不同品種哈密瓜果實(shí)脯氨酸代謝對低溫的響應(yīng)

畢 瑩，王新宇，李 慧，黃 帥，張 琪，雷雅馨，王 雪，王富鑫，許文昌，王 靜

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

哈密瓜（Cucumis melovar.saccharinus）屬葫蘆科、甜瓜屬、厚皮甜瓜類，是新疆傳統(tǒng)的名優(yōu)特產(chǎn)，其肉質(zhì)松脆、味道香甜、營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛[1]。但哈密瓜果實(shí)生理代謝旺盛，產(chǎn)季集中且采收溫度較高，采后衰老和品質(zhì)劣變迅速，易造成大量經(jīng)濟(jì)損失[2]。低溫冷藏是哈密瓜果實(shí)保鮮最有效的方法之一，適當(dāng)?shù)牡蜏乜捎行б种破涔麑?shí)采后呼吸作用和乙烯的生成，延緩果實(shí)衰老，減少果實(shí)采后腐爛損失。但哈密瓜果實(shí)對低溫環(huán)境敏感，不適宜的低溫易引起冷害。冷害的發(fā)生嚴(yán)重降低了哈密瓜果實(shí)采后品質(zhì)，影響其商品附加值，限制了低溫冷藏及冷鏈物流技術(shù)在哈密瓜采后保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用與推廣[3]。因此，探究哈密瓜果實(shí)發(fā)生冷害癥狀的機(jī)理，有助于緩解哈密瓜產(chǎn)業(yè)的浪費(fèi)問題以及振興新疆地區(qū)果蔬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)。

國外研究顯示，脯氨酸作為細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在提高果蔬的抗冷性方面發(fā)揮非常重要的作用。當(dāng)果蔬受到低溫脅迫時(shí)，脯氨酸會開始大量積累，它可以增加細(xì)胞滲透壓，穩(wěn)定細(xì)胞膜和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激下的氧化損傷，從而維持細(xì)胞膜的完整性，提高植物的抗冷性[4-5]。李小安[6]在研究低溫脅迫對不同扁蓿豆種子內(nèi)游離脯氨酸的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可以通過提高植物體內(nèi)游離脯氨酸含量從而適應(yīng)低溫逆境、減輕低溫傷害，增強(qiáng)其抗冷能力。陳代慧等[7]探究低溫脅迫對不同品種山茶花的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低溫環(huán)境中存放越久，體內(nèi)脯氨酸含量越高。陳智智[8]在對桃果實(shí)進(jìn)行外源脯氨酸處理后，發(fā)現(xiàn)脯氨酸能通過提高Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrrolidine-5-carboxylic acid synthase，P5CS）、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ornithine transaminase，OAT）和谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）的活性，降低脯氨酸脫氫酶（proline dehydrogenase，ProDH）的活性，明顯降低桃果實(shí)的冷害指數(shù)，延緩冷害癥狀的發(fā)生。李大紅等[9]在研究如何提高羽衣甘藍(lán)的抗寒性時(shí)，發(fā)現(xiàn)P5CS基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)脯氨酸的合成速度，此外P5CS還參與了其他的代謝調(diào)控，能夠增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、減輕細(xì)胞質(zhì)膜的氧化，從而在整體上提高了羽衣甘藍(lán)的抗寒性，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明P5CS是植物通過脯氨酸代謝提高耐冷性途徑中的關(guān)鍵酶。果蔬冷害的發(fā)生影響了脯氨酸的含量，而脯氨酸作為氨基酸的一種，氨基酸總量也與冷害有密切的聯(lián)系。馮雙慶等[10-11]在研究冷害溫度下番茄和黃瓜的氨基酸含量變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，冷害的發(fā)生會降低番茄和黃瓜體內(nèi)總氨基酸含量。劉平香[12]對大蒜貯藏過程中的特征成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)可以對代謝物進(jìn)行定性和相對定量分析。

