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    兩種生育酚酯衍生物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

    2024-04-08 02:41:18陳煒莉王璧瑩李家旭闞緒甜李文治
    食品科學(xué) 2024年6期
    關(guān)鍵詞:小鼠能力

    陳煒莉,貝 翎,楊 揚(yáng),王璧瑩,李家旭,闞緒甜,李文治,杜 冰,*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.無限極(中國)有限公司研發(fā)中心,廣東 廣州 510623)

    衰老是以細(xì)胞、組織、器官功能進(jìn)行性喪失為特征的自然生命過程,隨著衰老程度的加劇,機(jī)體細(xì)胞壽命機(jī)制的有效性降低,使得衰老成為許多疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素,包括心腦血管疾病、糖尿病、高血壓等[1]。當(dāng)前,科學(xué)界提出關(guān)于衰老機(jī)制的理論有自由基學(xué)說、線粒體DNA損傷學(xué)說、端粒學(xué)說、遺傳程序?qū)W說等,其中自由基學(xué)說是目前研究和接受最廣泛的學(xué)說[1-2]。自由基學(xué)說是指細(xì)胞有氧代謝時(shí),自由基水平升高或抗氧化劑缺乏導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力降低,細(xì)胞毒性增強(qiáng),并最終導(dǎo)致細(xì)胞膜、氨基酸鏈和DNA的分子結(jié)構(gòu)不可逆轉(zhuǎn)地受損,從而使機(jī)體老化[3]。因此,隨著世界人口老齡化加快,抗氧化與抗衰老相關(guān)研究已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。

    研究表明,過量的D-半乳糖會(huì)在體內(nèi)積聚,在半乳糖氧化酶的作用下,可產(chǎn)生己醛糖和過氧化氫,促進(jìn)氧自由基和超氧陰離子的產(chǎn)生,破壞大分子和細(xì)胞功能[4];由于D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老模型具有與正常衰老小鼠相似的癥狀,被廣泛用于衰老機(jī)制的研究和抗衰老藥物的篩選[5]。氧化應(yīng)激和炎癥是衰老的主要特征,許多研究表明,核因子-E2-相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激途徑,在正常生理?xiàng)l件下,Nrf2以非活性形式存在于細(xì)胞中,而在氧化應(yīng)激條件下,激活的Nrf2從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,通過抗氧化元件反應(yīng)(antioxidant response element,ARE)誘導(dǎo)特定基因的表達(dá),從而調(diào)節(jié)II相抗氧化酶,如醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase,NQO1)、血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)等基因的表達(dá),減輕氧化應(yīng)激及炎癥引發(fā)的機(jī)體損傷[4,6]。

    長期以來,人們都用維生素來抵抗自由基的破壞,VE(生育酚)作為一種脂溶性維生素,具有抗氧化功能,可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[7-8]。劉思彤等[9]的研究表明大豆異黃酮與VE對(duì)衰老模型小鼠肝組織病變都有減輕作用,且VE抗氧化能力比大豆異黃酮更強(qiáng)。Rattanawiwatpong等[10]研究發(fā)現(xiàn),含VC、VE及樹莓葉細(xì)胞培養(yǎng)提取物的血清能改善大部分皮膚老化現(xiàn)象(如皺紋、彈性低等)。VE可以被修飾成酯的形式,生育酚醋酸酯是一種比游離的VE更穩(wěn)定的抗氧化性化合物,便于VE制品的貯存、運(yùn)輸?shù)?,是目前生產(chǎn)中常用的VE酯化衍生物之一[7,11-12]。在生育酚醋酸酯的衍生物中,D-α-生育酚醋酸酯屬于天然形式,DL-α-生育酚醋酸酯屬于合成形式。Yasin等[13]研究表明,在肉雞中投喂適量α-生育酚醋酸酯能顯著增加肌肉氧化穩(wěn)定性和減少脂肪沉積,從而達(dá)到增強(qiáng)雞肉氧化穩(wěn)定性的目的。

