基于主成分分析的多重定量PCR熒光串?dāng)_校正

王 鵬, 王振亞, 汪 舜, 張 杰, 張 哲, 楊天航, 王弼陡1, *,羅剛銀1, *, 翁良飛, 張翀宇, 李 原

1. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院(蘇州), 生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部, 江蘇 蘇州 215163

2. 中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所工程化研究中心, 江蘇 蘇州 215163

3. 重慶國(guó)科醫(yī)創(chuàng)科技發(fā)展有限公司分子診斷中心, 重慶 400700

引 言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是分子生物學(xué)常用的檢測(cè)手段, 能夠檢測(cè)生物特定DNA和RNA的濃度, 對(duì)疾病診斷、 法醫(yī)鑒定和食品安全檢測(cè)等應(yīng)用有重要的意義[1-5]。 其主要原理是在PCR過(guò)程中, 加入能夠與待測(cè)核酸反應(yīng)的特定熒光基團(tuán), 通過(guò)檢測(cè)熒光值的上升, 推算核酸量的增加過(guò)程。 理論上, 檢測(cè)到的熒光值大小, 能夠?qū)?yīng)已反應(yīng)熒光染料的濃度, 可以推算出核酸的量。

在實(shí)際操作中, 由于激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的重疊以及濾光片過(guò)濾帶寬限制帶來(lái)的熒光串?dāng)_, 使測(cè)得的信號(hào)無(wú)法真實(shí)反映被測(cè)目標(biāo)的準(zhǔn)確值。 研究中主要采取以下幾種解決方式來(lái)減少串?dāng)_帶來(lái)的影響, (一)通過(guò)系統(tǒng)設(shè)計(jì), 如濾光片選擇或分時(shí)復(fù)用等方式, 最大限度地減少干擾的存在。 如Lewis等采用分時(shí)復(fù)用的方式將各波段的激光脈沖及對(duì)應(yīng)染料的熒光信號(hào)在時(shí)間上分離, 消除了傳統(tǒng)DNA測(cè)序技術(shù)的光譜串?dāng)_[6]。 該方法降低了對(duì)染料的要求, 但對(duì)所用熒光染料仍有所限制。 (二)根據(jù)系統(tǒng)采用的硬件參數(shù), 正向計(jì)算獲得熒光補(bǔ)償系數(shù)。 如Gei?ler等設(shè)計(jì)的FRET生物傳感器, 其補(bǔ)償矩陣中各元素通過(guò)熒光光譜直接計(jì)算獲得[7]。 Liu等同樣是通過(guò)熒光光譜獲得串?dāng)_數(shù)據(jù), 獲得了待測(cè)對(duì)象的精確測(cè)量結(jié)果[8]。 以上方法均是根據(jù)硬件的物理參數(shù)進(jìn)行計(jì)算熒光補(bǔ)償矩陣中各個(gè)元素的具體值。 實(shí)際系統(tǒng)往往與理論值有些許偏差, 再加上激發(fā)光和發(fā)射光的疊加影響, 導(dǎo)致計(jì)算過(guò)程復(fù)雜。 還有一種比較常用的確定串?dāng)_的方式, 通過(guò)實(shí)驗(yàn)反向求解串?dāng)_系數(shù)。 Yin、 Li和Huang等分別在各自的DNA測(cè)序研究中, 采用四維空間聚類方法, 通過(guò)迭代計(jì)算, 確定熒光強(qiáng)度分布和染料濃度之間的映射關(guān)系[9-11]。 Domnioru等提出利用信號(hào)的強(qiáng)度差異代替信號(hào)本身來(lái)進(jìn)行計(jì)算, 使得無(wú)需基線調(diào)整, 即可實(shí)現(xiàn)串?dāng)_校正的目的[12]; 該算法主要是針對(duì)4種及以下不同的熒光的分離與分析, 對(duì)于4種以上染料組合討論較少。 對(duì)于4種以上熒光串?dāng)_的計(jì)算, Gothot等通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得線性方程組的各個(gè)系數(shù), 從而得到熒光補(bǔ)償矩陣[13]。 在補(bǔ)償效果評(píng)估方面, Li等在研究中提出了一種定量方法來(lái)評(píng)價(jià)串?dāng)_校正的質(zhì)量[11]。 臧留琴等在標(biāo)準(zhǔn)迭代四維聚類分析的基礎(chǔ)上提出了一種對(duì)串?dāng)_矩陣進(jìn)行估算的方法[14]。 以上方法實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程繁瑣, 或需要通過(guò)多次迭代才能獲得比較理想的補(bǔ)償矩陣。

