于氏解郁調(diào)肝散微生物限度檢測方法考察*

梁林輝，章 斌**，蘆 珂，姚永秀，何 露

(1.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，藥學(xué)與檢驗學(xué)院，雅安市食品藥品應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，四川 雅安 625000； 2.華潤三九(雅安)藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000)

于氏解郁調(diào)肝散是由木香、大黃、陳皮、郁金、熊膽粉等中藥組成，按照一定的工藝制成的散劑。其來源于名老中醫(yī)于榮光的經(jīng)驗處方，在經(jīng)過祖?zhèn)黩灧降幕A(chǔ)上，經(jīng)多年臨床研究及中藥應(yīng)用并明確病因病機后篩選出《萬病回春》木香調(diào)氣散，又經(jīng)過多年臨床應(yīng)用演變固定成于氏解郁調(diào)肝散處方[1-2]。該藥物主要用于肝郁、痰飲、瘀血所致的氣滯作痛、食入作脹、胃納不香、吐酸噯氣、便秘、腸風(fēng)下血、癰疽惡瘡等及癥瘕積聚、痛風(fēng)、糖尿病等患者見上述證候者[3]。

于氏解郁調(diào)肝散是成都高新伍德堂中醫(yī)診所的特色制劑，已臨床應(yīng)用多年，療效顯著，安全性好。前期，本研究小組已經(jīng)建立該制劑的含量檢測及定性鑒別方法，為該制劑的生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)?？紤]到微生物限度是保障口服制劑的安全的一項重要指標(biāo)，且對含有抑菌作用的藥物進行微生物限度檢查時需考察抑菌性對檢查結(jié)果的影響[4]。本文依據(jù)2020版中國藥典[5]及參考文獻對該制劑微生物檢測方法適用性進行考察[6-7]，為一步加強制劑的質(zhì)量控制，保證用藥安全，完善于氏解郁調(diào)肝散質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9272(上海精宏) ；霉菌培養(yǎng)箱SHP-150 (北京中興偉業(yè))；電子分析天平FA1004(上海力辰邦西儀器)；生物安全柜BSC-1600ⅡA2(蘇凈安泰)；超凈工作臺SW-CJ-2FD(蘇凈安泰)；立式蒸汽滅菌器DGLS-100B(登冠醫(yī)療)。

1.2 藥品與試劑

于氏解郁調(diào)肝散(成都黃在軍醫(yī)院，批號：20220601、20220602、20220603)；培養(yǎng)基及稀釋液：pH=7無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(廣東環(huán)凱，批號：220304A10)；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA(廣東環(huán)凱，批號：220302A10)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB(廣東環(huán)凱，批號：220202A10)；沙門葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA(廣東環(huán)凱，批號：220210A20)；麥康凱液體培養(yǎng)基(北京陸橋，批號：22022613)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋，批號：22021810)；RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基(北京陸橋，批號：22030401)；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋，批號：22020401)；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(北京陸橋，批號：22031601)；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂(北京陸橋，批號：22021610)。其他試劑均為市售常規(guī)試劑。

菌種：所有菌種均來源中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 菌液制備

1)需氧菌菌液制備：取大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種至 10 mL TSB培養(yǎng)基內(nèi)，依據(jù)藥典方法進行培養(yǎng)，然后用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每 1 mL 含菌量小于 100 cfu 的菌懸液。

2)酵母菌菌液制備：取新鮮白色念珠菌菌種接種至 10 mL 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，依據(jù)藥典方法進行培養(yǎng)，然后同“2.1中1)”方法稀釋成每 1 mL 含菌量小于 100 cfu 的菌懸液。

3)霉菌菌液制備：取新鮮黑曲霉孢子培養(yǎng)物接種至SDA培養(yǎng)基中，依據(jù)藥典方法進行培養(yǎng)并收集孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(體積分數(shù))聚山梨酯80的pH=7.0無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液[3]。