    因此,本研究將探究兩種生育酚醋酸酯的體外抗氧化作用,并基于衰老模型,對(duì)比兩者體內(nèi)抗氧化及抗衰老作用,以期為尋找抗衰老物質(zhì)提供相關(guān)的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、材料與試劑

    雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2021-0041。

    D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯由無極限(中國)有限公司提供;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(astaxanthin,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

    1.2 儀器與設(shè)備

    萬分之一天平 上海舍巖儀器有限公司;ANKE TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司;Labserv K3酶標(biāo)儀、PIKOREAL96熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;H1650R臺(tái)式冷凍離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;BioPrep-24生物樣品均質(zhì)儀 杭州奧盛儀器有限公司;DYY-6C電泳儀北京六一生物科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 體外抗氧化活性測定

    1.3.1.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力測定

    參照楊斯惠等[14]的方法并略作改動(dòng),將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液,取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣液于離心管中,分別加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基溶液,充分搖勻,暗反應(yīng)30 min,以無水乙醇為參比溶液調(diào)零,在517 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。DPPH自由基清除能力按公式(1)計(jì)算:

    式中:A2為樣品的吸光度;A1為用無水乙醇替代DPPH溶液的對(duì)照組吸光度;A0用無水乙醇代替生育酚酯衍生物樣品溶液的空白組吸光度。

    1.3.1.2 羥自由基清除能力測定

    參照王鈺等[15]的方法,將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液,在510 nm波長處用酶標(biāo)儀測其吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

    1.3.1.3 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基清除能力測定

    參照蔣海艷等[16]的方法,將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液,在734 nm波長處用酶標(biāo)儀測定其吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

    1.3.1.4 Fe2+螯合能力測定

    參照王肖行等[17]的方法,將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液,在562 nm波長處用酶標(biāo)儀測定其吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

    1.3.1.5 總還原能力測定

    參考王兵亞等[18]的方法并做改動(dòng)。將樣品用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液,取2.5 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于試管中,依次加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL,搖勻后于50 ℃下水浴20 min,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液2.5 mL,充分搖勻后以4 000 r/min離心15 min,取上清液2.5 mL,加入等體積的蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液,搖勻后靜置10 min,在700 nm波長處用酶標(biāo)儀測其吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。總還原能力按公式(2)計(jì)算:

    式中:R為總還原能力;A1為樣品溶液吸光度;A0為用無水乙醇替代樣品稀釋液作為空白對(duì)照測其吸光度。

    1.3.2 衰老模型抗氧化及抗衰老作用分析

    1.3.2.1 衰老模型建立及干預(yù)

    參考Lei Shuwen等[19]的方法,72 只SPF級(jí)雄性小鼠經(jīng)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后,隨機(jī)分成6 組,每組12 只,分別為正常對(duì)照組(N C 組)、衰老模型組(S L M組)、DL-α-生育酚醋酸酯組(VEH組)、D-α-生育酚醋酸酯低劑量組(VECL組)、D-α-生育酚醋酸酯中劑量組(VECM組)、D-α-生育酚醋酸酯高劑量組(VECH組)。其中,除了NC組在頸背皮下注射0.9%生理鹽水(0.1 mL/10 gmb)外,其余各組每日皮下注射300 mg/kgmb的D-半乳糖(0.1 mL/10 gmb)進(jìn)行造模,同時(shí)VEH、VECL、VECM、VECH組每日經(jīng)口給予生育酚酯衍生物的灌胃劑量分別為10、10、50、100 mg/kgmb,根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算給藥體積(0.1 mL/10 gmb),持續(xù)42 d。

    1.3.2.2 樣品收集

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠禁食12 h,摘出眼球,用離心管收集血液,將采集的血于37 ℃孵育1 h后置于4 ℃冰箱過夜,4 000 r/min離心15 min后,取上清液即為血清。采血后,立即將小鼠頸椎脫臼處死,快速取出肝臟,并用預(yù)冷的生理鹽水洗去血液,濾紙吸干表面水分后凍存待用。