已有研究表明，從普通菜豆中分離克隆得到了P5CS酶的基因PvP5CS1和PvP5CS2[13]。在滲透調(diào)節(jié)的逆境脅迫前期階段均會出現(xiàn)PvP5CS1和PvP5CS2mRNA的積累，而脯氨酸積累則是出現(xiàn)在中后期階段，PvP5CS1和PvP5CS2mRNA的積累明顯比脯氨酸積累要早。在滲透和脅迫環(huán)境條件影響下，PvP5CS1和PvP5CS2基因與AtP5CS1[14]和OsP5CS1[15]基因類型一樣，在促進(jìn)脯氨酸的合成轉(zhuǎn)化中可起到十分重要的調(diào)控作用。由此說明，測定P5CS基因類型對研究脯氨酸代謝有十分重要的意義。因此，研究脯氨酸及其代謝過程中的關(guān)鍵酶P5CS在逆境脅迫下的調(diào)控機(jī)理和抗性機(jī)制有利于果蔬抵御不同程度的侵害。但是對哈密瓜果實(shí)采后此方面的研究目前鮮見相關(guān)報(bào)道，而研究主要集中在細(xì)胞膜脂[16]、活性氧[17]、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[2]等方面，其中對哈密瓜果實(shí)低溫脅迫下脯氨酸代謝的表達(dá)分析主要集中在某一品種上，缺少耐冷性強(qiáng)和弱的品種之間的研究。

本研究重點(diǎn)分析在低溫貯藏環(huán)境中耐冷性較弱的早熟‘西周密25號’和耐冷性較強(qiáng)的晚熟‘伽師瓜’果實(shí)脯氨酸代謝、氨基酸總量以及冷害發(fā)生的差異，并通過全基因合成哈密瓜果皮CmP5CS基因類型，探究抗冷性不同的哈密瓜果實(shí)在低溫脅迫中的應(yīng)答機(jī)理，旨在為哈密瓜果實(shí)采后的貯運(yùn)保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘西周密25號’哈密瓜（可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.44%），于2022年7月15日采收于新疆維吾爾自治區(qū)五家渠市商品瓜基地；‘伽師瓜’哈密瓜（可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.17%），于2022年8月9日采收于新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)伽師縣商品瓜基地。同一個(gè)品種選擇成熟度基本相同、大小均一、無病蟲害、無腐爛和無機(jī)械損傷的瓜進(jìn)行采摘，采摘時(shí)留取2～5 cm果柄，將采后哈密瓜果實(shí)單獨(dú)套裝發(fā)泡網(wǎng)，每4 個(gè)裝于1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)紙箱，立即運(yùn)送至新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院504實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清洗，隨即運(yùn)至（3.0±0.5）℃冷庫內(nèi)貯藏（根據(jù)劉同業(yè)[18]、安瑞麗[19]等的研究結(jié)果，‘西周密25號’和‘伽師瓜’哈密瓜果實(shí)均能在3 ℃下發(fā)生冷害癥狀）。

磺基水楊酸、茚三酮、甲苯 天津市大茂化學(xué)試劑廠；冰乙酸 天津市鑫鉑特化工有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙三醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮 安徽Biosharp公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氫氧化鈉 天津市福晨化學(xué)試劑廠；酮戊二酸 上海展云化工有限公司；L-鳥氨酸 美國Sigma公司；還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、NAD＋美國BioFRoxx公司；二硫蘇糖醇 北京Solarbio公司；Tris、氯化鉀、氯化鎂 廣東方信生物科技有限公司；谷氨酸鈉天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鹽酸 珠海市華成達(dá)化工有限公司；無水碳酸鈉、碳酸氫鈉 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；以上所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

QL-861渦旋振蕩器 江蘇省海門市麒麟鱗醫(yī)用儀器廠；PTT-A＋200電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SF-GL-16A高速冷凍離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；P4PC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；XW-80A高速分散器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DW-40L92醫(yī)用低溫保存箱青島海爾特種電器有限公司；SW-CJ-2D潔凈工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；Mini Pro 300V Power Supply電泳儀 美國Major Science公司；EDC-810普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；MA-6000實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）儀 蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司；2500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司；AB Sciex QTRAP 6500＋質(zhì)譜儀 美國Waters公司；AB Sciex ExionLCTMAD液相色譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 冷害指數(shù)的測定

