利用ATR-FTIR研究脂質(zhì)納米粒的鼻黏液滲透性

王健敏, 李雪梅, 馬士超, 李志勇, 唐華東, 馬鳳森*

1. 浙江工業(yè)大學(xué)前沿交叉科學(xué)研究院, 浙江 杭州 310014

2. 浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 德清 313216

引 言

經(jīng)鼻遞送對(duì)于流感或新冠疫苗等的針對(duì)呼吸系統(tǒng)病毒感染的預(yù)防具有重要應(yīng)用價(jià)值[1-2], 鼻腔給藥時(shí)高度血管化和相對(duì)容易滲透的表面, 可繞過胃腸道的酸和酶降解以及肝臟首過代謝, 鼻黏膜的良好血液循環(huán)使藥物吸收迅速, 可產(chǎn)生快速的局部作用或全身作用[3], 使得鼻腔途徑給藥成為注射和口服等傳統(tǒng)給藥方式的很好補(bǔ)充和備選, 近年來已越來越受到人們的關(guān)注。

藥物經(jīng)鼻給藥時(shí), 必須面臨黏膜上皮存在的復(fù)雜的黏液屏障。 黏液是復(fù)雜的生物聚合物屏障, 其主要功能包括潤滑上皮, 維持水合層, 與底層上皮交換氣體和營養(yǎng)物質(zhì), 以及作為病原體和異物的屏障。 粘蛋白是該屏障的主要功能成分, 可通過二硫鍵形成高密度粘蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu), 平均孔徑在200～300 nm, 允許水、 氣體、 營養(yǎng)物質(zhì)等小分子通過, 但同時(shí)也可減少分子和顆粒的滲透以及擴(kuò)散速率, 因此當(dāng)藥物制劑大于網(wǎng)孔時(shí)易發(fā)生空間位阻效應(yīng)[4]。 此外, 藥物制劑與粘蛋白的分子間相互作用也是影響藥物在黏液中擴(kuò)散的因素, 該作用受多種因素影響, 如制劑所帶電荷、 親疏水性等。 鑒于黏液的保護(hù)與清除異物功能, 研究外物分子在其中的擴(kuò)散具有生理病理學(xué)和生物藥劑學(xué)意義, 是藥物制劑設(shè)計(jì)時(shí)需要考量的藥物能否有效進(jìn)入黏膜的重要因素。 然而, 在體方法研究藥物在鼻黏液中的滲透與轉(zhuǎn)運(yùn)過程較為繁瑣, 受干擾因素多[5], 難以對(duì)其進(jìn)行量化分析, 迫切需要建立有效的體外評(píng)價(jià)方法對(duì)鼻黏膜制劑進(jìn)行處方工藝優(yōu)化與生物藥劑學(xué)評(píng)價(jià)。

非破壞性的、 無需標(biāo)記、 可實(shí)時(shí)提供與藥物結(jié)構(gòu)相關(guān)數(shù)據(jù)的衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy, ATR-FTIR)技術(shù), 早已成功應(yīng)用于物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析研究[6], 但尚未見以此作為物質(zhì)在黏液中的滲透性評(píng)價(jià)的報(bào)導(dǎo)。 為在體外探究藥物制劑的不同表面性質(zhì)對(duì)其黏液滲透性的影響, 本工作探索采用該技術(shù)對(duì)所制備的不同性質(zhì)(即粒徑與電荷)的脂質(zhì)體的黏液滲透性進(jìn)行檢測(cè), 并通過分析粘蛋白酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)所包含的二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、 β折疊、 β-轉(zhuǎn)角、 無規(guī)則卷曲)信息, 對(duì)不同性質(zhì)脂質(zhì)體與粘蛋白的相互作用進(jìn)行研究, 分析建立適用于藥物制劑黏液滲透性評(píng)價(jià)的非在體方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

78HW-1恒溫?cái)?shù)顯磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)廠), LDB-M 微量注射泵(定山儀器廠), JY92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司), Nano ZS90納米粒徑電位分析儀(馬爾文儀器有限公司), LE-1膜擠出器(楚業(yè)生物科技有限公司), ZF-Ⅰ紫外分光光度計(jì)(上海顧村光電儀器廠), NicoletTMiS50傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Fisher 公司), Transwell小室(NEST 公司)。