主成分分析(principal component analysis, PCA)是一種常見(jiàn)的數(shù)據(jù)分析方式, 常用于高維數(shù)據(jù)的降維, 可用于提取數(shù)據(jù)的主要特征分量。 目前已有研究者將其應(yīng)用于微弱信號(hào)分離。 Hasegawa提出了利用主成分分析檢測(cè)混合光譜中微弱光譜變化的方法[15-16]。 有研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行光譜流式檢測(cè)時(shí), 提出利用主成分分析、 多元曲線分辨以及交替最小二乘法得到純組分光譜及其組分濃度。 該方法計(jì)算量小, 能夠快速定位獲得目標(biāo)數(shù)據(jù)。

本研究將主成分分析方法應(yīng)用于熒光定量PCR測(cè)量過(guò)程中的熒光補(bǔ)償, 適用于4色及以上的多重?zé)晒庋a(bǔ)償。 本方法不需經(jīng)過(guò)迭代, 即可獲得補(bǔ)償矩陣, 有效地減少計(jì)算量。 采用得到的熒光補(bǔ)償矩陣去除非目標(biāo)通道的熒光串?dāng)_, 可實(shí)現(xiàn)熒光通道數(shù)據(jù)的解耦。

1 理 論

在多重?zé)晒舛縋CR設(shè)備的設(shè)定中, 各染料理論發(fā)射熒光值記為“染料向量”F, 各通道的檢測(cè)值記為“檢測(cè)向量”R, 理想情況下F等于R, 但在實(shí)際操作中, 由于濾光片的選擇、 光譜重疊等因素影響, 導(dǎo)致測(cè)得的“檢測(cè)向量”R無(wú)法直接用于表示各染料的實(shí)際濃度值。 向量F與向量R之間關(guān)系如式(1)。

R=MF

(1)

式(1)中, 轉(zhuǎn)換矩陣M為n×n的方陣,n為熒光染料/檢測(cè)通道數(shù)量, 該矩陣即為熒光串?dāng)_矩陣。M的列向量表示某染料在各個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度。 計(jì)算的目標(biāo)是針對(duì)特定系統(tǒng)得到矩陣M, 但在實(shí)際檢測(cè)中, 由于無(wú)法直接獲得“染料向量”F中各元素的理論值, 因此無(wú)法通過(guò)方程線性求解系數(shù)的方式進(jìn)行計(jì)算。

為了方便描述, 考慮二維數(shù)據(jù)情形, 假設(shè)有兩種熒光染料dye1和dye2及其對(duì)應(yīng)檢測(cè)通道channel1和channel2, 當(dāng)取不同濃度的dye1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí), 由于熒光光譜的重疊, 會(huì)有部分熒光進(jìn)入到channel2中, 實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)將如圖1所示, 其中X軸為channel1數(shù)據(jù),Y軸為channel2數(shù)據(jù)。 在系統(tǒng)硬件一定的情況下, 可以看出dye1在channel1和channel2中的比例相對(duì)固定, 其中的數(shù)據(jù)波動(dòng)來(lái)源于測(cè)量誤差。 計(jì)算熒光串?dāng)_, 就是要確定dye1在各通道中的讀數(shù)比例。

圖1 兩通道數(shù)據(jù)分布和其降維后的投影向量

主成分分析是數(shù)據(jù)分析中常用的降維方法, 其原理是通過(guò)尋找一組新的坐標(biāo)系, 將原始數(shù)據(jù)投影至該坐標(biāo)系下, 同時(shí)最大限度地保留原始信息。 將其原理應(yīng)用于串?dāng)_補(bǔ)償, 對(duì)于二維坐標(biāo)系的情形, 若想進(jìn)行降維, 很容易觀察到, 圖1中e所指的方向即為將來(lái)降維后新坐標(biāo)系的基。 因此通過(guò)主成分分析方法, 找到其第一主成分, 其所代表的方向即指出了染料在各個(gè)通道的分布情況。 以上是在兩個(gè)通道的情形下進(jìn)行計(jì)算, 當(dāng)通道數(shù)增多時(shí), 該計(jì)算方法的優(yōu)勢(shì)將更加明顯。