貯藏過程中，自放貯藏冷庫14 d后，各品種哈密瓜分別每7 d取3 個(gè)果實(shí)3 個(gè)重復(fù)，共計(jì)9 個(gè)瓜移至室溫放置5 d后，記錄果實(shí)變化，共取6 次。冷害指數(shù)計(jì)算根據(jù)Bi Yang等[20]的方法，癥狀按嚴(yán)重程度分為5級（0級：果面光潔，沒有冷害癥狀；1級：有輕微的下陷冷害斑，占果面總面積10%以下；2級：冷害面積占果面的比例在11%～25%；3級：冷害面積占果面的比例在25%～50%；4級：冷害面積占果面總面積的50%以上），分別記錄兩組的冷害級數(shù)，冷害指數(shù)計(jì)算公式如下：

1.3.2 游離脯氨酸含量測定

參照曹建康[21]、Gao Hui[22]等的方法，并略作修改，稱取2 g哈密瓜果皮，加入5 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷后的30 g/L磺基水楊酸溶液進(jìn)行研磨提取，轉(zhuǎn)入試管中煮沸提取10 min，期間搖勻3～4 次，取出冷卻至室溫后，于4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，收集上清液即為游離脯氨酸提取液。吸取上清液2 mL、酸性茚三酮溶液3 mL和冰乙酸溶液2 mL搖勻煮沸30 min，待冷卻后加入甲苯溶液4 mL，吸取上層溶液測定520 nm波長處吸光度，重復(fù)3 次。計(jì)算哈密瓜樣品中游離脯氨酸含量，單位為μg/g。

1.3.3 脯氨酸合成關(guān)鍵酶P5CS活性測定

參照黃琦輝[23]、Shang Haitao等[24]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液研磨，于4 ℃、12 000×g條件下離心25 min，取0.2 mL上清液加入2.4 mL Tris-HCl緩沖液、0.1 mL 25 mmol/L的MgCl2溶液、0.1 mL 75 mmol/L的谷氨酸鈉溶液、0.1 mL 5 mmol/L的ATP溶液，混勻后加入0.1 mL 0.4 mmol/L的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）溶液，測定反應(yīng)液每30 s在340 nm波長處的吸光度變化，重復(fù)3 次。以每分鐘每克哈密瓜果實(shí)吸光度變化0.001為1 個(gè)P5CS活性單位，結(jié)果用U/g表示。

1.3.4 脯氨酸合成關(guān)鍵酶OAT活性測定

參照黃琦輝[23]、Esteban等[25]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液研磨，4 ℃、12 000×g離心25 min，取0.2 mL上清液加入2.2 mL 200 mmol/L的Tris-HCl緩沖液、0.2 mL 46.8 mmol/L的鳥氨酸溶液、0.2 mL 12.5 mmol/L的α-酮戊二酸溶液，混勻后加入0.4 mL 0.25 mmol/L的NADH溶液，測定反應(yīng)液每30 s在340 nm波長處的吸光度變化，重復(fù)3 次。以每分鐘每克哈密瓜果實(shí)吸光度變化0.001為1 個(gè)OAT活性單位，結(jié)果用U/g表示。

1.3.5 脯氨酸降解關(guān)鍵酶ProDH活性測定

參照黃琦輝[23]、López-Carrión等[26]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液研磨，于4 ℃、12 000×g條件下離心25 min，取0.2 mL上清液加入2.4 mL 0.15 mmol/L的碳酸鈉緩沖液、0.2 mL 2.67 mmol/L的脯氨酸溶液，混勻后加入0.2 mL 10 mmol/L的NAD＋溶液，測定反應(yīng)液每30 s在340 nm波長處的吸光度變化，重復(fù)3 次。以每分鐘每克哈密瓜果實(shí)吸光度變化0.001為1 個(gè)ProDH活性單位，結(jié)果用U/g表示。

1.3.6 real-time PCR

采用real-time PCR測定P5CS、OAT、ProDH基因相對表達(dá)量，提取RNA，設(shè)計(jì)引物CmP5CS-F、CmP5CS-R、CmOAT-F、CmOAT-R、CmProDH-F、CmProDH-R、18S-F(NEI)、18S-R(NEI)，cDNA合成與real-time PCR引物分析，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中冷害發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，取貯藏在（3.0±0.5）℃條件下14、28、42 d的兩種哈密瓜果實(shí)，采用2-ΔΔCt分析方法，在赤道周圍約取2 cm厚的哈密瓜皮組織用來提取總RNA，取1 μL總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后取1 μL cDNA進(jìn)行real-time PCR。