大豆卵磷脂(湖北健文生物有限公司), 膽固醇(上海伯奧生物科技有限公司), 牛血清白蛋白(北京索萊寶科技有限公司), 粘蛋白(北京謹(jǐn)明生物科技有限公司), 聚乙二醇10000(polyethylene glycol 10000, PEG10000, 上海展云化工有限公司), 殼聚糖(上海藍(lán)季生物), 海藻酸鈉(溫州吉象化學(xué)股份有限公司), 無水乙醇(杭州雙林化工試劑廠)。

1.2 方法

1.2.1 ATR-FTIR光譜法定量測(cè)定方法學(xué)的建立

(1)光譜采集

在ZnSe的液體衰減全反射樣品池中分別加入PEG10000、 殼聚糖、 海藻酸鈉溶液, 使用配備有水平ATR晶體(ZnSe, 45°)的NicoletTMiS50 FTIR掃除背景后, 在波數(shù)4 000～400 cm-1內(nèi)掃描并采集紅外光譜數(shù)據(jù), 掃描次數(shù)為32次, 儀器的分辨率是4 cm-1。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取PEG配制成1%～20%, 殼聚糖配制成0.1%～1.0%, 海藻酸鈉配制成0.1%～1.0%(均為w/v)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)液, 按光譜采集方法測(cè)定其吸光度。

(3)重復(fù)性考察

取同一批溶液6份, 按上述方法測(cè)定含量, 計(jì)算指定峰面積, 得到其RSD值。

(4)精密度考察

吸取同一供試品溶液, 重復(fù)掃描5次, 測(cè)定指定峰面積, 計(jì)算其RSD值。

(5)脂質(zhì)體的制備

包載牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的脂質(zhì)體納米粒采用乙醇注入法[7]制備, 將其以恒定流速分別注入 4%(w/v)PEG10000、 0.4%(w/v)殼聚糖、 0.4%(w/v)海藻酸鈉溶液中, 孵育30 min實(shí)現(xiàn)后修飾。 不同粒徑PEG脂質(zhì)體通過改變膽固醇與大豆卵磷脂質(zhì)量之比、 超聲時(shí)間、 PEG濃度以及水相與有機(jī)相體積之比來制備。

(6)脂質(zhì)體表征

用納米粒度分析儀測(cè)定不同電荷與粒徑脂質(zhì)體的粒徑分布及Zeta電位; 采用超速離心結(jié)合考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定脂質(zhì)體包封率。

(7)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0.01、 0.02、 0.03、 0.04、 0.05、 0.06 mg·mL-1系列BSA溶液, 準(zhǔn)確吸取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)液, 加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液, 在595 nm波長處測(cè)定吸光值, 以蛋白濃度對(duì)吸光度進(jìn)行回歸分析。

1.2.2 不同粒徑與電荷脂質(zhì)體滲透性測(cè)定

(1)ATR-FTIR法

以粘蛋白配制的模擬鼻黏液[8]為背景掃描后, 加入150 μL供試品溶液, 在一定時(shí)間點(diǎn)下對(duì)樣品進(jìn)行掃描, 收集其FTIR譜圖, 計(jì)算不同粒徑PEG脂質(zhì)體和不同電荷脂質(zhì)體的黏液滲透性。 以表觀滲透系數(shù)(Papp, cm·s-1)衡量, 計(jì)算公式如式(1)

(1)

式(1)中, dQ/dt是脂質(zhì)體的擴(kuò)散速率;c0為脂質(zhì)體的初始濃度;A為滲透面積(cm2)。

(2)Transwell法

在12-Transwell板的受體室各添加1.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1, pH 7.4), 將 50 μL模擬鼻黏液均勻鋪在聚碳酸酯膜上, 分別添加測(cè)試樣品到各自供體室后, 35 ℃孵育, 定時(shí)從受體室中取出等分試樣, 并用等體積的緩沖液替換, 對(duì)每個(gè)收集的樣品進(jìn)行測(cè)定, 計(jì)算其表觀滲透系數(shù)[9], 判斷脂質(zhì)體的跨黏液層運(yùn)輸。

(3)不同電荷脂質(zhì)體與粘蛋白溶液相互作用

將粘蛋白溶液添加到ATR-FTIR光譜儀的ZnSe晶體池, 而后將等體積的不同處方脂質(zhì)體添加至粘蛋白溶液中。 孵育30 min后, 記錄ATR-FTIR光譜。 未處理的粘蛋白作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 特征峰選擇

