基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的光學信號傳感檢測策略綜述

劉思彤, 黃朝鶴, 羅美玉, 王 楨, 陳虹錚, 張鈺婕, 裴曉靜

北京工商大學輕工科學與工程學院, 北京 100048

引 言

簇狀規(guī)則間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和CRISPR-associated (Cas)系統(tǒng)是在大多數(shù)細菌和古菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)[1-3]。 按照Cas蛋白組成, CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為兩類: Class 1和Class 2, 根據(jù)Cas蛋白的結構和序列又可分為不同亞型, Class 1是由多亞基組成的多蛋白效應復合物, 包括Ⅰ、 Ⅲ和Ⅳ型。 Class 2是單個效應蛋白, 包括了Ⅱ型中的Cas9、 Ⅴ型的Cas12a和Ⅵ型的Cas13a等(圖1)。 其中, Cas9具有核酸內切酶活性, 兩個酶切活性結構域HNH和RuvC, 在兩種RNA的引導下, 對含有原間隔序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)的目標雙鏈DNA(dsDNA)進行特異性識別并切割[4]。 Jennifer Doudna等將兩種RNA整合為單向導sgRNA, 使其便于使用[5-6]。 與Cas9不同, Ⅴ型的Cas12a具有類似RuvC核酸酶結構域, 特異性別目標雙鏈DNA(dsDNA)后會激活反式切割活性(Trans-cleavage activity), 繼續(xù)非特異切割其他單鏈DNA(ssDNA)或RNA[7]。 Ⅵ型的Cas13(Cas13a、 Cas13b 和Cas13c)包含HEPN結構域, 具有核糖核酸酶活性, 特異性識別靶標RNA后會非特異性切割周圍的RNA。 近年來, CRISPR-Cas系統(tǒng)被廣泛應用于各個領域中, Cas9對核酸的特異性識別作用使其成為理想的核酸檢測工具, 結合核酸擴增法和特定的信號傳感方式, 如熒光法, 可以實現(xiàn)高靈敏檢測。 Cas12、 13和14的反式切割活性為核酸分子診斷提供了更多的可能性, 當這類Cas蛋白在gRNA的引導下與靶序列結合后, 形成三元復合物激發(fā)非特異性切割活性, 可以降解體系中存在的任何單鏈DNA或RNA, 當帶有熒光團和猝滅基團的短鏈DNA或RNA加入體系時, Cas蛋白對靶序列進行識別并切割報告探針, 使熒光團遠離猝滅基團而使熒光恢復[8-12]。 CRISPR-Cas系統(tǒng)已與一系列信號讀出方式結合設計了多種生物傳感器, 用于不同靶標的分析檢測, 廣泛應用于生命科學各個領域。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)

基于CRISPR-Cas的生物傳感器能夠以多種形式進行信號輸出, 其中光學信號傳感扮演了重要的角色。 光學信號傳感根據(jù)物質吸收或發(fā)射的電磁波而建立起來的一類分析化學方法, 目前研究報道的CRISPR-Cas系統(tǒng)的光學信號傳感包括熒光、 比色、 化學發(fā)光法等。 結合本研究進展, 主要闡述當前CRISPR-Cas系統(tǒng)生物傳感器的光學信號傳感方式的原理及特點, 總結了不同類型光學檢測策略的探針分析性能, 如表1, 助力CRSPR-Cas系統(tǒng)在生物安全檢測以及生物學研究等領域發(fā)揮更大的優(yōu)勢和作用。