1.3.7 液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）測定氨基酸含量

參考Sun Lulu等[27]的方法，液氮研磨樣本，稱取一定量的樣本加入質(zhì)譜水中，渦旋混勻?yàn)橄♂寴颖?；取稀釋樣?0 μL，加入200 μL含混合內(nèi)標(biāo)的沉淀劑（乙腈-甲醇（1∶1，V/V）），渦旋混勻，冰上靜置30 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取全部上清液進(jìn)行LC-MS分析，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，根據(jù)組間差異使用hiplot網(wǎng)站制作主成分分析（principal component analysis，PCA）圖。

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A相：含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液、B相：含0.1%甲酸的乙腈；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，正離子電離模式。離子源溫度550 ℃，離子源電壓5 500 V，氣簾氣壓35 psi，霧化氣壓50 psi，輔助氣壓60 psi。采用多反應(yīng)監(jiān)測進(jìn)行掃描。

1.3.8 全基因合成

對本研究所得脯氨酸代謝結(jié)果進(jìn)行分析，確定P5CS基因表達(dá)差異的顯著性，后續(xù)使用全基因合成法對該基因進(jìn)行合成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由WPS 2021及Origin 2022軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并制圖，利用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)貯藏期間冷害癥狀和冷害指數(shù)的比較

由圖1可知，‘西周密25號’在冷藏14 d后出現(xiàn)了冷害的癥狀，而‘伽師瓜’冷藏21 d才開始出現(xiàn)冷害癥狀，兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)冷害指數(shù)差異極顯著（P＜0.01）?！髦苊?5號’隨著冷藏時(shí)間的延長，冷害指數(shù)不斷升高，在冷藏42 d時(shí)達(dá)到46.67%?！煿稀?1～35 d時(shí)均出現(xiàn)輕微冷害癥狀，冷害指數(shù)均為4.44%，42 d冷害癥狀嚴(yán)重，此時(shí)冷害指數(shù)達(dá)到6.67%。‘西周密25號’的冷害指數(shù)極顯著高于‘伽師瓜’果實(shí)的冷害指數(shù)（P＜0.01），說明“西周密25號”較“伽師瓜”在低溫條件下更易出現(xiàn)冷害癥狀。

圖1 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)貯藏期間的冷害指數(shù)對比Fig.1 Comparison of chilling injury indices of two varieties of Hami melon during storage

2.2 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間游離脯氨酸含量的變化

由圖2可知，在兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間，游離脯氨酸含量均整體呈現(xiàn)上升趨勢，‘伽師瓜’在0～28 d游離脯氨酸含量始終處于上升趨勢，到35 d開始下降，42 d又開始升高，此時(shí)達(dá)到42.773 μg/g?！髦苊?5號’隨著貯藏時(shí)間的延長，游離脯氨酸含量持續(xù)升高，在42 d達(dá)到38.114 μg/g?！煿稀挠坞x脯氨酸含量在整個(gè)貯藏期里始終高于‘西周密25號’，其中在0 d和14 d顯著高于‘西周密25號’（P＜0.05），在7、21～42 d極顯著高于‘西周密25號’（P＜0.01）。說明在低溫脅迫條件下，耐冷性強(qiáng)的‘伽師瓜’果實(shí)更能激發(fā)游離脯氨酸含量的增加。

圖2 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間游離脯氨酸含量的變化Fig.2 Changes in free proline contents of two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.3 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間P5CS活性及基因表達(dá)量的變化