如圖1所示, PEG10000、 殼聚糖和海藻酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的ATR-FTIR光譜圖中, 分別在1 080、 1 048和1 049 cm-1出現(xiàn)一個(gè)明顯的單峰, 并且隨濃度變化最為明顯, 故選擇這三個(gè)單峰作為特征峰。

圖1 (a)不同濃度PEG10000紅外光譜圖; (b)不同濃度殼聚糖紅外光譜圖; (c)不同濃度海藻酸鈉紅外光譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

如圖2所示, 分別以PEG10000、 殼聚糖、 海藻酸鈉濃度為橫坐標(biāo)(X), 所對(duì)應(yīng)的紅外特征峰吸收峰面積為縱坐標(biāo)(Y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 得到回歸方程分別為:Y=2.386 6X+2.154,R2=0.991 6;Y=1.130 14X+0.060 9,R2=0.997 4;Y=1.870 3X+0.278 9,R2=0.992 7。 表明PEG10000、 殼聚糖、 海藻酸鈉分別在2%～20%(w/v), 0.1%～1.0%(w/v), 0.1%～1.0%(w/v)的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2.2 重復(fù)性考察

PEG脂質(zhì)體、 殼聚糖脂質(zhì)體、 海藻酸鈉脂質(zhì)體的供試品溶液的峰面積RSD值分別為0.83%、 0.97%、 0.88%, 表明該方法的重復(fù)性較好。

2.2.3 精密度考察

結(jié)果表明, 6次測(cè)定的PEG脂質(zhì)體、 殼聚糖脂質(zhì)體、 海藻酸鈉脂質(zhì)體的特征峰峰面積RSD 值分別為0.62%、 0.73%、 0.95%, 表明該方法的精密性很好。

2.3 脂質(zhì)體的表征

2.3.1 不同粒徑與電荷脂質(zhì)體的表征

不同粒徑脂質(zhì)體的表征結(jié)果見表1。

表1 不同粒徑 PEG 脂質(zhì)體的表征(n=3)

不同電荷脂質(zhì)體表征結(jié)果見表2。

表2 不同電荷脂質(zhì)體的表征(n=3)

由表1和表2可知, 不同電荷與粒徑脂質(zhì)體大多粒徑分布較為均勻[多分散系數(shù)(polydiseperse Index, PDI)<0.3], 電荷的變化、 脂質(zhì)體滲透的FTIR譜圖(見下文)與不同脂質(zhì)體特征峰的對(duì)應(yīng)說明了不同脂質(zhì)體表面的成功修飾[10-11]。

2.4 包封率

2.4.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以BSA濃度c為橫坐標(biāo), 吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到標(biāo)準(zhǔn)線方程:Y=6.177 1X-0.002 2,R2=0.997 6, 結(jié)果表明, BSA在0.01～0.06 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 脂質(zhì)體包封率

不同粒徑和電荷脂質(zhì)體包封率見圖3。

圖3 (a) 不同粒徑PEG脂質(zhì)體的包封率; (b) 不同電荷脂質(zhì)體的包封率

由圖3(a)知, 不同粒徑脂質(zhì)體中69 nm的PEG脂質(zhì)體包封率最低, 是由于較小的粒徑顯著限制了其藥物有效載荷承載能力; 由圖3(b)知?dú)ぞ厶侵|(zhì)體包封率高于PEG脂質(zhì)體和海藻酸鈉脂質(zhì)體, 可能的原因是由于脂質(zhì)體表面電荷的影響, 殼聚糖和BSA之間的靜電吸引力, 使得藥物滲漏減小, 而海藻酸鈉與BSA所帶電荷相反, 由于靜電排斥, 使得藥物從脂質(zhì)體中滲漏, 故其包封率低于殼聚糖和PEG 脂質(zhì)體[11-12]。

