miRNA在阻塞性睡眠呼吸暫停相關血管內(nèi)皮功能障礙中的研究進展

武興東 岳紅梅,2 朱浩斌 劉苗苗 李雅亭 許金回

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)是一種常見的、嚴重且被低估的睡眠呼吸障礙性疾病,是指由多種原因?qū)е滤郀顟B(tài)下反復發(fā)作的上氣道部分或完全塌陷,機體反復出現(xiàn)低通氣和(或)呼吸中斷,導致慢性間歇性低氧血癥、高碳酸血癥、胸內(nèi)壓大幅波動以及睡眠結構紊亂,這些事件引發(fā)了一系列相互作用的過程,進而使機體一系列病理變化。間歇性低氧(intermittent hypoxia,IH) 和睡眠碎片化(sleep fragmentation,SF)是 OSA 的主要病理生理特征。臨床上,OSA患者主要表現(xiàn)為睡眠時打鼾、他人目擊的呼吸暫停和日間嗜睡、疲乏、記憶力下降等。OSA的嚴重程度常以每小時呼吸暫停低通氣的次數(shù),即睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(apnea hypopnea index,AHI)來量化。目前認為OSA是高血壓、冠心病、心律失常、心力衰竭、卒中等心腦血管病的獨立危險因素,與難治性高血壓、胰島素抵抗密切相關[1, 2]。流行病學資料顯示,女性發(fā)病率為6%～19%,男性發(fā)病率為13%～33%[3],全球有超過10億的患者[2]。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,長度約為19～25 個核苷酸,其通過與靶mRNA特異性結合,在轉錄后調(diào)控基因表達[4, 5]。經(jīng)典的miRNA作用靶點位于mRNA的3′端非翻譯區(qū),它們可以通過破壞靶mRNA的穩(wěn)定性、抑制靶mRNA的翻譯來對靶mRNA發(fā)揮調(diào)控作用,從而導致基因表達的降低[6]。作為基因表達的關鍵調(diào)節(jié)因子,miRNA參與了細胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡等多種細胞活動[5]。近年來的多項研究表明,miRNA參與了心血管疾病、代謝性疾病、糖尿病、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[5, 7],這突出了miRNA作為多種疾病診斷和預后的生物標志物的潛力。

一、血管內(nèi)皮的正常生理功能

血管內(nèi)皮細胞是介于血流和血管壁組織之間的單層扁平上皮細胞,它形成血管的內(nèi)壁。內(nèi)皮細胞是沿著整個循環(huán)系統(tǒng),由心臟直至最小的微血管。血管內(nèi)皮細胞具有多種功能,主要通過衍生的血管活性物質(zhì)發(fā)揮其生理作用,這對于維持血管系統(tǒng)的健康具有重要意義。以下對血管內(nèi)皮細胞的生理功能作一概述。

1. 屏障功能

血管內(nèi)皮細胞構成了血管的第一道屏障,發(fā)揮維持血管內(nèi)膜光滑、防止血小板和白細胞黏附及有害物質(zhì)侵入血管壁、進行物質(zhì)交換和主動運轉等功能,此外內(nèi)皮細胞還構成膠原基底膜和平滑肌細胞保護層。

2. 調(diào)節(jié)血管張力

內(nèi)皮細胞能夠通過自分泌、內(nèi)分泌及旁分泌三種途徑合成和分泌多種血管活性物質(zhì),如一氧化氮(NO)、前列環(huán)素(PGI2)、內(nèi)皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)等,以保證血管正常的收縮和舒張,起到維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓等作用[8]。

3. 維持凝血和纖溶系統(tǒng)的平衡

在生理條件下,內(nèi)皮細胞主要表現(xiàn)為抗凝和纖溶活性,這是由于內(nèi)皮細胞能夠合成和釋放許多抗凝、促進纖溶的活性物質(zhì),如血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、蛋白S(PS)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、PGI2、組織型纖溶酶原激活物(tPA)等,而在外傷、感染、休克等病理狀態(tài)下,可釋放某些促凝和抑制纖溶的活性物質(zhì),如組織因子(TF)、白細胞介素1(IL-1)、血管性假血友病因子(VWF)、血漿纖溶酶原激活抑制劑(PAI)等,內(nèi)皮細胞主要表現(xiàn)為促凝和抑制纖溶。