由圖3A可知，兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)在低溫貯藏期間，P5CS活性整體呈上升趨勢?！髦苊?5號’和‘伽師瓜’果實(shí)分別從貯藏初期的30.800 U/g和44.800 U/g上升至貯藏結(jié)束時(shí)的86.800 U/g和126.000 U/g，分別增長了1.818 倍和1.8125 倍。由此可見，‘西周密25號’和‘伽師瓜’P5CS活性在整個(gè)貯藏期內(nèi)的增長速率大致相同。但是‘伽師瓜’在第0天和14天時(shí)P5CS活性顯著高于‘西周密25號’（P＜0.05），在第28～42天的P5CS活性極顯著高于‘西周密25號’（P＜0.01），說明‘伽師瓜’在受到低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)的P5CS響應(yīng)較敏感，激發(fā)果實(shí)積累游離脯氨酸，提高其耐冷性。而‘伽師瓜’在第14～21天時(shí)，該酶的活性降低，推測可能是因?yàn)椤髦苊?5號’發(fā)生冷害所致。CmP5CS相對表達(dá)量如圖3B所示，在第28天時(shí)，‘伽師瓜’中CmP5CS相對表達(dá)量高于‘西周密25號’，這與兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)酶活性變化相似，其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與酶活性差異相反。而各品種CmP5CS相對表達(dá)量的變化趨勢與其對應(yīng)的酶活性變化趨勢相近，‘西周密25號’都呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，‘伽師瓜’都呈現(xiàn)貯藏期內(nèi)大致升高的趨勢，推測CmP5CS相對表達(dá)量可能與P5CS活性以及哈密瓜果實(shí)發(fā)生冷害癥狀有關(guān)。

圖3 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間P5CS活性（A）及其CmP5CS基因相對表達(dá)量（B）的變化Fig.3 Changes in P5CS activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.4 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間OAT活性及基因表達(dá)量的變化

由圖4A可知，兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)在低溫貯藏期間，OAT活性整體呈上升趨勢，貯藏結(jié)束時(shí)‘西周密25號’和‘伽師瓜’果實(shí)OAT活性分別達(dá)到48.000 U/g和64.000 U/g，較貯藏初期分別增長了0.636 倍和1.010 倍，‘伽師瓜’果實(shí)的OAT保護(hù)效應(yīng)較顯著?！煿稀疧AT活性在第7天和第21～42天期間顯著高于‘西周密25號’（P＜0.05），在第14天極顯著高于‘西周密25號’（P＜0.01）。CmOAT相對表達(dá)量如圖4B所示，在第28天時(shí)，‘伽師瓜’的CmOAT相對表達(dá)量高于‘西周密25號’，與兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)酶活性相似，其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與酶活性相反，并且‘伽師瓜’CmOAT相對表達(dá)量整體增長幅度較小，“西周密25號”增長幅度較大，與OAT活性增長趨勢較為相近。

圖4 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間OAT活性（A）及其CmOAT基因相對表達(dá)量（B）的變化Fig.4 Changes in OAT activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.5 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間ProDH活性及基因表達(dá)量的變化

由圖5A可知，兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)在低溫貯藏期間，ProDH活性整體呈下降趨勢。‘西周密25號’及‘伽師瓜’ProDH活性分別由原始點(diǎn)的80.000 U/g和56.000 U/g下降至29.333 U/g和26.667 U/g，下降幅度分別為63.3%和52.4%，‘西周密25號’下降幅度更大?！髦苊?5號’在第0天和第35天ProDH活性顯著高于‘伽師瓜’（P＜0.05），可能與其冷害發(fā)生程度有關(guān)，且‘西周密25號’較‘伽師瓜’的ProDH活性高。說明‘西周密25號’較‘伽師瓜’果實(shí)更能促進(jìn)果實(shí)的游離脯氨酸含量下降，從而導(dǎo)致冷害加劇，該結(jié)果與圖3和圖4相印證。CmProDH基因相對表達(dá)量如圖5B所示，‘西周密25號’CmProDH相對表達(dá)量在第14天和第42天均高于‘伽師瓜’，且兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)CmProDH相對表達(dá)量在整個(gè)貯藏期呈下降趨勢，與其ProDH活性變化趨勢大致相同。

圖5 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間ProDH活性（A）及其CmProDH基因相對表達(dá)量（B）的變化Fig.5 Changes in ProDH activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.6 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)低溫貯藏期間各氨基酸總含量變化

根據(jù)圖6顯示，各個(gè)樣品的每組平行數(shù)據(jù)點(diǎn)在PCA圖中較為靠近，證明各平行樣品在主成分空間中具有相似的特征。

圖6 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)0、14、28、42 d樣品氨基酸PCA圖Fig.6 PCA plot for variations in total amino acid contents in two varieties of Hami melon fruits during storage

