中。24 h后,給藥組分別加入100 μl含不同濃度八桂止痛散(2.5、5、10、20、40、80 mg/ml)的培養(yǎng)液,每個濃度梯度設(shè)6個平行孔;對照組每孔加入100 μl培養(yǎng)液。48 h后,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶標儀上測定450 nm波長處OD值,計算細胞存活率。

1.2.3 細胞分組及處理:收集對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細胞,設(shè)置對照組、LPS組、LPS+藥物低劑量(藥物-L)組、LPS+藥物中劑量(藥物-M)組、LPS+藥物高劑量(藥物-H)組、LPS+藥物-H+Anisomycin組,其中LPS組根據(jù)前期研究及文獻[5]以1 μg/ml的LPS處理細胞;LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組分別以1 μg/ml的LPS處理細胞,24 h后加入5、10、20 mg/ml八桂止痛散培養(yǎng)細胞;LPS+藥物-H+Anisomycin組以1 μg/ml的LPS處理細胞,24 h后加入20 mg/ml八桂止痛散、300 ng/ml Anisomycin同時處理細胞[6];對照組不進行細胞處理,48 h后進行指標檢測。處理結(jié)束后收集上述細胞,CCK-8法檢測細胞存活。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:收集細胞,加入0.25%胰酶并放回培養(yǎng)箱中消化,將細胞懸液移至離心管中,每管加入5 μl的FITC染料,避光孵育15 min后,隨后每管加入10 μl的PI染料,避光孵育5 min后,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平:收集細胞,離心取上清,按照試劑盒要求檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 qRT-PCR檢測細胞中JNK、p38 MAPK、NF-κB p65基因水平:PBS洗滌細胞,加入Trizol裂解液,在冰浴環(huán)境下裂解,提取總RNA;利用ND-1000分光光度計檢測RNA濃度,按照Fast King RT Kit Fast King cDNA合成試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄,向96孔PCR板中依次加入Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、上游引物、下游引物、cDNA模板以及Nuclease-Free Water,設(shè)置PCR循環(huán)反應(yīng)條件,反應(yīng)結(jié)束后,利用2-ΔΔCt分析JNK mRNA、p38 MAPK mRNA、NF-κB p65 mRNA表達。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.7 Western blot檢測JNK/p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達水平 每孔細胞(6孔板)中加入500 μl的RIPA裂解液(含50 μl蛋白酶抑制劑),冰浴環(huán)境下靜置10 min,用刮刀收集細胞,并檢測蛋白濃度,調(diào)整各個樣品的蛋白上樣量,以SDS-PAGE電泳分離,采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,PVDF膜置于5%的牛血清白蛋白中,分別加入JNK、p38 MAPK、NF-κB p65、p-JNK、p-p38 MAPK、p-NF-κB p65一抗,放置4 ℃冰箱中過夜,去除一抗液體,加入二抗,化學(xué)發(fā)光、顯影、定影后,分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析結(jié)果。以均數(shù)±標準差表示數(shù)據(jù),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較行SNK-q檢驗;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 星形膠質(zhì)細胞鑒定 免疫熒光鑒定結(jié)果(圖1)顯示,特征基因GFAP陽性表達達到95%以上,表明提取得到的細胞為星形膠質(zhì)細胞。

圖1 星形膠質(zhì)細胞的鑒定(×400)

2.2 不同濃度的八桂止痛散對星形膠質(zhì)細胞存活率的影響 見表2。5、10、20、40 mg/ml八桂止痛散均可抑制星形膠質(zhì)細胞存活,其中以20 mg/ml八桂止痛散處理時,星形膠質(zhì)細胞存活率接近50%,將其作為藥物處理的最高濃度,5、10 mg/ml八桂止痛散為低、中濃度進行后續(xù)實驗。

表2 不同濃度的八桂止痛散對星形膠質(zhì)細胞存活率的影響(%)

2.3 八桂止痛散對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞存活率的影響 與對照組相比,LPS組細胞存活率顯著降低(P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組細胞存活率顯著增加,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組細胞存活率顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞存活率比較(%)

2.4 八桂止痛散對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞凋亡率的影響 與對照組相比,LPS組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組細胞凋亡率顯著降低,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。見圖2(表4)。

圖2 各組細胞凋亡率變化比較

表4 各組細胞凋亡率比較(%)

2.5 八桂止痛散對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 與對照組相比,LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著增加(均P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著增加(均P<0.05)。見表5。

表5 各組細胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(pg/ml)