2.5 不同粒徑與電荷脂質(zhì)體黏液滲透性測(cè)定

2.5.1 ATR-FTIR法

2.5.1.1 不同粒徑PEG脂質(zhì)體黏液滲透性測(cè)定

如圖4所示為不同粒徑脂質(zhì)體添加到黏液層后, 獲得的不同時(shí)間點(diǎn)下PEG脂質(zhì)體的ATR-FTIR光譜。

圖4 不同粒徑PEG脂質(zhì)體在黏液中不同時(shí)間點(diǎn)的ATR-FTIR圖譜

如圖4所示, 當(dāng)與黏液接觸時(shí), 隨著脂質(zhì)體滲透并到達(dá)ZnSe界面, FTIR 光譜出現(xiàn)強(qiáng)度逐漸增加的樣品吸收帶。 可以初步看出, 隨著粒徑的增大, PEG 脂質(zhì)體的ATR-FTIR在1 080 cm-1處吸收強(qiáng)度逐漸減小, 說明PEG脂質(zhì)體滲透至ATR的ZnSe表面的量逐漸減少, 可能是由于黏液的孔徑對(duì)大粒徑脂質(zhì)體的排阻作用。 不同粒徑PEG脂質(zhì)體的滲透系數(shù)見圖8(a)。

2.5.1.2 不同電荷脂質(zhì)體黏液滲透性測(cè)定

由圖5可知, 不同電荷脂質(zhì)體中, 近中性電荷脂質(zhì)體黏液滲透性最高, 正電荷脂質(zhì)體黏液滲透性最低。 由于PEG脂質(zhì)體為電中性, 其與黏液的相互作用最小, 而海藻酸鈉脂質(zhì)體與殼聚糖脂質(zhì)體會(huì)由于其所帶的—COOH基團(tuán)(前者)及與粘蛋白中帶負(fù)電荷的唾液酸殘基發(fā)生靜電相互作用(后者)[13], 因而二者黏液滲透性低于PEG化脂質(zhì)體。 不同電荷脂質(zhì)體的滲透系數(shù)見圖8(b)。

圖5 不同電荷脂質(zhì)體在黏液中不同時(shí)間點(diǎn)的ATR-FTIR圖譜

2.5.1.3 不同電荷脂質(zhì)體與粘蛋白相互作用測(cè)定

圖6 (a) 不同電荷脂質(zhì)體處理的粘蛋白的ATR-FTIR的Y偏移堆積線圖; (b) 不同電荷脂質(zhì)體處理后的粘蛋白的酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶面積之比

ATR-FTIR已被證明對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)尤其敏感, 是獲取有關(guān)蛋白質(zhì)構(gòu)象信息的強(qiáng)大技術(shù)之一。 酰胺Ⅰ帶對(duì)于研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最有價(jià)值, 該振動(dòng)頻率受α-螺旋、 β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的影響[19]。 利用Origin 2022b對(duì)粘蛋白與不同脂質(zhì)體作用前后的酰胺Ⅰ帶進(jìn)行二階求導(dǎo)和Gaussian去卷積化處理, 其結(jié)果如圖7所示, 根據(jù)積分面積計(jì)算粘蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分的相對(duì)百分含量, 見表3。

表3 不同電荷脂質(zhì)體處理粘蛋白后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量

圖7 不同電荷脂質(zhì)體處理后的粘蛋白的酰胺Ⅰ帶的高斯曲線擬合譜圖

2.5.2 ATR與Transwell方法比較

如圖8所示, ATR-FTIR和Transwell均可對(duì)不同粒徑與電荷脂質(zhì)體的黏液滲透性進(jìn)行測(cè)定, 不同的是, 后者所得出的信息較為局限, 而前者可實(shí)時(shí)進(jìn)行測(cè)定, 操作簡便, 并且能夠檢測(cè)出脂質(zhì)體與粘蛋白之間相互作用的微小變化, 進(jìn)而對(duì)納米粒滲透黏液的機(jī)制進(jìn)行闡述。

圖8 (a) 一系列不同粒徑PEG脂質(zhì)體分別用ATR-FTIR和Transwell法測(cè)得的Papp比較;(b) 不同電荷脂質(zhì)體分別用ATR-FTIR和Transwell法測(cè)得的Papp比較