結(jié)合圖7和表1可以看出，‘西周密25號’和‘伽師瓜’果實(shí)在取樣時(shí)間內(nèi)，不同氨基酸含量的變化趨勢及含量不同。在冷害脅迫發(fā)生過程中與脯氨酸合成密切相關(guān)的谷氨酸途徑占優(yōu)勢，兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)的谷氨酸含量整體呈下降趨勢，且‘西周密25號’谷氨酸含量下降較快，到第42天下降幅度為89.1%，‘伽師瓜’谷氨酸含量下降幅度較小，為71.7%，說明‘伽師瓜’果實(shí)的脯氨酸含量保留較多，較‘西周密25號’果實(shí)耐冷性更強(qiáng)，表1中的脯氨酸含量變化也證明了該結(jié)論。

表1 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)不同貯藏時(shí)間下各氨基酸總含量Table 1 Total amino acid contents in two varieties of Hami melon fruits at different storage times mg/g

圖7 兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)23 種氨基酸提取離子流色譜圖Fig.7 Extracted ion chromatogram of 23 amino acids detected in two varieties of Hami melon fruits

2.7 哈密瓜P5CS基因合成序列分析

為探究脯氨酸代謝中關(guān)鍵酶P5CS的同源性，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挑選耐冷性較差的‘西周密25號’哈密瓜進(jìn)行全基因合成，測序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對，如圖8所示，通過同源進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)該片段與甜瓜（LOC103485529）的P5CSmRNA在同一分支，且同源性為100%；與黃瓜、冬瓜、西葫蘆、番南瓜P5CSmRNA同源性在90%以上；與葡萄、梨、橡膠P5CSmRNA同源性在50%以上。說明哈密瓜果皮中P5CS基因與甜瓜中P5CS基因功能相同，響應(yīng)冷害的機(jī)理相似。測序結(jié)果顯示，P5CS基因編碼蛋白質(zhì)分子量為77.7，等電點(diǎn)為6.28。該結(jié)果可為后續(xù)篩選驗(yàn)證能調(diào)控脯氨酸代謝的關(guān)鍵上游轉(zhuǎn)錄因子的研究奠定基礎(chǔ)。

3 討論

不同品種的哈密瓜果實(shí)可能會因?yàn)椴烧?、受日照時(shí)間長短、栽種土壤等不同而具有不同的冷害發(fā)生溫度、時(shí)間以及冷害癥狀。冷害指數(shù)是判斷哈密瓜冷害程度最直觀的品質(zhì)指標(biāo)，在本實(shí)驗(yàn)中，‘西周密25號’從14 d開始出現(xiàn)淺褐色的凹陷塊狀斑，并隨著時(shí)間的延長，冷害斑的面積越來越大，顏色越來越深，瓜體開始變軟凹陷產(chǎn)生水浸狀[28]，汁水通過變軟損壞的外皮流出?！煿稀睦浜Τ潭认噍^于‘西周密25號’要輕許多，在21 d時(shí)出現(xiàn)瓜體變軟凹陷并流汁的冷害現(xiàn)象，在42 d后開始出現(xiàn)了深褐色的凹陷塊狀斑，以上現(xiàn)象說明，在哈密瓜果實(shí)出現(xiàn)冷害現(xiàn)象時(shí)，細(xì)胞膜會受到損害，反映在果皮上，在3 ℃貯藏條件下，‘伽師瓜’受到損害的程度小于‘西周密25號’，說明‘伽師瓜’的耐冷性要好于‘西周密25號’。