表1 不同類型光學檢測策略探針分析性能比較

1 熒光信號傳感策略

熒光分析方法是根據(jù)熒光團的光致發(fā)光特性所建立的傳感方法, 具有靈敏度高、 操作簡單、 分析速度快、 選擇性好等優(yōu)勢, 能夠提供激發(fā)光譜、 發(fā)射光譜、 發(fā)光壽命、 量子產率和各向異性等諸多信息。 熒光信號讀出方式已廣泛應用于CRISPR-Cas系統(tǒng)中, 包含了熒光強度信號和熒光數(shù)字信號。 熒光強度表示一段時間內大量熒光分子的平均行為, 是一種模擬信號的系綜平均檢測模式, 待測物質越多, 熒光強度信號越強。 但是, 這種模擬信號的檢測模式使單個生物分子的行為平均化, 無法對單個信號源或分子進行系統(tǒng)研究。 熒光數(shù)字信號通過統(tǒng)計信號源的數(shù)量與目標物的濃度或質量之間建立聯(lián)系, 基于信號有無開關統(tǒng)計信號數(shù)量, 即檢測體積內含有超過泊松噪音極限數(shù)量的分子, 進而將分析物的濃度以數(shù)量的形式表達出來。

熒光團標記的ssDNA與可猝滅熒光的物質組合形成熒光信號開關來設計熒光強度信號探針。 Sun等使用MOF結構(UiO66)開發(fā)了一種SDA-RCA擴增方法, 用于大腸桿菌的熒光檢測[20]。 熒光染料可與dsDNA特異性結合, 如溴化乙錠和SYBR Green I等, 結合到dsDNA骨架上, 與游離在溶液中相比, 其熒光強度明顯增強。 Huang等利用SYBR Green I進行非共價DNA結合, 建立了CRISPR-Cas9誘導指數(shù)擴增方法(CAS-EXPAR), 結合實時熒光強度分析, CAS-EXPAR可在1 h內實現(xiàn)靈敏的DNA檢測[21]。

熒光共振能量轉移(F?rster resonance energy transfer, fluorescence resonance energy transfer, FRET)是指當一個熒光分子(供體)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊時, 供體發(fā)射的熒光能激發(fā)受體發(fā)出熒光, 同時供體的熒光強度減弱。 FRET與供、 受體分子的空間距離緊密相關, 一般為7～10 nm時即可發(fā)生FRET, 隨著距離延長, FRET呈明顯減弱[22-23]。 基于Cas12a、 Cas13和Cas14系統(tǒng)反式切割活性的熒光報告探針多采用FRET原理而設計, 即在探針的兩端分別修飾熒光團和猝滅基團[24], 靶標激活Cas蛋白反式切割活性后, 對熒光報告探針進行非特異性切割, 熒光恢復, 熒光強度與靶標濃度呈正比[25]。

單鏈熒光報告探針, 即ssDNA或ssRNA熒光報告探針, 具有構造簡單, 易于設計和可控性高等優(yōu)點。 Wang等利用Cas12a的反式切割活性, 以熒光ssDNA報告(HEX-N12-BHQ1)為探針, 開發(fā)了一小時低成本多用途高效檢測系統(tǒng)HOLMES(an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system)可用于目標DNA和RNA的快速檢測[26]。 在HOLMES中, Cas12a和crRNA組成的二元復合物會與靶標DNA結合, 激活反式切割活性, 非特異性切割系統(tǒng)中ssDNA熒光報告探針, 使熒光基團與猝滅基團距離變遠, 進而熒光恢復。 通過測定熒光強度, 可最低檢測0.1 nmol·L-1靶標; 結合PCR, 檢測限可降低至10 amol·L-1。

單鏈熒光報告探針與CRISPR的結合應用已非常廣泛, 但是基于雙鏈熒光報告探針卻鮮有報道。 Mehmet V Yigit等證明了激活的CRISPR-Cas12a不但可以對ssDNA進行非特異性切割, 也可以對雙鏈進行非特異性切割[27], 依此設計了基于Cas12a反式切割活性的雙鏈熒光報告探針(如圖2)。 通過改變發(fā)光基團和猝滅基團之間距離, 通過測定熒光強度信號比較Cas12a對于不同的dsDNA探針的反式切割情況, 證明了無論是否帶有經典ssDNA片段(TTATT)缺口, Cas12a均可非特異性切割dsDNA, 且不帶有缺口的dsDNA探針具有較低的背景和更快的熒光恢復率優(yōu)點[如圖2(b, c)]。