4. 參與炎癥反應

內(nèi)皮細胞在炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。急性炎癥時,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1可誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量PGI2、血小板活化因子(PAF)、內(nèi)皮源性超極化因子(EDHF)等,它們可以舒張血管,使內(nèi)皮細胞的間隙增大,并降低血管壁對縮血管物質(zhì)的反應性,有利于炎癥介質(zhì)的滲出和白細胞向炎癥部位遷移[8]。此外,當機體發(fā)生炎癥時,P-選擇素、E-選擇素、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)等黏附分子在內(nèi)皮細胞表面的表達上調(diào),參與內(nèi)皮細胞與白細胞的黏附、活化[8]。

5. 參與血管生成

血管形成,即從已有的血管上抽芽生成新的毛細血管。血管形成有許多關鍵步驟,包括:內(nèi)皮細胞活化,基膜破裂、粘連、遷移,內(nèi)皮細胞擴增,中空的管腔形成,以及最后新的血管從已有血管上萌發(fā)[9]。這一多步驟過程依賴于血管形成促進因子和抑制因子的協(xié)調(diào)產(chǎn)生,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管生成最關鍵的驅(qū)動因素。

二、內(nèi)皮功能障礙及其評估方法

內(nèi)皮細胞襯于血管表面,作為守護血管健康的第一道屏障,直接感受血管內(nèi)環(huán)境,如炎性信號、激素水平、血流剪切力等信息的改變,并能通過分泌多種血管活性物質(zhì)進行調(diào)節(jié),以維持血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在OSA發(fā)病過程中,內(nèi)皮細胞暴露于循環(huán)中增強的多種因素,包括循環(huán)缺氧、代謝紊亂和炎癥等,導致血管內(nèi)皮功能障礙。內(nèi)皮功能障礙不僅表現(xiàn)為血管收縮和舒張功能的紊亂, 還包含內(nèi)皮炎癥增強、白細胞黏附增多、氧化應激、內(nèi)皮增殖與遷移能力增強以及內(nèi)皮屏障功能受損等[10]。之前的研究表明,OSA引起的IH可能通過NO合成減少及生物利用度下降、氧化應激、炎癥、內(nèi)皮細胞凋亡、內(nèi)皮微粒、內(nèi)皮細胞與循環(huán)炎性細胞的相互作用以及損傷修復等途徑導致內(nèi)皮功能障礙[11]。

非侵入性評估血管內(nèi)皮功能方法有檢測血流介導的血管舒張功能(flow mediated dilation,FMD)、測定外周動脈張力(peripheral arterial tonometry,PAT)、測定頸動脈內(nèi)-中膜厚度(carotid intima-media thickness,cIMT)、測定心外膜脂肪厚度(epicardial fat thickness,EFT)、檢測脈搏波傳導速度(pulse wave velocity,PWV)、測定踝肱指數(shù)(ankle-brachial index,ABI)及趾肱指數(shù)(toe-brachial index,TBI)等[12]。

三、miRNA在OSA中的差異性表達

研究表明,miR-664a-3p[13],miR-130a[14],miR-223[15],miR-185[16, 17],miR-145[17],miR-630[18],miR-16,miR-718,miR-1249,miR-193,miR-218,miR-30b[19],miR-30a[20],miR-26b,miR-207[21],miR-107,miR-485-5p,miR-574-5p,miR-199-3p[22],miR-34a-5p[23],miR-146a-5p[24],miR-126-3p,let-7d-5p,miR-7641,miR-1233-5p,miR-320b,miR-145-5p,miR-107,miR-26a-5p[25],miR-155[26]等miRNA在OSA患者及動物模型中差異性表達,并參與各種病理生理過程。miRNA在OSA中的的差異性表達與OSA的診斷、病情及預后評估相關,并且可能參與了OSA的發(fā)生發(fā)展,這表明了miRNA用于OSA診斷、病情評估以及未來用于治療的價值。

