Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)參與木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的FTIR光譜特性

曾玉萍, 王 楠, 曹志偉, 宋 巖, 郭洪鵬, 邱小成, 王 帥

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院, 吉林 吉林 132101

引 言

木質(zhì)素是自然界中來自于動(dòng)植物、 含量?jī)H次于纖維素且具有三維穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的高分子聚合物[1], 也是輸入土壤碳源類型中芳香結(jié)構(gòu)最豐富的天然有機(jī)大分子。 在堆肥過程中, 木質(zhì)素的難降解特性使其成為堆肥腐熟的限速因子。 腐殖質(zhì)(humus, HS)是堆肥腐熟的標(biāo)志性產(chǎn)物, 木質(zhì)素與HS形成關(guān)系密切, HS的芳香性主要源于木質(zhì)素, HS是由木質(zhì)素、 蛋白質(zhì)及其中間分解產(chǎn)物在微生物作用下發(fā)生聚合反應(yīng)而形成, 木質(zhì)素對(duì)HS形成的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于纖維素[2]。

在木質(zhì)素腐殖化過程中, 酚類、 醌類及脂類化合物等木質(zhì)素降解產(chǎn)物是HS形成的主要前體物質(zhì)[3]。 HS是由各類前體物質(zhì)縮聚而成, 前體物質(zhì)是調(diào)控HS形成的關(guān)鍵[4]。 Yavmetdinov等[5]指出, 木質(zhì)素的降解產(chǎn)物、 苯丙烷與氨基酸間的共聚合作用可形成類似于HS的高分子聚合物。 在Maillard反應(yīng)中, 氨基酸、 糖和奎寧等前體物質(zhì)對(duì)HS形成至關(guān)重要, 上述前體物質(zhì)通過氧化和親核反應(yīng)可聚合形成類似于HS的暗色物質(zhì)[6]。 Wu等[4]研究了堆肥過程中多酚、 羧酸、 氨基酸、 還原糖和多糖等5類前體物質(zhì)的含量變化, 指出: 前體物質(zhì)通過木質(zhì)素-蛋白質(zhì)途徑、 多酚途徑和Maillard反應(yīng)等機(jī)制顯著促進(jìn)HS的形成[7]。 Zhang等[8]在玉米秸稈和雞糞共堆肥中添加苯甲酸及提取油后的大豆渣來研究前體物質(zhì)對(duì)堆肥HS的影響, 結(jié)果表明, 添加前體物質(zhì)可促進(jìn)堆肥HS的形成, 使腐殖酸得以累積。

可見, 前體物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素轉(zhuǎn)化、 HS形成確有激發(fā)效應(yīng)。 然而, 關(guān)于Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)激發(fā)效應(yīng)在木質(zhì)素向HS轉(zhuǎn)化的影響規(guī)律及機(jī)理方面, 尚缺乏相關(guān)報(bào)道。 鑒于此, 本研究采用液體搖瓶培養(yǎng)法, 以木質(zhì)素培養(yǎng)液為研究對(duì)象, 通過添加鄰苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸的單一及組合溶液, 啟動(dòng)120 d的液體搖瓶培養(yǎng), 采用離心法收集上清液(細(xì)胞代謝產(chǎn)物)和沉淀(菌體殘留物), 從兩者性質(zhì)入手, 重點(diǎn)分析菌體殘留物的FTIR光譜特性, 系統(tǒng)評(píng)價(jià)各前體物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素向HS轉(zhuǎn)化的貢獻(xiàn), 以期為加快堆肥腐熟進(jìn)程、 促進(jìn)木質(zhì)素向HS轉(zhuǎn)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

木質(zhì)素(CAS No.[9005-53-2])購(gòu)于東京化成工業(yè)株式會(huì)社; 鄰苯二酚(C6H6O2, 分子量: 110.11, 含碳量65.4%)、 葡萄糖(C6H12O6, 分子量180.16, 含碳量40.0%)及甘氨酸(C2H5NO2, 分子量: 75.07, 含碳量32.0%)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)試劑。

木質(zhì)素培養(yǎng)液的制備: 將木質(zhì)素1.0 g、 NaNO32.0 g、 K2HPO41.0 g、 KCl 0.5 g、 MgSO40.5 g和FeSO40.01 g溶于1 000 mL蒸餾水中, 不調(diào)pH值。