圖2 CRISPR-Cas12a切割雙鏈熒光報告分子示意圖[27]

圖3 (a) 不同熒光探針的背景熒光值; (b) 目標物濃度在10 nmol·L-1時的熒光恢復率; (c) 熒光切割速率; (d) Cas12a檢測不同熒光探針終點熒光比率的熱圖比較, 目標物分別為1 nmol·L-1, 100 pmol·L-1和0, t=4 000 s

富含鳥嘌呤(Guanine)的DNA序列能夠通過Hoogsteen氫鍵折疊成G四鏈體結構(G-quadruplexes)。 在G四鏈體結構兩端修飾熒光團和猝滅基團, 可用作CRISPR反式切割的熒光探針[28]。 Li等分別在人端粒G四鏈體((TTAGGG)4)的5’端和3’端標記FAM和TAMRA, 證明了Cas12a能夠非特異性切割G四結構, 通過FRET, CD、 凝膠電泳和NMR等技術進行驗證, 為推進CRISPR-Cas12a系統(tǒng)和G四鏈體熒光報告探針在生物傳感和生物化學中的應用提供了新途徑。 由于G四鏈體結構穩(wěn)定性高, 需要較長時間(長達幾個小時)才能裂解。 G三鏈體(G-triplex)由富含三段連續(xù)G堿基的富G核酸序列組裝而成, 與G四鏈體具有相似的生物學功能。 進一步研究了Cas12a對G三鏈體探針的反式切割活性, 證明了Cas12a在10 min內就可以對G3結構進行反式切割, 且其切割速率遠遠高于G4結構[15]。 基于此設計Cas12a 和G三鏈體熒光生物傳感器, 對未擴增和擴增的HPV16的檢測靈敏度分別為50 pmol·L-1和0.1 amol·L-1, 比基于ssDNA熒光報告探針的Cas12a檢測系統(tǒng)提高了20倍。

分子信標(molecular beacon, MB)是一種熒光標記的寡核苷酸鏈, 特殊的發(fā)夾結構使其具有背景信號低、 靈敏度高和特異性強的優(yōu)勢, 已廣泛應用于分子生物學中, 但較少用于CRISPR系統(tǒng)的熒光分析檢測中。 以Cas12a為例, 設計了不同類型的分子信標, 將MB與ssDNA、 dsDNA熒光報告探針進行了對比, 證明了Cas12a的反式切割不僅限于ssDNA、 dsDNA, 還可以擴展到MB[16]。 在相同的實驗條件下, 四種不同長度的ssDNA熒光報告探針(長度分別為5、 8、 12和15 nt)最低可以檢測到100 pmol·L-1的靶標; 四種dsDNA熒光報告探針, 最低可以檢測到100 pmol·L-1, 而MB熒光報告探針, 靈敏度可以提高至 20 pmol·L-1。 在優(yōu)化了反應條件(包含F(xiàn)RET對、 反應溫度、 報告探針濃度以及Cas12a 與crRNA濃度的比例)之后, 發(fā)現(xiàn)標記Texas Red和BHQ2的MB熒光報告探針在無擴增的情況下, 最低可以檢測到100 fmol·L-1靶標, 比ssDNA和dsDNA熒光報告探針靈敏度提高了3個數(shù)量級, 依此開發(fā)了一種高靈敏度的SARS-CoV-2檢測方法, 選取SARS-CoV-2基因組圖譜中13 328～13 437的ORF1a基因作為模型靶點, 以冠狀病毒GX/P2V代替SARS-CoV-2進行實際樣品檢測, 檢測限低至27 copies·mL-1, 在臨床分子診斷中具有巨大應用前景。