四、miRNA在OSA相關血管內(nèi)皮功能障礙中的研究

由于miRNA在炎癥、氧化應激及脂質(zhì)代謝紊亂中發(fā)揮著至關重要的作用,所以,在OSA患者群體中,miRNA能夠通過作用于相應的潛在靶基因調(diào)節(jié)不同的信號途徑,引起動脈粥樣硬化,進而提高卒中、冠心病等心腦血管疾病的風險[27]。許多研究表明,miRNA通過調(diào)節(jié)與內(nèi)皮細胞功能密切相關的基因表達參與內(nèi)皮和血管功能的調(diào)節(jié)[28-30]。因此,miRNA途徑是血管內(nèi)皮功能障礙的一種重要的分子機制。

自噬是細胞的自我更新過程,依賴溶酶體降解受損的細胞器和蛋白質(zhì),可維持細胞穩(wěn)態(tài),在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞通透性、調(diào)控內(nèi)皮一氧化氮合酶、調(diào)控內(nèi)皮止血、調(diào)控內(nèi)皮細胞能量代謝等方面起重要作用。OSA可通過缺氧、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、內(nèi)皮功能障礙、miRNA等誘導自噬[31]。自噬的失敗或抑制會導致內(nèi)皮細胞凋亡增加和內(nèi)皮完整性破壞,促進內(nèi)皮功能障礙。Liu等[19]通過對慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)模型小鼠內(nèi)皮細胞凋亡和自噬相關miRNA的研究中發(fā)現(xiàn),miRNA通過調(diào)節(jié)凋亡和自噬相關基因的表達在CIH中發(fā)揮重要作用。在此次實驗中,為了探討miRNA在CIH致小鼠主動脈內(nèi)皮細胞損傷中的作用,采用miRNA微陣列分析法測定了正常對照組和CIH組的miRNA表達譜,結果表明CIH組6個miRNAs與正常對照組比較有明顯變化(P<0.05),8個miRNA與正常對照組比較無明顯變化(P>0.05)。對這6個變化顯著的miRNA采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)進行驗證,結果表明CIH組mmu-miR-30b、mmu-miR-193、mmu-miR-1249和mmu-miR-218表達上調(diào),mmu-718和mmu-miR-16表達下調(diào),與基因芯片雜交結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)mmu-miR-193、mmu-miR-1249、mmu-miR-218、mmu-miR-718和mmu-miR-16參與凋亡相關靶基因的調(diào)控,mmu-miR-30b、mmu-miR-193和mmu-miR-1249參與自噬相關靶基因的調(diào)控,其中mmu-miR-193和mmu-miR-1249是細胞凋亡和自噬的關鍵調(diào)節(jié)因子,mmu-miR-193下調(diào)可減輕CIH引起的血管內(nèi)皮細胞損傷,同時自噬和凋亡相關蛋白的表達也降低。此外,有研究表明,miRNA在自噬和控制自噬相關蛋白6(Beclin-1)表達中發(fā)揮著關鍵作用[32-34],編碼Beclin-1的BECN1已被鑒定為miR-30a的直接靶點[35, 36]。miR-376b是另一種調(diào)節(jié)BECN1的miRNA。Korkmaz等[37]表明miR-376b通過直接調(diào)節(jié)細胞中2種關鍵的自噬相關蛋白BECN1和ATG4C來調(diào)節(jié)自噬。Bi等[20]在一項研究中發(fā)現(xiàn)CIH小鼠模型中miRNA-30a顯著上調(diào),miRNA-30a能夠靶向作用于自噬相關蛋白6(Beclin-1)mRNA的3′-非編碼區(qū),進而調(diào)控其在內(nèi)皮細胞中的 Beclin-1蛋白翻譯,從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞自噬。與正常組比較,在CIH 時,miRNA-30a高表達使內(nèi)皮細胞中 Beclin-1 蛋白減少,自噬細胞減少,此時超聲心動圖顯示小鼠心功能障礙;同CIH 組比較,通過對CIH 組小鼠尾靜脈注射慢病毒抑制miRNA-30a表達后,內(nèi)皮細胞Beclin-1蛋白增多,自噬細胞增多,此時超聲心動態(tài)圖顯示小鼠心功能障礙明顯改善。這項研究表明CIH 時,內(nèi)皮細胞自噬可能通過miRNA-30a介導 Beclin-1 的翻譯控制而減弱,進而引起內(nèi)皮細胞功能障礙和損傷,通過反義miRNA-30a(as-miR-30a)的表達抑制miRNA-30a顯著增加了Beclin-1水平,從而增強了體外和體內(nèi)內(nèi)皮細胞自噬,改善了內(nèi)皮細胞在CIH條件下的存活率。因此,miRNA-30a在OSA相關內(nèi)皮功能障礙中也扮演著重要的角色。