菌懸液的制備: 在吉林市猴石山(E 126°30′24″, N 43°57′13″)海拔263 m針闊混交林下采集枯枝落葉層與地表界面的新鮮土壤, 去除肉眼可見的植物殘?bào)w, 用1.0 mm孔徑塑料篩就地篩分, 均勻混合、 密封帶回實(shí)驗(yàn)室, 保存于4 ℃冰箱。 稱取100 g新鮮土壤于1 000 mL錐形瓶中, 用200 mL無菌去離子水混合, 在28 ℃氣浴振蕩器中以120 r·min-1的轉(zhuǎn)數(shù)振蕩提取2 h, 靜止沉降30 min后以3 500 r·min-1的轉(zhuǎn)數(shù)離心15 min收集上清液, 制得混合菌懸液。 經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、 改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基、 馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基的稀釋平板法測(cè)定, 懸液中細(xì)菌數(shù)量19.6×106cfu·mL-1、 放線菌數(shù)量3.5×105cfu·mL-1、 真菌數(shù)量4.7×104cfu·mL-1。

1.2 方法

采用液體搖瓶培養(yǎng)法, 量取若干300 mL木質(zhì)素培養(yǎng)液裝入500 mL錐形瓶中。 以添加15 mL無菌去離子水為空白對(duì)照(CK), 另設(shè)7個(gè)添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)的處理: (1)15 mL 0.12 mol·L-1鄰苯二酚(L); (2)15 mL 0.12 mol·L-1葡萄糖(P); (3)15 mL 0.12 mol·L-1甘氨酸(G); (4)7.5 mL 0.12 mol·L-1鄰苯二酚+7.5 mL 0.12 mol·L-1葡萄糖(LP); (5)7.5 mL 0.12 mol·L-1鄰苯二酚+7.5 mL 0.12 mol·L-1甘氨酸(LG); (6)7.5 mL 0.12 mol·L-1葡萄糖+7.5 mL 0.12 mol·L-1甘氨酸(PG); (7)5 mL 0.12 mol·L-1鄰苯二酚+5 mL 0.12 mol·L-1葡萄糖+5 mL 0.12 mol·L-1甘氨酸(LPG)。 每個(gè)處理在0、 60和120 d三個(gè)培養(yǎng)時(shí)間下均重復(fù)三次, 將上述用于培養(yǎng)的錐形瓶用無菌透氣膜統(tǒng)一包扎并進(jìn)行121 ℃的高壓蒸汽滅菌20 min, 待滅菌完全且在無菌條件下自然冷卻后, 按照20 mL菌懸液/培養(yǎng)瓶的接種量在無菌操作條件下進(jìn)行接種, 接種后再次包扎, 在28 ℃恒溫條件下轉(zhuǎn)數(shù)為180～200 r·min-1的搖床中培養(yǎng); 分別在0、 60和120 d進(jìn)行動(dòng)態(tài)取樣, 取樣后立即高速離心(16 000 r·min-1, 10 min), 離心后上清液為細(xì)胞代謝產(chǎn)物, 沉淀為菌體殘留物, 菌體殘留物收集后在60 ℃下鼓風(fēng)干燥, 磨細(xì)過0.01 mm孔徑篩, 備用。

1.3 儀器及數(shù)據(jù)處理

FTIR(Fourier transform infrared spectra): 將菌體殘留物粉末狀樣品與光譜純KBr 1∶100混合、 研磨、 壓片, 利用FTIR-850傅里葉變換紅外光譜儀(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)對(duì)樣品進(jìn)行FTIR測(cè)試: 掃描次數(shù)32, 分辨率4 cm-1,Y軸格式: 透過率, 切趾方式: Triangle, 每次采集樣品前需進(jìn)行背景扣除。

采用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)的TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的光密度(A465 nm和A665 nm)進(jìn)行測(cè)定, 用A465和A665表示, 由此計(jì)算E4/E6=A465/A665; 采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析, 用Excel 2003整理數(shù)據(jù)并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞代謝產(chǎn)物E4/E6及TOC含量