上述熒光強度信號是一種模擬信號的系綜平均的檢測模式, 熒光數(shù)字信號是將反應體系等量的分裝成上萬個微反應單元, 每一份可能是pL至fL數(shù)量級的體積, 每個微反應單元中包含的分子數(shù)服從泊松分布, 每個微反應單元內的目標分子進行單獨的擴增反應產生熒光亮點信號, 在顯微鏡下對熒光亮點的數(shù)量進行統(tǒng)計, 實現(xiàn)定量檢測。 目前CRISPR-Cas分子診斷仍然需要單獨的預擴增步驟, 由此產生的多步驟擴增和分析方法使其難以進行熒光數(shù)字檢測。

Park等報道了熒光數(shù)字化信號讀出的CRISPR/Cas一鍋法(digitization-enhanced CRISPR/Cas-assisted one-pot virus detection, deCOViD), 并用于SARS-CoV-2檢測中[30]。 利用商用微流控數(shù)字芯片, 將RT-RPA預擴增的Cas12a反應分散到0.7 nL反應小孔中, 將靶標RNA通過RT-RPA擴增成DNA, 激活Cas12a-crRNA的反式切割活性, 繼續(xù)切割ssDNA熒光報告探針產生熒光, 在反應小孔內每個拷貝的靶標快速擴增產生信號, deCOViD具有高信號背景比、 寬動態(tài)范圍和高靈敏度, 可以實現(xiàn)15 min內定性檢測, 30 min內定量檢測, 為推進 CRISPR/Cas 輔助核酸檢測和對抗COVID-19大流行及其他疾病開辟了新途徑。 Liu提出了一種數(shù)字化熱啟動CRISPR(dWS CRISPR)分析方法, 用于靈敏定量檢測SARS-CoV-2[31]。 他們利用商用QuantStudio 3D數(shù)字芯片, 將dWS-CRISPR反應混合物分散到0.7 nL的反應小孔中, SARS-CoV-2 RNA靶標在每個反應微孔發(fā)生dWS-CRISPR反應, 在52 ℃孵育時產生強烈的綠色熒光(陽性點), 而沒有靶標的反應微孔不產生(陰性點)。 dWS CRISPR在50～55 ℃時有效啟動, 從而防止在室溫下過早的靶點擴增, 并實現(xiàn)核酸的精確數(shù)字量化, dWS-CRISPR與之前相比, 可以無需提取RNA直接檢測熱處理后唾液樣本中的SARS-CoV-2。

基于芯片的數(shù)字化檢測模式可以實現(xiàn)高靈敏多重檢測, 在傳染性病原體常規(guī)監(jiān)測和綜合診斷具有重要應用價值, Ackerman等利用數(shù)字化Cas13發(fā)展了一種大規(guī)模多重核酸檢測方法(CARMEN)[32], 打破了上述兩種數(shù)字化CRISPR只能進行單一目標物診斷的弊端。 該微孔陣列芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成, 具有大量微孔, 每個核酸樣本通過RPA或PCR擴增, 并與特定熒光編碼結合實現(xiàn)信號讀出, 能夠在單個陣列上對超過4 500個靶標進行穩(wěn)定測試, 同時區(qū)分169種人類相關病毒, 可用于病原體高通量檢測。

相比其他光學檢測方法, 熒光信號傳感方式具有其獨特的優(yōu)點, 也在向著更便攜, 更簡單的方向發(fā)展。 但與此同時, 它仍然需要專業(yè)的光學儀器的協(xié)助和專業(yè)人員的操作才可以完成檢測。

2 比色信號傳感策略

比色法通過貴金屬納米顆粒聚集前后吸收光譜的變化來實現(xiàn)對目標物的測定, 它最大的優(yōu)勢在于可以實現(xiàn)裸眼檢測, 對儀器設備要求低, 適用于非專業(yè)條件下的快速定性與半定量檢測。

Yuan等利用Cas12a/crRNA對dsDNA特異性識別和Cas13a/crRNA對RNA的特異性識別, 分別激活其反式切割ssDNA和ssRNA的性質, 產生DNA功能化的 AuNPs聚集, 溶液顏色改變實現(xiàn)裸眼檢測[17]。 同年, Raffaele Velotta采用SARS-CoV-2誘導AuNPs相互作用的比色生物傳感器用于檢測鼻咽拭子中病毒顆粒[33]。 當含有病毒粒子的溶液混合時, 攜帶SARS-CoV-2的三種表面蛋白的抗體功能化的金納米粒子的消光譜在幾分鐘內發(fā)生紅移, 檢測限接近實時熒光PCR。