細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)由磷脂雙分子層及各種囊內(nèi)容物組成,是一種由細胞主動向外釋放的膜性小囊泡。它們攜帶多種內(nèi)容物,包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝產(chǎn)物和核酸,特別是mRNAs和miRNAs,這些物質(zhì)被輸送到靶細胞,在細胞間通訊中起著重要作用[38]。根據(jù)生物學特性或釋放途徑不同可將EVs分為微囊泡(MV)、外泌體、內(nèi)體和凋亡小體。其中外泌體是存在于生物體液中的直徑為30～100nm的EVs[39]。作為參與細胞間轉移和通訊的囊泡,外泌體于1983年由Pan及其同事首次發(fā)現(xiàn)[40, 41]。Khalyfa等[18]在一項關于OSA患兒循環(huán)血漿外泌體miRNA與內(nèi)皮功能障礙關系的研究發(fā)現(xiàn),從患有OSA的肥胖或非肥胖兒童中分離的血漿外泌體主要來源于內(nèi)皮細胞。外泌體miRNA-630在內(nèi)皮功能障礙患兒中表達降低,并且在治療后隨著內(nèi)皮功能恢復而恢復正常。此外,對無內(nèi)皮功能障礙受試者用miRNA-630抑制劑轉染外泌體后會誘導出內(nèi)皮功能障礙的功能表型,這表明外泌體miRNA-630的減少會引起內(nèi)皮功能障礙。miRNA-630可以作為潛在OSAS和(或)肥胖兒童血管功能和心血管疾病風險的一個新的關鍵介質(zhì)。Bhattacharjee等[42]證明了來自患有重度OSA的成年受試者的血漿外泌體能夠誘導內(nèi)皮功能障礙,并且這種特性在PAP治療6周后減弱。此外,他們在PAP治療前后對8名受試者的外泌體貨物成分進行miRNA陣列分析,從而揭示了四種miRNA(miRNA-16-5p、miRNA-4459、miRNA-451a和miRNA-6510-5p)的差異表達。國內(nèi)一項研究表明,來自于CIH暴露小鼠血清/紅細胞的EVs可將功能性miR-144遞送至內(nèi)皮細胞,通過降低核因子紅細胞2相關因子2(NRF2)表達促進超氧陰離子的產(chǎn)生,進而導致內(nèi)皮功能障礙[43]。此外,該研究還表明,在低氧條件下,miR-144可能受到低氧誘導因子-1α(HIF-1α)的直接調(diào)控或HIF-1α/GATA1信號通路的間接調(diào)控。這項研究表明了負載anti-miR-144的細胞外囊泡可能代表了一種治療OSA或CIH相關內(nèi)皮功能障礙的有前景的治療方法。外泌體具有獨特的特性─天然穩(wěn)定性、低免疫原性、生物相容性和良好的生物膜滲透能力,這允許它們作為藥物遞送的天然納米載體發(fā)揮作用[44]。隨著現(xiàn)代精準醫(yī)學的發(fā)展及對于OSA相關分子機制的探索,利用外泌體作為藥物遞送的載體將會成為OSA及OSA相關心血管疾病的一種有希望的治療方法。