通常, 用腐殖質(zhì)E4/E6可表征其芳香度, 即E4/E6越高, 表明腐殖質(zhì)的芳香度越低[9]。 在本試驗(yàn)中, 鑒于腐殖質(zhì)和細(xì)胞代謝產(chǎn)物均為暗棕色物質(zhì), 因此借用E4/E6來評(píng)價(jià)細(xì)胞代謝產(chǎn)物分子的復(fù)雜程度。 由圖1可知, 添加不同Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物E4/E6的影響規(guī)律不一。 隨著液體培養(yǎng)進(jìn)行, L、 LP和LG處理的細(xì)胞代謝產(chǎn)物E4/E6逐漸增加, P、 G和PG處理的E4/E6先大幅度增高再降低, LPG處理的E4/E6先略有降低再增高, 而CK則表現(xiàn)為漸趨降低的規(guī)律。 與0 d相比, 在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(120 d), L、 P、 LP、 LG和LPG處理的E4/E6分別增高了7.0%、 7.8%、 21.5%、 44.0%和21.4%, 而G、 PG和CK分別下降了26.4%、 3.6%和19.0%。 可見, 由鄰苯二酚參與的4個(gè)處理(L、 LP、 LG和LPG)及單獨(dú)添加葡萄糖更有利于木質(zhì)素培養(yǎng)液細(xì)胞代謝產(chǎn)物的降解、 使其分子結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單, 其中, 添加鄰苯二酚和甘氨酸的組合溶液在提高細(xì)胞代謝產(chǎn)物E4/E6、 促進(jìn)有機(jī)分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化方面的優(yōu)勢(shì)最大, 鄰苯二酚的加入能夠促進(jìn)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的降解, 使其分子結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單, 而單一添加甘氨酸在降低細(xì)胞代謝產(chǎn)物E4/E6、 促進(jìn)有機(jī)分子縮合、 使其結(jié)構(gòu)復(fù)雜方面更有優(yōu)勢(shì)。 木質(zhì)素-蛋白質(zhì)理論和酚-蛋白質(zhì)理論均涉及到多酚和氨基酸之間的縮聚反應(yīng), 是自然界中重要的腐殖化途徑[10]。 Wu等[11]報(bào)道指出, 在堆肥過程中, 堆料氨基酸含量下降了68.3%, 而HS的形成數(shù)量增加了37.33%, 可見, 氨基酸是通過土壤或堆肥中發(fā)生的氧化聚合過程形成HS的重要前體物質(zhì)。 Tan等[7]利用美拉德反應(yīng)還解釋了在多糖、 還原糖和氨基酸參與下, 缺失多酚的環(huán)境中形成HS的情況。 由此可知, 酚類并不是HS形成的必需前體物質(zhì)。 甘氨酸是氨基酸系列中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一類物質(zhì), 其添加可增加細(xì)胞代謝產(chǎn)物分子的復(fù)雜程度, 而鄰苯二酚的參與和單一葡萄糖的添加起到了給微生物供能的作用, 增強(qiáng)了細(xì)胞代謝產(chǎn)物的降解。

圖1 添加不同Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化形成細(xì)胞代謝產(chǎn)物E4/E6的影響

由圖2所示, 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng), 各處理的細(xì)胞代謝產(chǎn)物TOC含量均表現(xiàn)為先大幅度下降再有所提升的規(guī)律。 與0 d相比, 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(120 d), L、 P、 G、 LP、 LG、 PG、 LPG及CK處理的細(xì)胞代謝產(chǎn)物TOC含量分別下降了38.8%、 37.7%、 17.8%、 42.0%、 39.6%、 24.0%、 35.1%和6.7%。 可見, 與CK相比, 外源添加的Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)可在一定程度上充當(dāng)微生物的能量物質(zhì)[12], 促進(jìn)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的礦化、 使其TOC含量下降, 其中, LP處理優(yōu)勢(shì)最大, 其次為L(zhǎng)G。 盡管如此, 培養(yǎng)結(jié)束時(shí), 添加不同Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)的細(xì)胞代謝產(chǎn)物TOC含量仍顯著高于CK, 這與外源加入Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)本身的含碳量有關(guān), 鄰苯二酚的含碳量是65.4%, 遠(yuǎn)高于葡萄糖40.0%和甘氨酸32.0%的含碳量, 因此在整個(gè)培養(yǎng)期間, 單一添加鄰苯二酚的細(xì)胞代謝產(chǎn)物TOC含量始終高于其他處理, 而CK則一直處于最低水平。

圖2 添加不同Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化形成細(xì)胞代謝產(chǎn)物TOC含量的影響

