金霉素和土霉素對(duì)生物除磷中微生物EPS的影響

陶傳奇, 張 華*, 黃 健, 奚姍姍, 何春華,羅 濤, 王金花, 張佳妹, 馬牧野

1. 安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院, 安徽 合肥 230601

2. 環(huán)境污染控制與廢棄物資源化利用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 安徽 合肥 230601

3. 安徽省生態(tài)文明研究院, 安徽 合肥 230601

引 言

目前, 抗生素種類繁多, 而四環(huán)素類的抗生素由于顯著的抑菌效果而被廣泛用于人類及養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)[1]。 然而, 50%～80%的抗生素可以通過(guò)排泄物進(jìn)入污水處理廠[2]。 其中, 四環(huán)素類抗生素即金霉素和土霉素在污水廠中檢出率較高[3]。 金霉素和土霉素會(huì)影響活性污泥中微生物生存, 可能引起污水生物處理效果變差。 生物除磷是污水廠除磷的重要工藝。 在生物除磷過(guò)程中, 微生物胞外聚合物發(fā)揮著重要作用。 探究金霉素和土霉素對(duì)污水生物除磷中微生物胞外聚合物影響具有重要意義。

胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)是分布在微生物表面的高分子聚合物[4]。 微生物在面臨外界環(huán)境不利影響, EPS可作為保護(hù)層抵御外界有害物質(zhì)的侵害[5-6]。 EPS中主要成分是蛋白質(zhì)和多糖, 約占70%～80%。 EPS組分及含量關(guān)系著活性污泥絮凝性能、 沉降性能[7-8]。 研究表明, 金霉素濃度的增加會(huì)刺激微生物EPS的合成, 而且金霉素與EPS結(jié)合形成EPS-CTC復(fù)合物, 阻礙物質(zhì)傳遞[9]。 土霉素能有效抑制SBR系統(tǒng)中微生物蛋白質(zhì)合成的過(guò)程, 導(dǎo)致EPS中蛋白質(zhì)合成量下降[10]。 然而, 污水中抗生素往往都是混合存在的。 研究表明, 混合抗生素會(huì)引起微生物EPS中蛋白質(zhì)和多糖的增加并引起污泥性能的惡化[11-12]。 目前, 在金霉素和土霉素對(duì)微生物EPS的研究中, 主要集中于金霉素和土霉素單獨(dú)作用時(shí)對(duì)微生物EPS影響。 然而, 對(duì)于金霉素和土霉素混合污染物對(duì)生物除磷中微生物EPS的研究甚少, 混合污染物往往具有更復(fù)雜的影響, 因此, 探究金霉素和土霉素混合污染物對(duì)生物除磷的影響更具有意義。

本研究利用直接均分射線法設(shè)計(jì)3種不同濃度配比的金霉素和土霉素, 探究不同濃度金霉素、 土霉素和二者混合物對(duì)生物除磷中微生物EPS的蛋白質(zhì)和多糖含量的影響, 并結(jié)合三維熒光光譜(3D-EEM)和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析EPS成分及主要官能團(tuán)的變化, 為揭示金霉素和土霉素混合污染物對(duì)生物除磷中微生物EPS的影響機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 裝置與運(yùn)行條件

實(shí)驗(yàn)采用8個(gè)相同的圓柱形有機(jī)玻璃材質(zhì)的SBR, 反應(yīng)器供氧利用空氣泵和反應(yīng)器底部的微孔曝氣盤實(shí)現(xiàn)。 通過(guò)玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制溶解氧為2.0～3.0 mg·L-1。 反應(yīng)器壁厚0.5 cm, 高28 cm, 內(nèi)徑9 cm, 有效使用容積為1.8 L。 反應(yīng)周期分6個(gè)階段, 進(jìn)水、 厭氧、 曝氣、 沉淀、 出水、 閑置階段。 采用間歇式厭氧/好氧交替運(yùn)行方式, 反應(yīng)器每天運(yùn)行6個(gè)周期, 1個(gè)周期4 h, 進(jìn)水30 min, 厭氧50 min, 好氧110 min, 沉淀30 min, 出水10 min, 閑置10 min。 每個(gè)反應(yīng)器污泥濃度(MLSS)約為4 000 mg·L-1。

1.2 接種污泥與進(jìn)水水質(zhì)