2.6 討論

脂質(zhì)納米粒在藥物和疫苗的體內(nèi)遞送中具有重要應(yīng)用價(jià)值。 經(jīng)表面修飾的脂質(zhì)體在藥物體內(nèi)遞送中具有延長半衰期、 增加靶向性、 提高藥效等作用, 因而受到廣泛重視[22]。 建立了一種針對(duì)不同性質(zhì)脂質(zhì)體的鼻黏液滲透性的體外評(píng)價(jià)方法, 即利用ATR-FTIR 在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)生物基質(zhì)(即粘蛋白)進(jìn)行掃描, 得到基質(zhì)內(nèi)藥物制劑的一系列譜圖, 根據(jù)藥物制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、 譜圖中藥物特征紅外吸收峰的強(qiáng)弱判斷藥物制劑在粘蛋白中的滲透性。 為進(jìn)一步評(píng)估該方法的有效性, 將ATR-FTIR光譜分析與基于Transwell 室的檢測(cè)分析對(duì)同一納米藥物的跨黏液轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行對(duì)比, 證明了ATR-FTIR在體外評(píng)價(jià)藥物在黏液中滲透性的可行性。 同時(shí), 利用ATR-FTIR初步探索了藥物滲透黏液的原理: 通過粘蛋白的微小結(jié)構(gòu)變化, 即其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化, 檢測(cè)并分析藥物制劑與生物基質(zhì)所發(fā)生的相互作用, 闡明了不同性質(zhì)脂質(zhì)體黏液滲透性強(qiáng)弱的機(jī)制。

鼻黏液的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能阻礙了顆粒和分子在粘膜中的運(yùn)輸, 是藥物通過鼻黏膜上皮進(jìn)行治療遞送的關(guān)鍵瓶頸。 目前, 用于體外評(píng)價(jià)鼻黏膜制劑的黏液滲透性有多種方法。 分別為Transwell法[9]、 細(xì)胞模型法[22]、 多粒子示蹤技術(shù)(multiple particle tracking, MPT)[23]等, Transwell法優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便, 普適性強(qiáng), 但是獲得的信息較為單一, 對(duì)進(jìn)一步的研究具有局限性; 細(xì)胞模型法可用于評(píng)價(jià)不同藥物的黏液滲透性, 但操作繁瑣、 細(xì)胞培養(yǎng)周期長, 目前體外細(xì)胞模型有: Caco-2、 EpiAirway、 犬腎細(xì)胞(madin-darby canine kidney cells, MDCK)、 人類原代鼻上皮細(xì)胞等。 但是并非所有細(xì)胞模型都適用于經(jīng)鼻給藥的滲透性研究, 如MDCK細(xì)胞模型與Caco-2、 EpiAirway相比, 其跨膜電阻(trans epithelial electric resistance, TEER)較高, 細(xì)胞連接致密, 這將限制藥物經(jīng)細(xì)胞旁路途徑的吸收, 該模型較適合用于血腦-屏障的研究, 并且, Caco-2腸細(xì)胞系是唯一獲得FDA批準(zhǔn)的評(píng)估藥物吸收的體外預(yù)測(cè)模型, 但是Caco-2細(xì)胞起源于結(jié)腸, 不存在粘液層, 并且腸道與鼻屏障在形態(tài)和生理等方面均有較大的差異性, 故對(duì)于評(píng)價(jià)鼻黏膜制劑的黏液滲透性而言, 選擇合適的細(xì)胞極其重要; MPT法可以動(dòng)態(tài)檢測(cè)顆粒在生物基質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)與相互作用, 但需要對(duì)藥物進(jìn)行染色或者標(biāo)記, 在一定程度上可能改變了藥物結(jié)構(gòu), 對(duì)其造成影響, 并且亦無法對(duì)藥物的滲透機(jī)制進(jìn)行具體的說明。 本工作利用藥物制劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與ATR-FTIR相結(jié)合, 既可定量檢測(cè)藥物在黏液中的滲透, 又可對(duì)藥物滲透的機(jī)制進(jìn)行分析和解釋, 可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的方向選擇和方案調(diào)整提供指導(dǎo)。

3 結(jié) 論

建立的基于ATR-FTIR的體外評(píng)價(jià)鼻黏膜制劑的黏液滲透性方法, 與其他方法相比, 不需要對(duì)藥物進(jìn)行標(biāo)記, 因此不會(huì)對(duì)藥物制劑結(jié)構(gòu)造成影響, 簡單可靠, 可實(shí)時(shí)進(jìn)行檢測(cè), 并藉此可獲得更豐富的分子間相互作用信息。 除脂質(zhì)體等脂質(zhì)納米粒外, 本方法也可用于其他鼻黏膜制劑的黏液滲透性評(píng)價(jià), 如微球、 納米乳、 納米凝膠等多種制劑(另文發(fā)表); 經(jīng)適應(yīng)性改進(jìn)后, 還可用于藥物制劑在其他黏液例如口腔黏液、 下消化道黏液和生殖腔道黏液中的滲透性評(píng)價(jià), 應(yīng)用前景廣闊。