線粒體功能障礙也是導致血管內(nèi)皮功能障礙的一個重要因素。在病理條件下,線粒體功能障礙會導致活性氧(ROS)產(chǎn)生增多和三磷酸腺苷(ATP)缺乏,然后進一步破壞線粒體功能和細胞穩(wěn)態(tài),形成一種惡性循環(huán),加劇血管內(nèi)皮損傷[45]。線粒體功能障礙的特征是線粒體膜電位降低和ROS產(chǎn)生增加,ROS介導的氧化應激會促進血管內(nèi)皮細胞衰老。線粒體功能障礙還會增加血管內(nèi)皮的通透性,進而損害血管內(nèi)皮的屏障功能。因此,線粒體功能的正常對于血管內(nèi)皮發(fā)揮正常的生理功能具有重要意義。一項涉及臨床、體外和動物實驗的研究揭示了OSA可以通過誘導miR-210水平的升高引起線粒體功能障礙,進而引起內(nèi)皮功能障礙[46]。間歇性低氧誘導固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白2 (SREBP2) 與miR-210啟動子區(qū)域結合,反式激活miR-210,進而抑制鐵硫簇組裝酶(ISCU),損害氧化磷酸化,導致線粒體功能障礙。因此,SREBP2-miR-210-ISCU軸可能是miR-210誘導血管內(nèi)皮功能障礙的潛在機制。此外,在這項實驗中SREBP2抑制劑白樺脂醇減輕了OSA小鼠模型中間歇性低氧所引起的收縮壓的增高。因此通過抑制miR-210或SREBP2為預防或治療OSA相關內(nèi)皮功能障礙提供了一種新的思路。此外,之前的研究表明,在肺動脈高壓中,來源于骨髓的miR-210可以直接從血漿轉運到肺內(nèi)皮細胞,引發(fā)血流動力學和血管的變化,從而支持循環(huán)miR-210參與疾病發(fā)病的觀點[47]。作為一種低氧誘導的miRNA,miR-210在內(nèi)皮功能中的作用為研究OSA的發(fā)病機制提供了新的分子視角[48]。

五、總結與展望

OSA是一種以CIH和SF為特征的睡眠呼吸障礙性疾病,它是一種重要的全球性公共衛(wèi)生問題,現(xiàn)已日益受到重視。血管內(nèi)皮細胞是守護血管健康的門戶,血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化、卒中等心腦血管疾病的早期預警信號。OSA可以通過CIH誘導的炎癥、氧化應激等引起血管內(nèi)皮功能障礙,加速心腦血管疾病的進展。近年來,通過大規(guī)模微陣列分析和遺傳學方法,人們發(fā)現(xiàn)了miRNA在CIH引起的血管內(nèi)皮功能障礙中扮演著重要的角色。作為引起血管內(nèi)皮功能障礙的一種重要的分子機制,miRNA可能通過調(diào)節(jié)凋亡和自噬相關基因的表達抑制自噬,促進內(nèi)皮細胞凋亡,破壞內(nèi)皮的完整性,以及介導線粒體功能障礙、介導炎癥及氧化應激等途徑引起內(nèi)皮功能障礙。對于OSA中miRNA的探索將有助于尋找治療OSA以及OSA相關心腦血管疾病的潛在方法。隨著工程化外泌體的發(fā)展以及對于OSA相關分子機制的探索,利用外泌體作為藥物遞送的載體將有希望成為一種新的治療方法。因此,未來需要開展更多的研究去探索miRNA在OSA中所發(fā)揮的作用。