2.6 八桂止痛散對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達水平的影響 與對照組相比,LPS組JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達顯著增加(均P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達顯著降低,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達顯著增加(均P<0.05)。見表6。

表6 各組細胞JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達水平比較

2.7 八桂止痛散對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞JNK/p38 MAPK/NF-κB p65通路相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組相比,LPS組p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達顯著增加(均P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達顯著降低,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達顯著增加(均P<0.05)。見表7(圖3)。

A:對照組;B:LPS組;C:LPS+藥物-L組;D:LPS+藥物-M組;E:LPS+藥物-H組;F:LPS+藥物-H+Anisomycin組圖3 各組細胞JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達電泳圖

表7 各組細胞p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達比較

3 討 論

神經(jīng)病理性疼痛通常是由損傷和損害神經(jīng)系統(tǒng)的疾病引起慢性疼痛綜合征,以自發(fā)性疼痛、感覺異常、痛覺過敏為特點[7-8]。脊髓星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種常駐免疫細胞,周圍神經(jīng)一旦損傷后,脊髓星形膠質(zhì)細胞被激活并分泌大量炎癥和神經(jīng)遞質(zhì)介質(zhì),使神經(jīng)元致敏,加重中樞致敏作用,在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[8-9]。該疾病嚴重影響患者生活質(zhì)量,但是由于目前對其發(fā)生機制了解不夠深入,尚無有效治療方法[10-11],因此需深入探索其機制以獲取有效治療藥物。

神經(jīng)病理性疼痛常見于脊髓損傷患者中,但目前抗炎、鎮(zhèn)痛藥物對該疾病的治療具有極大抗性,故尋找有效治療方案意義重大[12]。八桂止痛散主要由八角楓、透骨草、桂枝以及大黃等成分組成,其中大黃味苦,性寒,具有活血祛瘀、清熱解毒、止血、瀉火等功效,可發(fā)揮抗病毒、抗炎等作用[13];透骨草味辛、甘,具舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕特點,主要表現(xiàn)鎮(zhèn)痛、抗炎的療效,與大黃同為臣藥[14-15];桂枝、八角楓其味辛、性溫,其功效為溫通經(jīng)絡(luò)、發(fā)汗解表,具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎等作用[16-17];全方可發(fā)揮通絡(luò)止痛、破氣行血等功效[18]。本研究通過對藥物濃度篩選,分別確定了八桂止痛散的低、中、高濃度,并進行后續(xù)實驗探索;結(jié)果發(fā)現(xiàn)八桂止痛散可有效提高細胞存活率,抑制其凋亡,降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平,具有劑量依賴性,表明八桂止痛散可通過降低炎癥抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞凋亡,提高細胞活力,有望在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮作用。此外,八桂止痛散與八桂止痛膏成分相似,且已有文獻報道,八桂止痛膏在帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗中均表現(xiàn)出明顯的抗炎、止痛效果[19-20],故推測八桂止痛散也具有相似藥理作用。

MAPK是一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶,可通過蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯,當MAPK家族被激活時,可激活脊髓背角小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活性,增加炎性因子的合成和釋放,增強神經(jīng)元的興奮性、中樞敏化、興奮性突觸傳遞,引發(fā)痛覺過敏和異常性疼痛,因此MAPK通路與神經(jīng)病理性疼痛息息相關(guān)[21-22]。MAPK被認為是啟動NF-κB激活的經(jīng)典途徑,NF-κB的激活可能有助于促炎細胞因子分泌[23-24]。故推測JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路可能與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生相關(guān)。結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞中,JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路被激活并釋放炎性因子,提示激活JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路可能參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展。亥茅酚苷通過抑制JNK/p38 MAPK和NF-κB信號通路,使得促炎細胞因子減少,緩解了機械性異常性疼痛[25]。本研究發(fā)現(xiàn)八桂止痛散可抑制LPS誘導(dǎo)的脊髓星形膠質(zhì)細胞中JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路激活,降低炎癥反應(yīng)及細胞凋亡,減輕脊髓星形膠質(zhì)細胞受損。最后實驗以通路抑制劑-Anisomycin進行反向驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Anisomycin逆轉(zhuǎn)了八桂止痛散對LPS誘導(dǎo)的脊髓星形膠質(zhì)細胞保護作用,表明八桂止痛散可能通過抑制JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述,八桂止痛散可抑制LPS誘導(dǎo)的脊髓星形膠質(zhì)細胞凋亡,降低炎癥反應(yīng),可能與抑制JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路有關(guān)。