2.2 菌體殘留物回收率及其總有機(jī)碳(TOC)含量

由圖3可見, 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 不同處理的菌體殘留物回收率呈現(xiàn)不同的規(guī)律。 LP處理的菌體殘留物回收率先升高后下降, CK的逐漸降低, 而L、 P、 G、 LG、 PG和LPG處理則表現(xiàn)為漸趨增高的規(guī)律。 與0 d相比, 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(120 d), 除了CK的菌體殘留物回收率由3.3%降至2.1%, L、 P、 G、 LP、 LG、 PG和LPG處理菌體殘留物回收率分別增加了123.3%、 43.7%、 48.1%、 20.2%、 87.6%、 97.7%和15.1%。 可見, 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)可顯著提升木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化形成菌體殘留物的回收率。 Zhang等[8]研究指出, 添加更多的前體物質(zhì)能夠促進(jìn)堆肥腐熟并提高HS形成的數(shù)量。 相比較而言, 單一添加鄰苯二酚的優(yōu)勢(shì)最明顯, 鄰苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸三者組合溶液對(duì)菌體殘留物回收率的提升幅度最小, 葡萄糖和甘氨酸的組合溶液使菌體殘留物回收率在整個(gè)培養(yǎng)期間始終處于最高水平, 這是因?yàn)槠咸烟墙o微生物供能, 木質(zhì)素和甘氨酸可以結(jié)合形成木質(zhì)素-蛋白質(zhì)復(fù)合物, 這也是HS形成的核心[13]。

圖3 添加不同Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化形成菌體殘留物回收率的影響

由圖4可知, 隨著培養(yǎng)進(jìn)行, 各處理的菌體殘留物TOC含量有著不同的變化規(guī)律。 其中, L、 LG、 PG和CK的菌體殘留物TOC含量逐漸增加, P、 LP和LPG處理的菌體殘留物TOC含量先大幅度增高再有所下降, 而G處理先有所降低再大幅度增加。 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(120 d), L、 P、 G、 LP、 LG、 PG、 LPG和CK的菌體殘留物TOC含量分別是培養(yǎng)0 d結(jié)果的11.6倍、 3.3倍、 3.5倍、 8.1倍、 8.7倍、 4.2倍、 7.7倍和13.3倍。 可見, 由于0 d培養(yǎng)下CK的菌體殘留物TOC含量最低, 因此添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)處理的菌體殘留物TOC含量的增加幅度均小于CK, 但橫向比較培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(120 d)的結(jié)果可知, 鄰苯二酚參與的4個(gè)處理(L、 LP、 LG和LPG)及PG處理的菌體殘留物TOC含量均顯著高于CK。 其中, 單獨(dú)添加鄰苯二酚處理的菌體殘留物TOC含量為最高(666.7 g·kg-1), 其次為鄰苯二酚和甘氨酸的組合溶液(641.5 g·kg-1)。 單一添加葡萄糖和甘氨酸下的菌體殘留物TOC含量最小, 分別為237.6和231.9 g·kg-1, 上述單獨(dú)添加鄰苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸墩菌體殘留物TOC含量的影響差異均是由本身含碳量決定的。 HS形成和微生物活動(dòng)之間的底物競(jìng)爭(zhēng)不可避免地影響HS形成的效率[14]。 Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)既可作為底物給微生物供能, 同時(shí)還能參與微生物周轉(zhuǎn)最終形成菌體殘留物。