相對于上述需要進行擴增的比色信號傳感器, Choi課題組在2021年開發(fā)了基于CRISPR-Cas12a的無核酸擴增的熒光和比色雙模式生物傳感器, 他們利用DNA功能化金納米顆粒通過金屬增強熒光(MEF)原理檢測游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)。 當cfDNA激活CRISPR-Cas12a復合體后, 非特異性切割AuNPs和熒光團之間的ssDNA, 金納米顆粒發(fā)生顏色從紫色到紅紫色的變化[34]。 在該研究中, 作者引入了兩個大小不同的AuNPs(20和60 nm), 并且由一個7 nm長的dsDNA和一個9 nm長的ssDNA連接, 異硫氰酸熒光素(FITC)標記在dsDNA一端, 由于距離接近60 nm 的AuNPs而保持猝滅狀態(tài)。 有靶標存在時, 激活了Cas12a的反式切割活性, 將兩金納米之間的連接鏈切斷, FITC遠離60 nm的AuNPs依然與20 nm的AuNPs保持連接, 由熒光恢復狀態(tài)轉變?yōu)闊晒庠鰪姞顟B(tài), 溶液顏色由紫色轉變?yōu)樽霞t色, 通過裸眼定性檢測, 通過熒光信號實現(xiàn)定量檢測, 無需進行核酸擴增, 檢測限可以達到飛摩爾濃度級別。

不同縱橫比的金納米棒(GNR)具有獨特的橫向表面等離子體共振(TSPR)和縱向表面等離子體共振(LSPR)模式, 表現(xiàn)出不同的顏色。 這些特性使得GNR在顯色反應中具有良好的顯色性能。 Xu課題組利用轉化酶-葡萄糖氧化酶級聯(lián)反應引起GNR變色和Fenton反應讀出信號[35]。 靶標DNA在 crRNA引導下激活 Cas12a系統(tǒng)的反式切割活性, 切斷了功能磁珠和轉化酶之間的ssDNA, 磁分離后上清液中釋放的轉化酶進行級聯(lián)反應催化蔗糖水解, 生成的葡萄糖立即被GOx氧化生成H2O2。 在酸性環(huán)境下, H2O2通過Fe2+誘導的Fenton反應迅速轉化為活性中間體(·OH)。 ·OH主要沿縱軸方向刻蝕GNR, 所產生的長徑比明顯變化, 從而改變溶液顏色。 因此最終的顏色可以有效地與目標DNA的濃度相關聯(lián), 并且可以通過裸眼輕易地區(qū)分出來。 更重要的是, LSPR位移的峰值波長可用于紫外-可見分光光度法對目標DNA的半定量檢測, 在重組酶輔助擴增(recombinase-aided amplification)后, 對目標DNA靈敏度達1 amol·L-1, 與熒光報告探針的靈敏度相當。

比色檢測可將目標物識別事件轉變?yōu)轭伾兓? 具有操作簡單、 肉眼可見和不需要昂貴或復雜的儀器等優(yōu)勢, 并逐步向一體化、 高靈敏方向發(fā)展。

3 側流層析檢測策略

側流層析法(lateral flow dipstick, LFD)是檢測病原體、 小分子、 癌癥和基因分型最常用的方法之一, 研究者將CRISPR-Cas系統(tǒng)與側流層析試紙結合, 已發(fā)展出多種簡單便攜的生物傳感器[36-40], 因其技術成熟, 操作簡便, 適用于居家核酸或者抗原檢測產品開發(fā), 具有極其廣泛的應用前景。