將上述方法拓展到n個(gè)染料的情況, 當(dāng)采用某個(gè)單一染料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí), 將會(huì)得到不同濃度的該染料在各個(gè)檢測(cè)通道熒光分布情況, 測(cè)得的數(shù)據(jù)組成一個(gè)n×i的矩陣, 其中n為通道數(shù),i為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。 對(duì)該矩陣中的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析, 得到第一主成分。 新得到的“主成分”所表示的并不是某一通道的熒光值, 而是一種抽象的混合熒光; 雖然如此, 但是該主成分所表示的向量, 明確地給出各熒光通道所占比例。 通過(guò)將該主成分旋轉(zhuǎn), 即可反向計(jì)算得到該染料真正的熒光值或者相對(duì)熒光值, 同時(shí)其對(duì)其他通道的串?dāng)_也得到了量化, 通過(guò)計(jì)算將該部分串?dāng)_從其他通道中剔除。 對(duì)其他通道染料進(jìn)行同樣的單一染料實(shí)驗(yàn)和分析, 可以獲得其他染料的主成分向量。 將得到的n個(gè)主成分向量分別作為矩陣的n個(gè)列向量, 即可獲得矩陣M。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 測(cè)試平臺(tái)

設(shè)計(jì)了如圖2所示檢測(cè)光路, 激發(fā)光路由LED光源、 準(zhǔn)直透鏡、 激發(fā)濾光片、 二向色鏡及熒光收集透鏡組成, 激發(fā)光激發(fā)樣品管內(nèi)熒光物質(zhì), 發(fā)射的熒光經(jīng)過(guò)熒光收集透鏡、 二向色鏡、 發(fā)射濾光片、 熒光聚焦透鏡, 由探測(cè)器接收。

圖2 光學(xué)原理圖

在系統(tǒng)設(shè)計(jì)時(shí), 選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾光片對(duì), 以優(yōu)化激發(fā)光收集, 同時(shí)最小化熒光團(tuán)之間的串?dāng)_。 由于很多熒光物質(zhì)的斯托克斯位移只約30 nm, 因此要求激發(fā)和發(fā)射濾光片必須有矩形化的通帶波形和較高的截止深度。 各通道選用LED激發(fā)光源均具有特定的光譜曲線, 在保證充分激發(fā)功率的同時(shí), 還需要考慮熒光基團(tuán)之間的串?dāng)_和其他通道激發(fā)光之間的串色問(wèn)題。 其主要矛盾為: FAM、 HEX、 ROX、 Cy5的發(fā)射波長(zhǎng)分別與HEX、 ROX、 Cy5、 Cy5.5的激發(fā)波長(zhǎng)有一定程度的疊加, 因此在考慮較高的檢測(cè)效率和信噪比的同時(shí), 應(yīng)盡可能減少光譜重疊。 基于上述原理, 所選擇的5通道濾光片組合及二向色鏡參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)所用光學(xué)元件參數(shù)表

5種染料的熒光發(fā)射光譜及本實(shí)驗(yàn)平臺(tái)所選擇的檢測(cè)通道如圖3所示。 由圖3可以看出, 選擇的硬件可以將大部分非目標(biāo)通道熒光過(guò)濾掉, 但在各目標(biāo)通道內(nèi), 仍或多或少的混入了其他熒光染料的發(fā)射光。

圖3 染料的熒光光譜及對(duì)應(yīng)檢測(cè)通道

2.2 試劑

研究了FAM、 HEX、 ROX、 Cy5和Cy5.5五種染料的光譜串?dāng)_。 染料采購(gòu)自ThermoFisher, 相關(guān)信息見(jiàn)表2。 采用凱基生物的磷酸鹽緩沖液(PBS, 貨號(hào): KGB5001)作為稀釋劑進(jìn)行染料稀釋。

表2 測(cè)試所用試劑信息

2.3 補(bǔ)償矩陣的確定

補(bǔ)償矩陣的測(cè)試需進(jìn)行單一染料實(shí)驗(yàn)。 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前, 需先確定系統(tǒng)熒光染料濃度線性范圍。 將5種染料分別稀釋8個(gè)梯度, 為了減少實(shí)驗(yàn)誤差, 每個(gè)梯度進(jìn)行3重復(fù), 10 min內(nèi)連續(xù)讀取, 對(duì)讀取的熒光檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 確定染料的線性范圍, 同時(shí)確定各染料的熒光背景。