    1.3.2.3 抗氧化指標(biāo)測定

    按照相應(yīng)試劑盒說明書分別測定血清中GSH-Px活力、T-AOC及MDA生成量。

    1.3.2.4 血清炎癥因子測定

    按照相應(yīng)試劑盒說明書分別測定IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

    1.3.2.5 肝功能指標(biāo)測定

    根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書分別測定肝功能指標(biāo)血清AST、ALT水平。

    1.3.2.6 Nrf2通路的mRNA表達(dá)水平分析

    參考周意等[20]的方法,取0.02 g肝臟組織,利用TRIzol法提取肝臟組織總RNA,以肝臟組織總mRNA為模板,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,后采用SYRB熒光定量PCR試劑盒檢測Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量,PCR引物由北京擎科有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列見表1。

    表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

    1.3.2.7 Nrf2通路的蛋白表達(dá)水平分析

    取0.025 g肝臟組織放入預(yù)冷緩沖液清洗,加入300 μL的RIPA裂解液,冰上裂解10 min后,在4 ℃、12 000 r/min離心15 min,收集上清液,即為提取的全蛋白。取120 μL蛋白上清液,加入30 μL 5×loading buffer混勻,沸水浴5 min,放入冰盒中速冷備用;根據(jù)蛋白定量結(jié)果,上樣20 μL蛋白樣品,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)至NC膜上,封閉。加入稀釋后的Nrf2(1∶1 000)、NQO-1(1∶5 000)、HO-1(1∶2 000)和β-actin(1∶5 000)抗體,室溫放置60 min,4 ℃過夜,次日室溫放置30 min。加入稀釋后的二抗(1∶5 000),室溫孵育90 min,顯影,在凝膠成像系統(tǒng)成像。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    利用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖,采用單因素方差分析,P<0.05,差異顯著,結(jié)果用表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化活性

    2.1.1 DPPH自由基清除能力

    DPPH自由基清除能力常作為評(píng)價(jià)和尋找新的抗氧化物質(zhì)的指標(biāo)之一[21]。由圖1A可知,當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.3 mg/mL時(shí),兩種生育酚酯衍生物與VC的DPPH自由基清除能力接近。

    圖1 兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化能力Fig.1 In vitro antioxidant capacity of two tocopherol ester derivatives

    2.1.2 羥自由基清除能力

    羥自由基為氧化能力極強(qiáng)的活性氧,羥自由基清除能力越大,表明抗氧化能力越強(qiáng)[22]。如圖1B所示,質(zhì)量濃度在0.1~0.3 mg/mL時(shí),兩種生育酚酯衍生物的羥自由基清除能力大于相同質(zhì)量濃度的VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),羥自由基清除能力依次為VC>DL-α-生育酚醋酸酯>D-α-生育酚醋酸酯。

    2.1.3 ABTS陽離子自由基清除能力

    ABTS陽離子自由基清除能力可以用于評(píng)價(jià)極性和非極性樣品的抗氧化性[23]。如圖1C所示,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1~0.3 mg/mL時(shí),兩種生育酚酯衍生物的ABTS陽離子自由基清除能力高于相同質(zhì)量濃度的VC,但當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4~0.5 mg/mL時(shí),三者清除能力接近。

    2.1.4 Fe2+螯合能力

    抗氧化物螯合金屬離子被公認(rèn)為清除羥自由基的最佳途徑,F(xiàn)e2+能誘導(dǎo)超氧陰離子生成對(duì)人體有害的羥自由基[24]。在0.1~0.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),兩種生育酚酯衍生物的Fe2+螯合能力顯著高于VC;D-α-生育酚醋酸酯在0.2 mg/mL時(shí)Fe2+螯合能力最強(qiáng),為95.98%;DL-α-生育酚醋酸酯在0.3 mg/mL時(shí)Fe2+螯合能力最強(qiáng),為88.78%。