2.2 供試液制備

稱取供試品 10 g，加入 100 mL 溫度低于 45 ℃、pH=7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，充分振搖混勻，制成10-1的供試液。取10-1供試液 10 mL，加入 90 mL 上述稀釋液中，得10-2供試液。同法制成10-3供試液。

2.3 需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法適用性試驗

A試驗組：將10-1供試液分裝至試管，10 mL/支，共5支；將 “2.1中1)”制成的5種菌懸液各 0.1 mL 依次加入對應(yīng)的5支試管，混勻，使5種供試液中含菌量均低于 100 cfu/mL；取供試液 1 mL，注入 90 mm 的無菌平皿中，平行制備2個平皿，依據(jù)需氧菌的種類傾注適宜的TSA或SDA培養(yǎng)基，混勻，凝固，并逐日觀察計數(shù)。

B供試品對照組：取10-1供試液 10 mL 于試管中，加入 0.1 mL pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，后續(xù)同試驗組操作。

C陽性對照組：取5支裝有 10 mL 的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管，對應(yīng)加入5種菌懸液各 0.1 mL，后續(xù)同試驗組操作。

D陰性對照組：取pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1 mL，注入直徑 90 mm 的無菌平皿中，后續(xù)同試驗組操作。

2.4 控制菌檢驗方法適用性試驗

因該制劑為含藥材原粉口服固體給藥劑，依據(jù)2020版《中國藥典》確認控制菌為大腸埃希菌、沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌。

2.4.1 大腸埃希菌檢查

A試驗組：取10-1供試液 10 mL，加入 100 mL TSB中，加入大腸埃希菌菌液使含菌量不大于 100 cfu，混勻，依據(jù)2020版《中國藥典》進行接種、劃線培養(yǎng)。

B供試品對照組：取10-1供試液 10 mL，加入 100 mL TSB中，后續(xù)不加菌液。同試驗組操作。

C陽性對照組：取大腸埃希菌菌液加入 100 mL TSB中，含菌量不大于 100 cfu，后續(xù)培養(yǎng)同試驗組操作。

D陰性對照組：用pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，后續(xù)不加菌。同試驗組操作。

2.4.2 沙門菌檢查

A試驗組：稱取 10 g 供試品加入 100 mL TSB中，加入沙門菌使含菌量不大于 100 cfu，混勻，后續(xù)依據(jù)2020版《中國藥典》進行接種、選擇和分離培養(yǎng)。

B供試品對照組：取 10 g 供試品加入 100 mL TSB中，后續(xù)不加菌同試驗組操作。

C陽性對照組：取含菌量不大于 100 cfu 的沙門菌加入 100 mL TSB中，后續(xù)培養(yǎng)同試驗組操作。

D陰性對照組：取 100 mL TSB，后續(xù)不加菌。同試驗組操作。

2.4.3 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查

A試驗組：稱取 10 g 供試品加入 100 mL TSB中，混勻，于室溫培養(yǎng) 2 h。再用TSB培養(yǎng)基作為稀釋劑制成得10-2供試液，同法制成10-3供試液。取三種稀釋度供試液分別接種于 10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，依據(jù)2020版《中國藥典》進行接種、選擇和分離培養(yǎng)。

B供試品對照組：取上述實驗組中10-1培養(yǎng)物 1 mL 分別接種至2支 10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，分別加入含菌量均小于 100 cfu 的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌液，后續(xù)同實驗組操作。

C陽性對照組：取含菌量小于 100 cfu 的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌液分別加入 10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，后續(xù)培養(yǎng)同試驗組操作。

D陰性對照組：取 1 mL TSB，加入 10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，后續(xù)培養(yǎng)同試驗組操作。

3 結(jié)果

3.1 需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

取于氏解郁調(diào)肝散(批號：20220601)，按照“2.3項”下分組及檢測方法，常規(guī)及稀釋檢測，供試品各實驗菌株結(jié)果如表1。需氧菌中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌回收率均不符合藥典要求，隨進行稀釋檢測；10-2供試液及10-3供試液需氧菌稀釋檢測結(jié)果如表2、表3。由表2、表3可知，需氧菌檢測需將樣品稀釋至1∶1000才能使所有實驗菌回收率滿足藥典要求。