游離脯氨酸是果蔬體內(nèi)一種非常重要的逆境脅迫響應(yīng)物質(zhì)，通常情況下游離脯氨酸的積累與代謝主要與OAT、P5CS和ProDH等酶有關(guān)，其中OAT和P5CS均是在脯氨酸代謝轉(zhuǎn)化過程中形成的一種合成酶，ProDH是脯氨酸脫氫酶，在3 種酶的共同作用下，動態(tài)調(diào)節(jié)和控制的循環(huán)構(gòu)成了果蔬體內(nèi)游離脯氨酸的合成積累與自然降解的往復(fù)過程[29]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，‘西周密25號’與‘伽師瓜’在整個(gè)低溫貯藏期游離脯氨酸含量都明顯升高，且增長速率較快，說明在低溫脅迫下哈密瓜果實(shí)可以通過快速大量積累體內(nèi)游離脯氨酸抵御外界破壞，減輕對果皮細(xì)胞造成的侵害。與青茄[30]、黃瓜[31]、青椒[32]、‘新密3號’哈密瓜[33]等果實(shí)在低溫環(huán)境中通過提高自身的游離脯氨酸含量抵御低溫脅迫的現(xiàn)象相似?！煿稀挠坞x脯氨酸含量始終顯著高于‘西周密25號’，說明在3 ℃條件下‘伽師瓜’的耐冷性好于‘西周密25號’，與冷害指數(shù)的結(jié)果吻合。在整個(gè)低溫貯藏過程中兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)P5CS活性均升高，說明哈密瓜果實(shí)可以通過提高P5CS活性抵御低溫脅迫，其中‘伽師瓜’的P5CS活性整體高于‘西周密25號’，這與游離脯氨酸含量的結(jié)果相對應(yīng)，同時(shí)兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)基因相對表達(dá)量也隨著貯藏時(shí)間的延長而升高，與酶活性變化情況相同，證實(shí)哈密瓜果實(shí)會通過提高P5CS活性維持游離脯氨酸含量的增加，從而提高哈密瓜的抗寒性，與玉米[34]、桃[35]、枇杷[36]等果實(shí)的研究結(jié)果相似。OAT是游離脯氨酸合成過程中的關(guān)鍵酶，在兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)中的變化與游離脯氨酸含量相同，在整個(gè)貯藏期內(nèi)呈上升趨勢，且‘伽師瓜’的OAT活性始終高于‘西周密25號’，相應(yīng)基因的相對表達(dá)量也在貯藏初期至貯藏末期內(nèi)升高。ProDH作為脯氨酸降解第一步中的限速酶，可以為植物提供能量[37]。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著低溫貯藏時(shí)間的延長，兩個(gè)品種哈密瓜果實(shí)ProDH活性逐漸降低，基因相對表達(dá)量在貯藏后期低于貯藏前期，說明哈密瓜果實(shí)ProDH基因的相對表達(dá)量與酶活性較為一致，該結(jié)果與羅丹等[38]、王延圣[39]和劉彩紅[40]的部分研究相似。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)‘西周密25號’在冷藏中大部分氨基酸總含量隨著貯藏時(shí)間的延長而降低，說明‘西周密25號’哈密瓜果實(shí)冷害癥狀嚴(yán)重，冷害的發(fā)生破壞了其細(xì)胞及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，降低其組織內(nèi)的氨基酸含量，與龔曉平[41]、黃愛萍[42]等研究結(jié)果相似；而‘伽師瓜’的氨基酸總含量增加，與土壇樹果實(shí)[43]、‘紅地球’葡萄[44]的氨基酸變化趨勢相似。該變化是否與其成熟度低有關(guān)，具體成因目前尚不可知，有待進(jìn)一步探究。對耐冷性較差的‘西周密25號’哈密瓜進(jìn)行全基因合成，得出哈密瓜CmP5CS與甜瓜P5CS親緣關(guān)系很近，同源性達(dá)到100%，表明‘西周密25號’哈密瓜中P5CS基因在調(diào)控脯氨酸合成過程中與甜瓜中的P5CS基因功能相同。

4 結(jié)論

哈密瓜果實(shí)和甜瓜果實(shí)親緣關(guān)系極近，當(dāng)哈密瓜果實(shí)遭受到低溫脅迫時(shí)，會通過降低ProDH活性、提高P5CS以及OAT活性提高游離脯氨酸含量，提升自身耐冷性。而冷害嚴(yán)重的哈密瓜果實(shí)體內(nèi)能量消耗快、細(xì)胞及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會被破壞，從而降低果實(shí)各氨基酸的總含量。綜合分析游離脯氨酸、谷氨酸及脯氨酸總量變化，說明‘伽師瓜’的耐冷性強(qiáng)于‘西周密25號’。