    2.1.5 總還原能力

    抗氧化化合物利用本身還原作用給電子,從而清除自由基,總還原能力越強(qiáng)說明該物質(zhì)抗氧化能力越強(qiáng)[17]。由圖1E可知,質(zhì)量濃度為0.1~0.5 mg/mL時(shí),兩種生育酚酯衍生物還原能力高于相同質(zhì)量濃度下VC的還原能力,且隨著質(zhì)量濃度的提高,三者還原能力增加,呈現(xiàn)出一定的線性增長關(guān)系。

    5 種體外抗氧化能力指標(biāo)分析結(jié)果說明兩種生育酚酯衍生物有相似的抗氧化能力,在0.1~0.3 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),二者的羥自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、Fe2+螯合能力和總還原能力均優(yōu)于VC。

    2.2 兩種生育酚酯衍生物的對(duì)衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

    2.2.1 體內(nèi)抗氧化指標(biāo)

    許多研究結(jié)果顯示,D-半乳糖的注射誘導(dǎo)可加快小鼠衰老的速度,導(dǎo)致氧化應(yīng)激并產(chǎn)生MDA,MDA水平可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[25-26];GSH-Px是機(jī)體重要的抗氧化酶,通過清除體內(nèi)氧代謝生成的產(chǎn)物和維持谷胱甘肽活性從而維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能[27];T-AOC是評(píng)價(jià)動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶和非酶系統(tǒng)水平的綜合指標(biāo),可反映生物體的自由基代謝能力,T-AOC低表明機(jī)體抗氧化系統(tǒng)不活躍,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和自由基豐富[25]。由圖2可知,SLM組小鼠的MDA含量顯著高于NC組(P<0.000 1),而GSH-Px活力和T-AOC顯著低于NC組(P<0.000 1,P<0.001)。添加兩種生育酚酯衍生物都能顯著降低MDA含量,VEH組、VECL組、VECM組、VECH組依次降低63.85%、60.02%、64.16%、71.12%(P<0.000 1)。添加兩種生育酚酯衍生物顯著提高了GSH-Px活力和T-AOC水平,VEH組、VECL組、VECM組、VECH組的GSH-Px活力分別升高78.33%、80.03%、88.86%、68.11%(P<0.05,P<0.000 1),T-AOC水平分別升高63.42%、45.45%、81.82%、118.18%(P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.000 1)。Min等[28]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充VE可顯著降低氧化應(yīng)激大鼠血清中MDA含量,增加GSH-Px基因的表達(dá)從而提高氧化應(yīng)激公雞的抗氧化能力和免疫性能,這與本研究結(jié)果相似。綜上,兩種生育酚酯衍生物具有良好的抗氧化能力,對(duì)小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷具有一定的改善作用。

    圖2 兩種生育酚酯衍生物對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of two tocopherol ester derivatives on antioxidant indexes of mice

    2.2.2 血清炎癥因子

    氧化應(yīng)激的發(fā)生一般伴有炎癥反應(yīng),氧化應(yīng)激增強(qiáng)會(huì)刺激炎癥因子的表達(dá)[29]。血清中促炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α能促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)行,其含量越低說明機(jī)體免疫功能越強(qiáng)[30]。如圖3所示,SLM組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量比NC組顯著提高(P<0.000 1)。隨著D-α-生育酚醋酸酯劑量的增加,小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著降低,VECL組和VECH組小鼠的IL-6含量分別降低3.28%和9.88%,IL-1β含量分別降低1.71%和7.18%,TNF-α含量分別降低了13.88%和20.22%。VEH組的IL-1β和TNF-α含量比SLM組顯著降低(P<0.05),表現(xiàn)出比VECL組更好的抗炎效果。Barros等[31]研究發(fā)現(xiàn)含有維生素E醋酸酯的活性制劑對(duì)白色念球菌具有抗炎活性,與本研究結(jié)果相似。綜上,兩種生育酚酯衍生物能夠降低由D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型的炎癥因子增加,從而達(dá)到抗衰老的目的,且相同劑量下DL-α-生育酚醋酸酯效果比D-α-生育酚醋酸酯好。