側流層析試紙條一般由樣品墊、 結合墊、 硝酸纖維素膜和吸附墊組成, 由于試紙條的毛細作用, 將待測樣品滴到樣品墊后, 樣品將隨液體在試紙條上向前移動。 在結合墊處靶標樣本和顯色物質, 如納米金標記的抗體結合形成復合物繼續(xù)向前移動。 當復合物移動至抗體標記的檢測線處, 抗原和抗體特異性結合, 檢測線顯色, 表明待測靶標存在; 繼續(xù)向前移動, 顯色物質標記的抗體和對照線處的抗體特異性結合, 對照線顯色, 表明側流試層析紙條正常工作。 若檢測線顯色而對照線不顯色或檢測線對照線均不顯色, 則檢測結果無效。 若檢測線和對照線均顯色, 則檢測結果為陽性; 如檢測線不顯色, 對照線顯色, 則檢測結果為陰性。

AuNPs-LF(gold nanoparticles-based lateral-Flow, AuNP-LF)檢測是一種快速發(fā)展的技術, 它利用AuNPs作為免疫反應的信號報告探針。 與其他報告標簽探針相比, AuNPs具有良好的生物相容性和較小的生物毒性, 在體外和體內診斷方面具有極大的優(yōu)勢。 迄今為止, AuNP-LF檢測已被廣泛用于檢測各種目標物, 包括感染性病毒、 蛋白質、 藥物和其他病原體[41]。 Benjamin等發(fā)展了一種half-strip形式的側流層析試紙條, 即不使用樣品墊和結合墊, 將樣本和納米金納米顆粒標記的抗體混合, 而后插入硝酸纖維素膜和吸附墊組裝而成的試紙條直接檢測[42]。 該方法檢測SARS-CoV-2 N蛋白的檢測限為0.65 ng·mL-1。 Xie等利用核殼結構磁性量子點標簽構建了一種雙模式熒光側流層析檢測方法, 可以同時檢測SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白[43]。 磁性量子點標簽不僅可以高靈敏顯色, 而且可以富集病毒顆粒, 該方法全程檢測時間為10 min, 靶向SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白的檢測限分別為1和0.5 pg·mL-1檢測限有了很大的提高。 Garrit等在側流層析試紙條檢測的基礎上, 采用同步輻射X射線熒光成像(synchrotron X-ray fluorescence imaging)技術讀取檢測結果, 檢測限較普通的肉眼讀取方式提高100倍[44]。

與上述不同的是, 納米硒納米粒子(SeNPs)作為LFIAs(lateral flow immunochromatographic assay)的定性探針, 具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性, 與膠體金相比, 硒納米粒價格更低廉。 Ma課題組提出了一種基于納米硒顆粒修飾的SARS-CoV-2核蛋白的側流層析免疫檢測試劑盒, 該試劑盒可以檢測人血清中抗SARS-CoV-2 IgM和抗SARS-CoV-2 IgG, 結果可在10 min內裸眼讀取[45]。 多種信號讀出方式的聯(lián)合使用可以將檢測效率大大提高。

基于側流層析試紙條檢測方法在檢測速度和檢測成本方面具有很大的優(yōu)勢, 其操作簡單, 快捷高效, 安全可靠。 2018年, 張鋒團隊開發(fā)了基于Cas13的分子診斷技術(specific high-sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing, SHERLOCK)[46], 利用Cas13a對RNA特異性識別后反式切割熒光團和猝滅基團修飾ssRNA探針, 利用熒光強度信號實現(xiàn)對多種病毒RNA的定性檢測。 該團隊通過加入Csm6開發(fā)了SHERLOCK v2[19], 將檢測靈敏度提高了3.5倍, 通過不同顏色的熒光報告探針, 實現(xiàn)多重靶標檢測。 通過商業(yè)化的試紙條, 裸眼直接觀察顏色來判讀結果, 且不需要特殊儀器。 ssDNA兩端修飾FAM和生物素, 無靶標時, ssDNA沒有被切斷, ssDNA的FAM端與抗FAM抗體修飾的金納米結合后流向C線, ssDNA的biotin端與C線的鏈霉親和素結合, 無法到達Test線, 無信號。 當有靶標存在時, CRISPR/CrRNA的激活反式切割活性被激活, 非特異性切割ssDNA, 切斷后的ssDNA的FAM端與抗FAM抗體修飾的金納米結合后流過C線后, 無法被固定, 繼續(xù)流向T 線, 顯示信號。 部分ssDNA未被切斷, ssDNA的FAM端與抗FAM抗體修飾的金納米結合后流向C線, ssDNA的biotin端與C 線的鏈霉親和素結合, 作為對照。 2020年初, 該團隊將CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術用于新型冠狀病毒檢測, 以側流層析試紙條信號讀出, 開發(fā)了SHERLOCKTM CRISPR SARS-CoV-2 檢測試劑盒, 在1h內完成檢測, 適合居家新冠病毒核酸大規(guī)模初篩檢測。