實(shí)驗(yàn)接種的活性污泥取自合肥市望塘污水處理廠的氧化溝, 將接種污泥接入到18 L反應(yīng)器進(jìn)行馴化, 實(shí)驗(yàn)污泥馴化階段出水COD、 MLSS和正磷酸鹽穩(wěn)定后視為馴化完成。 最后活性污泥轉(zhuǎn)移至1.8 L反應(yīng)器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)采用人工配水, 藥劑包括CH3COONa·3H2O、 KH2PO4、 NH4Cl、 MgSO4、 C4H8N2S、 C10H16N2O8、 CaCl2·2H2O、 酵母膏、 蛋白胨; 微量元素包括FeCl3、 KI、 ZnSO4、 H3BO3、 CuSO4、 MnCl2、 Na2MOO4、 CoCl2·6H2O。

1.3 金霉素和土霉素儲(chǔ)備液的配置

分別稱取1 g金霉素和土霉素, 用去離子水充分溶解并定容至1 L棕色容量瓶進(jìn)行避光保存, 放置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存待用。

1.4 EPS提取和分析方法

EPS提取采用熱提取法[13]。 提取步驟: 取厭氧末端30 mL污泥混合液, 離心力2 000 g條件下離心15 min去上清液, 注入超純水補(bǔ)充至原體積。 置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱1 h后, 溶液冷卻至室溫。 在4 ℃, 離心力12 000 g條件下離心10 min, 取上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾, 將過(guò)濾后的EPS溶液置于4 ℃進(jìn)行保存。 提取的EPS中蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán), 多糖采用蒽酮-硫酸測(cè)定法。

1.5 3D-EEM分析

采用Hitachi F-7000熒光分光光度計(jì)對(duì)EPS的成分進(jìn)行3D-EEM分析。 以氙燈為光源, 設(shè)定電壓700 V, 三維熒光光譜掃描設(shè)定狹縫寬帶λEx為5 nm,λEm為5 nm; 激發(fā)波長(zhǎng)λEx為200～400 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)λEm為300～550 nm; 掃描速度為2 400 nm·min-1。 掃描的數(shù)據(jù)利用Matlab2020軟件處理分析。

1.6 FTIR分析

為了定性分析EPS中化學(xué)官能團(tuán)的變化, 將EPS提取液經(jīng)過(guò)冷凍干燥后與光譜純KBr按照質(zhì)量比1∶100進(jìn)行充分研磨、 壓片, 壓片成透明狀后在紅外光譜儀進(jìn)行FTIR分析, 在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描, 分辨率為4 cm-1, 掃描的數(shù)據(jù)利用origin2018軟件繪圖。

1.7 不同濃度配比混合物設(shè)計(jì)

首先根據(jù)金霉素、 土霉素單獨(dú)作用時(shí)的比吸磷率, 得到半最大效應(yīng)濃度EC50, 再利用直接均分射線法[14]設(shè)計(jì)3種不同濃度配比(L1、 L2、 L3)的金霉素和土霉素混合物, 結(jié)果如圖1和表1所示。 再根據(jù)稀釋因子法[14]為每種配比設(shè)計(jì)8組金霉素和土霉素混合物, 結(jié)果如表2所示。

表2 8組金霉素和土霉素濃度組合 (mg·L-1)

圖1 直接均分射線法設(shè)計(jì)不同濃度配比混合物

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度金霉素、 土霉素及混合物對(duì)正磷酸鹽去除的影響

不同濃度金霉素、 土霉素及3種配比的混合物對(duì)正磷酸鹽去除的影響如圖2所示。 由圖2(a—e)可知, 隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng), 不同濃度金霉素、 土霉素及混合物作用下, 出水中正磷酸鹽的濃度不斷增加并逐漸趨于進(jìn)水濃度。 這說(shuō)明抗生素已經(jīng)嚴(yán)重抑制聚磷菌除磷的過(guò)程。

圖2 不同濃度金霉素、 土霉素及3種配比混合物對(duì)正磷酸鹽去除的影響

2.2 不同濃度金霉素、 土霉素及混合物對(duì)COD去除的影響

不同濃度金霉素、 土霉素及3種配比的混合物對(duì)COD去除的影響如圖3所示。 圖3(a—e)不同濃度金霉素、 土霉素及混合物隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng), 反應(yīng)器COD出水濃度不斷增加。 可見(jiàn)金霉素、 土霉素及混合物對(duì)COD去除產(chǎn)生較大影響, 抗生素濃度越高COD去除受到抑制越明顯。