分別在各染料濃度線性范圍內(nèi), 再選取16個(gè)濃度梯度, 加入PBS稀釋劑, 配制成單一染料溶液, 分別將單一染料放入搭建的實(shí)驗(yàn)平臺(tái), 每隔30 s讀取一次, 重復(fù)讀取20次。 對(duì)于任一單一染料, 每次讀數(shù)均可得到所有通道熒光檢測(cè)數(shù)據(jù)。 采用前述提出的方法, 處理實(shí)驗(yàn)得到的各通道數(shù)據(jù), 可得到熒光補(bǔ)償矩陣。

2.4 多重顏色分辨實(shí)驗(yàn)

由于無(wú)法得到不同濃度染料的理論熒光值, 因此在多種染料混合測(cè)試時(shí), 評(píng)價(jià)染料的串?dāng)_程度比較困難。 設(shè)計(jì)了一組顏色分辨實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證前述算法結(jié)果的準(zhǔn)確性。 為了保證每各染料濃度都有相同機(jī)會(huì)接受測(cè)試, 而不受試驗(yàn)人員主觀傾向的影響, 采用隨機(jī)方式將不同濃度的多種染料進(jìn)行組合測(cè)試, 將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行熒光補(bǔ)償后, 評(píng)價(jià)各染料熒光的線性度。 在PCR管中以盲法分析5種染料的混合物, 5種染料分別取各自線性范圍內(nèi)的6個(gè)濃度, 濃度從大到小依次編號(hào)1—6, 隨機(jī)混合12組混合染料, 染料溶液混合方式由Matlab隨機(jī)數(shù)發(fā)生器確定, 具體混合見(jiàn)表3, 每種混合方式對(duì)測(cè)試平臺(tái)是未知的。

表3 染料隨機(jī)組合表

3 結(jié)果與討論

3.1 補(bǔ)償矩陣的計(jì)算結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果如圖4(a—e)所示, 分別表示用FAM、 HEX、 ROX、 Cy5和Cy5.5單一染料進(jìn)行測(cè)試時(shí), 各通道測(cè)得的熒光數(shù)據(jù), 其中橫坐標(biāo)為相對(duì)應(yīng)染料的熒光值, 縱坐標(biāo)為其余通道的熒光值, 圖中數(shù)據(jù)已被去除熒光背景。

圖4 不同濃度染料在各個(gè)通道的測(cè)試結(jié)果

從圖4(b)中可以看出, HEX染料對(duì)FAM通道、 ROX染料對(duì)HEX通道、 Cy5染料對(duì)Cy5.5通道、 Cy5.5通道對(duì)Cy5通道分別有明顯的干擾, FAM染料對(duì)HEX通道有輕微的串?dāng)_, 其余通道無(wú)明顯的串?dāng)_。 另外, 從圖中可以看出隨著染料濃度的降低, 受干擾通道的線性度降低, 這是由于低濃度時(shí), 受干擾通道接受到的光信號(hào)較弱, 超出了系統(tǒng)可檢測(cè)的線性范圍。 這種非線性對(duì)于熒光補(bǔ)償來(lái)說(shuō)是不利的, 但由于熒光值本身較小, 對(duì)檢測(cè)影響不大。 個(gè)別濃度熒光值橫軸間距不一致, 此外, 在低濃度時(shí), 檢測(cè)結(jié)果聚集成團(tuán), 推測(cè)是由于手動(dòng)配制染料及實(shí)驗(yàn)誤差所導(dǎo)致。

利用主成分分析方法, 獲得熒光補(bǔ)償矩陣見(jiàn)式(2)。

(2)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 由于系統(tǒng)誤差帶來(lái)的數(shù)據(jù)波動(dòng), 導(dǎo)致串?dāng)_矩陣中部分元素出現(xiàn)負(fù)數(shù), 但理論上, 不應(yīng)產(chǎn)生負(fù)串?dāng)_, 因此, 將負(fù)值設(shè)為0, 并對(duì)矩陣的每一列重新歸一化, 得到新的串?dāng)_矩陣見(jiàn)式(3)。

(3)

觀察串?dāng)_矩陣發(fā)現(xiàn), Cy5通道對(duì)Cy5.5通道串?dāng)_較大, 串?dāng)_比例為8.76%, 意味著當(dāng)僅采用Cy5染料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí), Cy5.5通道也可檢測(cè)到Cy5通道數(shù)值約8.76%的熒光值; 同樣, Cy5.5通道對(duì)Cy5通道串?dāng)_影響也相對(duì)較大, 比例約為6.2%; 其次是ROX通道對(duì)HEX通道串?dāng)_, 比例約為2.68%; HEX通道對(duì)FAM通道串?dāng)_, 比例約為1.58%; FAM通道對(duì)HEX通道串?dāng)_相對(duì)較小, 比例約為0.25%, 其余通道無(wú)明顯串?dāng)_。 與圖4顯示結(jié)果一致。