圖4 添加不同Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化形成菌體殘留物TOC含量的影響

2.3 菌體殘留物FTIR特征

表1 峰位及歸屬情況

圖5 添加不同Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化菌體殘留物FTIR光譜的影響

各特征峰相對(duì)強(qiáng)度的半定量分析結(jié)果見表2。 由表2可知, 經(jīng)過120 d的液體搖瓶培養(yǎng), 各處理下菌體殘留物中的羥基含量均有著不同程度提高, 多糖類物質(zhì)含量有所下降, 上述規(guī)律表明: 隨液體搖瓶培養(yǎng)的進(jìn)行, 微生物以木質(zhì)素降解產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)為能源物質(zhì), 伴隨微生物對(duì)木質(zhì)素的進(jìn)一步氧化降解, 木質(zhì)素降解產(chǎn)物也成為了HS形成的重要前體物質(zhì)[19], 死亡微生物以菌體形式與木質(zhì)素降解產(chǎn)物間以氫鍵形式相互締結(jié)[20], 最終形成菌體殘留物, 在此過程羥基振動(dòng)加強(qiáng)、 多糖比例下降[21]。 為了明確菌體殘留物中脂族碳和芳香碳的比例變化, 結(jié)合表1中的峰位歸屬情況, 用(a+b)/(c+d)比值表征兩者間的相對(duì)含量變化, 根據(jù)該比值變化規(guī)律可知, G、 PG和CK的(a+b)/(c+d)比值在完成培養(yǎng)時(shí)均有所增加, 表明在木質(zhì)素培養(yǎng)液中單獨(dú)添加甘氨酸, 葡萄糖和甘氨酸的組合溶液以及CK下的無菌去離子水, 經(jīng)培養(yǎng)所收集的菌體殘留物脂族化程度更高了, 而L、 P、 LP、 LG和LPG處理的(a+b)/(c+d)比值歷經(jīng)培養(yǎng)后有著不同程度下降, 表明菌體殘留物在單獨(dú)添加鄰苯二酚、 葡萄糖、 鄰苯二酚和葡萄糖的組合溶液、 鄰苯二酚和甘氨酸的組合溶液以及三者共存溶液影響下芳構(gòu)化程度提高了, 其中, 鄰苯二酚參與的4個(gè)處理及單獨(dú)添加葡萄糖均有利于菌體殘留物穩(wěn)定型碳比例的提高。 以鄰苯二酚為代表的多酚在非生物腐殖化過程中是一種比還原糖和氨基酸更不穩(wěn)定且反應(yīng)性更強(qiáng)的前體物質(zhì)[22], 可顯著促進(jìn)HS的芳香性, 使HS分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[23]。 Zhang等[24]添加不同濃度的鄰苯二酚, 探討了MnO2對(duì)葡萄糖和甘氨酸非生物縮合的影響, 結(jié)果表明, 提高鄰苯二酚濃度可促進(jìn)富里酸(FA)和胡敏酸(HA)的形成, 更有助于提高HA分子的不飽和度。 有研究表明, 木質(zhì)素等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多酚聚合物, 在堆肥過程中也會(huì)降解, 產(chǎn)生簡(jiǎn)單的酚類, 然后代謝或參與聚合反應(yīng), 在HS的形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7, 25]。 葡萄糖作為重要的能量和碳源, 可以直接參與HS的形成[8], 促進(jìn)FA向HA轉(zhuǎn)化, 使分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步復(fù)雜化。

表2 菌體殘留物FTIR主要吸收峰相對(duì)強(qiáng)度的變化

3 結(jié) 論

(1)在木質(zhì)素培養(yǎng)液中添加甘氨酸, 歷經(jīng)液體搖瓶培養(yǎng)更有利于細(xì)胞代謝產(chǎn)物有機(jī)分子的縮合, 使其結(jié)構(gòu)更加就復(fù)雜, 而鄰苯二酚參與的處理及單獨(dú)添加葡萄糖更易促進(jìn)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的降解, 使其分子結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單。 與CK相比, 外源添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)更能促進(jìn)細(xì)胞代謝產(chǎn)物TOC含量的損失, 僅添加鄰苯二酚會(huì)使細(xì)胞代謝產(chǎn)物TOC含量始終高于其他處理;

(2)添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)可顯著提升木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化形成菌體殘留物的回收率, 單獨(dú)添加鄰苯二酚對(duì)菌體殘留物回收率的提升幅度最大, 而鄰苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸三者組合溶液對(duì)菌體殘留物回收率的提升幅度最小, 葡萄糖和甘氨酸的組合溶液使菌體殘留物回收率在整個(gè)培養(yǎng)期間始終處于最高水平。 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)使菌體殘留物TOC含量的增加幅度小于CK, 盡管如此, 培養(yǎng)結(jié)束時(shí), 鄰苯二酚參與的4個(gè)處理、 葡萄糖和甘氨酸組合溶液的添加使菌體殘留物TOC含量顯著高于CK;

(3)木質(zhì)素經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化形成的菌體殘留物與土壤胡敏酸有著相似的FTIR特征, 但其分子縮合度尚無法達(dá)到土壤胡敏酸的復(fù)雜程度。 各處理在完成培養(yǎng)后, 菌體殘留物中的羥基含量有著不同程度增加, 而多糖含量有所下降, 單獨(dú)甘氨酸以及葡萄糖和甘氨酸組合溶液的添加使菌體殘留物的脂族化程度提高, 而鄰苯二酚參與的4個(gè)處理及單一添加葡萄糖可使菌體殘留物的芳構(gòu)化程度進(jìn)一步提高。