圖3 不同濃度金霉素、 土霉素及3種配比混合物對(duì)COD去除的影響

2.3 不同濃度金霉素和土霉素對(duì)微生物EPS的影響

不同濃度金霉素和土霉素對(duì)微生物EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量的影響如圖4所示。 由圖4(a—d)可知, 隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng), 蛋白質(zhì)和多糖含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 蛋白質(zhì)、 多糖含量分別在36和48 h達(dá)到最大值, 同時(shí)蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于多糖。 分析認(rèn)為在反應(yīng)初期, 金霉素、 土霉素的刺激下使生物除磷中微生物分泌EPS在微生物體表面形成保護(hù)層抵御有害的環(huán)境。 研究表明, 蛋白質(zhì)是保護(hù)細(xì)胞的主要物質(zhì), 為防止細(xì)胞受到毒害, 細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的含量增加[15]。 也有研究發(fā)現(xiàn), EPS表面具有大量帶負(fù)電荷的基團(tuán)和氫鍵、 范德華力能夠與污染物結(jié)合形成復(fù)合物保護(hù)微生物[16]。

圖4 不同濃度金霉素、 土霉素對(duì)EPS組分隨時(shí)間變化情況

然而, 金霉素與土霉素均屬于四環(huán)素類抗生素。 研究表明, 四環(huán)素類抗生素能與核糖體30S亞基中A的位置結(jié)合, 能夠阻止胺基酰-tRNA與核糖體A位置聯(lián)結(jié), 導(dǎo)致了微生物合成蛋白質(zhì)受阻[17]。 當(dāng)金霉素、 土霉素的濃度增加至某臨界值時(shí), EPS表面結(jié)合位點(diǎn)被完全占據(jù), 導(dǎo)致EPS結(jié)構(gòu)遭到破壞, 抗生素進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)而抑制微生物合成蛋白質(zhì)。 因此, 隨反應(yīng)時(shí)間和濃度的增加EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量出現(xiàn)逐漸減少的現(xiàn)象, 從而引起生物除磷功能逐漸下降。 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[18]。 可見(jiàn)EPS含量增加對(duì)于延緩生物除磷性能不斷惡化具有重要作用。

2.4 不同濃度配比金霉素和土霉素混合物對(duì)微生物EPS影響

不同濃度配比金霉素和土霉素混合物對(duì)微生物EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量的影響如圖5所示。 由圖5(a—f)可知, 隨著反應(yīng)時(shí)間的增加, 3種不同濃度配比下微生物EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。 這可能是微生物為了不受到金霉素和土霉素聯(lián)合毒害的作用分泌產(chǎn)生更多的EPS在微生物體表面形成保護(hù)層, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)和多糖含量出現(xiàn)不同程度的增加。 該研究結(jié)果與李娟英等研究的納米氧化鋅和四環(huán)素對(duì)EPS的影響相似[19]。 然而, 隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)及濃度的增加, 金霉素和土霉素在EPS中逐漸積累, 微生物表面的EPS結(jié)構(gòu)遭到破壞, 進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)和多糖的合成, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)和多糖含量下降。

圖5 不同濃度配比混合物對(duì)EPS組分隨時(shí)間變化情況

2.5 3D-EEM分析

2.5.1 不同濃度金霉素和土霉素對(duì)微生物EPS的3D-EEM分析

不同濃度金霉素和土霉素對(duì)生物除磷中微生物EPS影響的3D-EEM如圖6所示。 由圖6可知, 不同濃度金霉素和土霉素作用下EPS的3D-EEM均出現(xiàn)了2種熒光區(qū)域類型, 即熒光峰A(類酪氨酸, Ex=220～230 nm, Em=280～380 nm)和熒光峰B(類色氨酸, Ex=270～290 nm, Em=280～380 nm), 這兩類物質(zhì)都屬于類蛋白質(zhì)物質(zhì)[20]。 隨金霉素、 土霉素濃度的增加類蛋白質(zhì)物質(zhì)熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱。 金霉素3#反應(yīng)器和土霉素6#反應(yīng)器又先后出現(xiàn)了第3、 4個(gè)熒光區(qū)域, 分別記作熒光峰C(類腐殖酸物質(zhì), Ex=320～370 nm, Em=380～450 nm)和熒光峰D(類富里酸物質(zhì), Ex=220～230 nm, Em=380～430 nm)[21]。 其中金霉素生物除磷反應(yīng)器比土霉素反應(yīng)器多了1種類富里酸熒光峰E(Ex=240～260 nm, Em=400～430 nm)。 類富里酸物質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨金霉素濃度的增加不斷增強(qiáng), 說(shuō)明金霉素和土霉素雖然歸屬于四環(huán)素類抗生素, 但是兩者對(duì)生物除磷系統(tǒng)中的微生物EPS影響有所不同, 可能歸屬兩者化學(xué)結(jié)構(gòu)上不同。