3.2 單一染料熒光補(bǔ)償結(jié)果

將圖4中測(cè)試數(shù)據(jù)R, 代入式(1), 進(jìn)行熒光補(bǔ)償計(jì)算, 得到染料的理論熒光值F, 以同樣的方式繪制各通道數(shù)據(jù), 如圖5(a—e)所示。

圖5 經(jīng)過(guò)串?dāng)_補(bǔ)償后不同濃度染料在各個(gè)通道的分布情況

由圖5(a—e)中可以看出, 經(jīng)過(guò)補(bǔ)償之后, 非目標(biāo)通道的數(shù)據(jù)基本呈水平狀態(tài), 對(duì)各個(gè)通道分別進(jìn)行線性擬合, 斜率最大為10-8, 趨近于零, 即非目標(biāo)通道數(shù)值不隨目標(biāo)通道染料熒光值的上升而變化, 實(shí)現(xiàn)了熒光通道間串?dāng)_的解耦。

3.3 多重顏色分辨實(shí)驗(yàn)結(jié)果

熒光補(bǔ)償矩陣與測(cè)試平臺(tái)硬件及染料特性具有密切相關(guān)性, 當(dāng)測(cè)試平臺(tái)和染料熒光特性不變, 通過(guò)單一染料實(shí)驗(yàn)獲得的補(bǔ)償矩陣, 同樣適用于多重染料的情況。 將不同濃度混合的染料放入搭建的實(shí)驗(yàn)平臺(tái), 分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 將得到的測(cè)試結(jié)果代入前述補(bǔ)償矩陣, 測(cè)得各染料濃度柱狀圖見(jiàn)圖6。

圖6 混合染料的測(cè)試數(shù)據(jù)

對(duì)比觀察表3和圖6發(fā)現(xiàn), 同一濃度的同一染料, 在不同的混合組合中, 熒光值相差不大, 沒(méi)有受到其他通道的明顯干擾。 從圖4(d)中可知, Cy5染料對(duì)Cy5.5通道有明顯的串?dāng)_, 表3中組合5和組合9里Cy5染料的濃度相差較大, 而兩組中Cy5.5染料濃度較低且為同一值, 由圖6看出, 經(jīng)過(guò)補(bǔ)償補(bǔ)償后, 無(wú)論Cy5的染料濃度多大, Cy5.5的熒光值基本不受影響。 另外, ROX對(duì)HEX有明顯串?dāng)_, 在組合5和組合12中, HEX濃度均為同一低值, 但ROX濃度相差較大, 但從圖6可以看出, 兩個(gè)組合中, HEX染料的熒光值基本一致, 未受到明顯的干擾。 補(bǔ)償算法有效地去除了染料間的干擾。

對(duì)各混合物中測(cè)得的不同濃度染料按照濃度大小進(jìn)行了排序, 并取對(duì)數(shù)。 由圖7看出, 對(duì)同一染料的不同濃度梯度進(jìn)行擬合, 最大線性相關(guān)系數(shù)為0.999 3, 采用該算法, 能夠很好地對(duì)染料的原始熒光進(jìn)行區(qū)分。

圖7 各染料梯度的線性擬合

4 結(jié) 論

光譜重疊現(xiàn)象廣泛存在于熒光定量PCR等多種熒光檢測(cè)領(lǐng)域, 對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)不利影響。 本工作提出將主成分分析中求解主成分向量的計(jì)算方法, 應(yīng)用到熒光定量PCR系統(tǒng)中, 該方法無(wú)需經(jīng)過(guò)迭代計(jì)算, 即可獲得系統(tǒng)的熒光補(bǔ)償矩陣。 經(jīng)過(guò)該矩陣的轉(zhuǎn)換, 能夠非常有效地分離各個(gè)熒光通道數(shù)據(jù)。 設(shè)計(jì)了染料分辨實(shí)驗(yàn), 通過(guò)對(duì)隨機(jī)組合的6個(gè)不同濃度的5種染料混合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試和分析, 從中高效地分離了各個(gè)染料成分及其濃度, 進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的有效性。 本方法不受通道數(shù)量限制, 不僅可用于熒光定量PCR系統(tǒng)的熒光補(bǔ)償校正, 也可用于其他具有串?dāng)_問(wèn)題的光譜分析, 具有較高的使用拓展性。