側流層析試紙條信號傳感方式綜合了色譜優(yōu)異的分離能力和傳統(tǒng)免疫分析的高特異性和高靈敏性的優(yōu)點, 已成為現(xiàn)場即時檢測的一種重要工具。 采用目視法讀取定性或半定量結果, 檢測靈敏度和準確度顯然不能滿足當下對分析物高靈敏定量檢測的要求。

現(xiàn)今血糖儀和智能手機幾乎是每個家庭必備的設備, 運用血糖儀或者智能手機進行檢測或者信號的讀出無疑是一種非常方便的選擇。 Ning等報道了一種RT-RPA CRISPR 的熒光檢測系統(tǒng), 可以精確地量化唾液中存在的SARS-CoV-2, 而無需分離RNA, 并將該檢測方法應用于智能手機讀取芯片, 用于即時使用, 并評估了其分析性能, 智能手機讀取的CRISPR-FDS分析結果與RT-qPCR結果之間的一致, 適用于超靈敏的現(xiàn)場COVID-19篩查工作[47]。 Pimkhuan Hannanta-anan課題組介紹了一種基于智能手機設備以及機器學習軟件[48]。 該設備由一個3D打印外殼和低成本的光學組件組成, 可以激發(fā)熒光報告探針, 并選擇性地將熒光信號傳輸?shù)街悄苁謾C上實現(xiàn)信號讀出。 凝膠電泳分析也可以用于CRISPR-Cas的終點信號讀出, Mehmet V Yigit等利用雜交鏈式反應(hybridization chain reaction, HCR)與Cas12a結合, 以煙草卷梢病毒(TCSV)和乙型肝炎病毒(HepBV)為模型靶標, Cas12a識別靶標后激活反式切割活性, 切割了體系中的引物鏈, 使得HCR無法進行, 從凝膠電泳上無法看到HCR擴增產物, 利用凝膠電泳終點讀出, 凝膠顯示引物的條帶強度隨著目標量的增加而降低, 靈敏度達1.5 fmol, 比單純的HCR靈敏度提高了100倍[49]。

4 總結與展望

CRISPR-Cas系統(tǒng)研究正在逐步改變著傳統(tǒng)的基因編輯和分子診斷模式, CRISPR-Cas技術具有簡單、 特異、 靈敏的特點, 可與多種技術相結合。 基于本課題組的研究進展, 總結了CRISPR-Cas系統(tǒng)構建的光學傳感器的信號傳感方式原理及特點, 并介紹了當前各課題組的研究進展。 隨著科技的發(fā)展, 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)信號讀出正向智能化、 便攜式方向發(fā)展。 目前絕大多數(shù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的分析檢測依賴預擴增過程, 如何利用信號讀出的方式擺脫預擴增步驟, 簡化操作是未來的發(fā)展方向之一。 高靈敏高通量的檢測在新冠病毒等病原體感染性疾病的大規(guī)模初篩具有重要意義, 如何利用CRISPR-Cas系統(tǒng)的順、 反式切割活性設計信號讀出, 實現(xiàn)高靈敏高通量的檢測也是分析化學追求的目標之一。