表1 10-1供試液需氧菌、霉菌及酵母總數(shù)及回收率結(jié)果

表2 10-2供試液需氧菌總數(shù)及回收率結(jié)果

表3 10-3供試液需氧菌總數(shù)及回收率結(jié)果

3.2 需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法適用性驗證

取于氏解郁調(diào)肝散2批(批號：20220602、20220603)，按照“3.1項”下所得稀釋倍數(shù)結(jié)果和“2.3項”下分組及檢測方法，驗證待測菌株并計算回收率，結(jié)果如表4。

表4 需氧菌、霉菌及酵母菌驗證回收率

3.3 控制菌檢驗方法適用性試驗結(jié)果

取三批于氏解郁調(diào)肝散，按照2.4項下分組及檢測方法進行檢測，供試品各控制菌檢測結(jié)果如表5。由表5可知，大腸埃希菌、沙門菌和耐膽鹽革蘭陰性菌在3個批次的實驗組和陽性對照組均檢出，供試品對照組和陰性對照組未檢出?？捎贸Ｒ?guī)方法進行控制菌檢查。

表5 控制菌檢測結(jié)果

4 討論

于氏解郁調(diào)肝散是含有藥材原粉的散劑，由于藥材來源、加工工藝、保存條件等影響，導(dǎo)致中藥飲片微生物污染嚴重，進而對含有藥材原粉成品制劑的微生物限度有較大的影響[8-9]。因此，需要完善中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，控制飲片的加工生產(chǎn)過程，保障藥品安全。2020版藥典增加了中藥飲片的微生物限度檢查法，從源頭加強制劑原料的質(zhì)量控制，對中藥安全性、國際化有重要的意義。

于氏解郁調(diào)肝散中含木香、大黃、陳皮、郁金、熊膽粉等中藥，有文獻表明，藥典要求口服散劑需要檢測的項目有需氧菌、霉菌及酵母菌、大腸埃希菌、沙門菌和銅綠假單胞菌。木香提取物及揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、表皮葡萄球菌和糞腸球菌有較強的抑菌性[10-11]。大黃中蒽醌類化合物，特別是大黃素、大黃酸同樣有較強的抑菌作用，大黃素對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度只有 0.025 mg/mL[12-13]。陳皮和郁金含有大量揮發(fā)油，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌等也有明顯的抑制作用[14-15]，具有抗氧化、抗菌、保鮮等活性，可用做水果保鮮添加劑[16]；熊膽粉由黑熊膽汁干燥而來，主要成分為去氧膽酸、膽酸，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌有抑菌作用[17-18]?？紤]到配方原料及制備方法可能造成的微生物限準(zhǔn)確性差異，有必要建立并驗證于氏解郁調(diào)肝散微生物限度檢查方法。

制劑中含有藥材原粉，所以，本實驗排除了薄膜過濾法。首先考慮采用常規(guī)法及稀釋法，如果供試菌回收率不滿足要求，再考慮中和劑法。結(jié)果表明，于氏解郁調(diào)肝散對金黃色葡萄球菌、銅綠假單飽菌和枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制作用，檢測金黃色葡萄球菌和銅綠假單飽菌需將樣品按1∶100稀釋，檢測枯草芽孢桿菌需將樣品按1∶1000稀釋。藥典規(guī)定，含有藥材原粉的口服制劑中需氧菌落總數(shù)不超過104，因此，可選擇制劑1∶1000稀釋度進行檢測[5]?？刹捎?∶10供試液進行霉菌及酵母菌檢測，滿足回收率在0.5～2范圍?？刂凭捎贸Ｒ?guī)方法進行檢驗即可滿足要求。

綜上所述，本研究所建立于氏解郁調(diào)肝散微生物限度檢測方法簡便易行、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，對于完善該制劑的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)，為進一步制劑工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定了藥學(xué)基礎(chǔ)。