圖6 不同濃度金霉素、 土霉素3D-EEM分析圖

由以上分析, 當(dāng)金霉素和土霉素濃度為0.1～5 mg·L-1時(shí), 隨著濃度的增加, 類酪氨酸和類色氨酸的熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。 分析認(rèn)為低濃度金霉素、 土霉素的影響下, 微生物分泌更多的蛋白質(zhì)與金霉素和土霉素結(jié)合以阻止毒害作用, 故酪氨酸峰和類色氨酸峰的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。 然而當(dāng)金霉素和土霉素為10～40 mg·L-1, 隨著濃度的增加, 類酪氨酸峰和類色氨酸峰的熒光強(qiáng)度逐漸減弱, 這表明微生物分泌蛋白質(zhì)受到影響或者蛋白質(zhì)與金霉素和土霉素結(jié)合導(dǎo)致的熒光淬滅, 因此類酪氨酸峰和類色氨酸峰熒光強(qiáng)度逐漸減弱。 在金霉素和土霉素的影響下產(chǎn)生新物質(zhì)類腐殖酸和類富里酸, 并且熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。 分析認(rèn)為高濃度金霉素、 土霉素導(dǎo)致部分微生物死亡和微生物細(xì)胞破碎水解。 少部分微生物的內(nèi)源性呼吸釋放出有機(jī)物質(zhì), 導(dǎo)致類腐殖酸物質(zhì)和類富里酸物質(zhì)熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)[15]。 說(shuō)明了在反應(yīng)后期正磷酸鹽出水濃度超過(guò)進(jìn)水濃度的原因。 因此金霉素和土霉素濃度的增加會(huì)導(dǎo)致生物除磷系統(tǒng)中微生物EPS組分發(fā)生改變, 同時(shí)生物除磷效果也會(huì)受到影響。

2.5.2 不同濃度配比混合物3D-EEM分析

不同濃度配比混合物對(duì)生物除磷中微生物EPS影響的3D-EEM如圖7各圖所示。 由圖7可知, 3種不同濃度配比混合物作用下, EPS中均出現(xiàn)了2種類蛋白質(zhì)物質(zhì), 且隨濃度的增加熒光強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱, 相比單獨(dú)的金霉素和土霉素單獨(dú)作用下, 類蛋白質(zhì)物質(zhì)熒光強(qiáng)度均較弱。 配比L1和L2還出現(xiàn)類腐殖酸物質(zhì)和類富里酸物質(zhì), 其熒光強(qiáng)度也相對(duì)較弱, 說(shuō)明金霉素小于土霉素占比時(shí), 只引起微生物分泌2種類蛋白質(zhì)物質(zhì)出現(xiàn)。 可能兩種抗生素之間具有拮抗作用, 減弱了對(duì)微生物的毒害作用[22]。

圖7 不同濃度配比混合物3D-EEM分析

2.6 FTIR分析

不同濃度金霉素、 土霉素及其混合物對(duì)EPS的官能團(tuán)影響的FTIR光譜圖如圖8(a—e)所示。 由圖8可知, FTIR光譜圖極為相似, 但是隨金霉素、 土霉素及3種配比混合物濃度的增加使某些峰產(chǎn)生位移以及透過(guò)率逐漸增大, 這表明金霉素和土霉素與EPS某些官能團(tuán)發(fā)生作用。

圖8 不同濃度金霉素、 土霉素及3種配比混合物作用下EPS官能團(tuán)的FTIR分析

3 結(jié) 論

(1)金霉素、 土霉素及3種配比混合物對(duì)生物除磷效果和微生物EPS分泌產(chǎn)生影響。 隨著濃度和反應(yīng)時(shí)間增加,EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), EPS含量的增加延緩了除磷過(guò)程的惡化。