    圖3 兩種生育酚酯衍生物對(duì)小鼠血清炎癥因子的影響Fig.3 Effects of two tocopherol ester derivatives on serum levels of inflammatory cytokines in mice

    2.2.3 肝功能指標(biāo)AST、ALT

    AST、ALT活性是目前臨床上常用的反映肝功能受損程度的生化指標(biāo),在肝細(xì)胞受損時(shí),可引起細(xì)胞膜的通透性改變,血清ALT水平增加,當(dāng)線粒體進(jìn)一步受到影響時(shí),AST含量升高[32]。從圖4可知,SLM組小鼠的AST和ALT活力較NC組顯著增加,分別增加18.95%、40.32%(P<0.000 1),而經(jīng)過兩種生育酚酯衍生物干預(yù),小鼠的AST、ALT活力有所降低。VEH組小鼠血清中AST活力顯著低于VECL組(P<0.05),VEH組小鼠血清中AST和ALT含量比SLM組分別降低了7.20%、27.50%,VECL組則分別降低了5.81%、21.74%;經(jīng)過D-α-生育酚醋酸酯干預(yù)小鼠的AST、ALT活力隨著服用劑量增加而降低。Shah等[33]研究發(fā)現(xiàn),在雄性鵪鶉日糧中添加松葉和維生素E醋酸酯能夠降低鵪鶉血清中AST含量,與本研究結(jié)果相似。綜上,兩種生育酚酯衍生物能減輕肝功能受損程度。

    圖4 兩種生育酚酯衍生物對(duì)小鼠AST、ALT的影響Fig.4 Effects of two tocopherol ester derivatives on liver AST and ALT activities in mice

    2.2.4 Nrf2通路相關(guān)蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量

    II相抗氧化酶NQO1和HO-1是Nrf2調(diào)控的下游靶蛋白,其中NQO1能催化醌類物質(zhì)及其衍生物還原,從而降低其氧化毒性,HO-1能夠與膽紅素、一氧化碳等一起發(fā)揮抗氧化作用,當(dāng)Nrf2作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子移位到細(xì)胞核中與ARE區(qū)域結(jié)合時(shí),導(dǎo)致II相抗氧化酶表達(dá)增強(qiáng)[34-36]。Nrf2通路中相關(guān)蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果如圖5所示,圖6為相關(guān)蛋白的Western blot圖。與NC組相比,SLM組的Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降,mRNA相對(duì)表達(dá)量分別降低了88.74%、87.76%和89.53%(P<0.000 1),蛋白相對(duì)表達(dá)量分別下降了92.42%、94.19%和95.77%(P<0.001,P<0.000 1)。與SLM組相比,各組干預(yù)下相關(guān)蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量不同程度上升。對(duì)于Nrf2、NQO1、HO-1mRNA而言,相比SLM組,VEH組Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別增加了514.08%、461.78%、515.32%(P<0.000 1),VECH組則分別增加288.82%、282.39%、311.44%(P<0.000 1)。對(duì)于Nrf2、NQO1、HO-1蛋白而言,相比SLM組,VEH組的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別增加了620.00%、988.89%、1 200.00%,而VECH組分別增加346.67%、533.33%、887.5%。給藥劑量為10 mg/kgmb的DL-α-生育酚醋酸酯組Nrf2通路相關(guān)蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量都高于給藥劑量為100 mg/kgmb的D-α-生育酚醋酸酯組。綜上,兩種生育酚酯衍生物可通過上調(diào)衰老小鼠Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量,提高其體內(nèi)抗氧化能力,抵抗氧化應(yīng)激,從而具有抗衰老作用,且DL-α-生育酚醋酸酯效果優(yōu)于D-α-生育酚醋酸酯。

    圖5 Nrf2通路中mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative mRNA and protein expression in the Nrf2 signaling pathway

    圖6 Nrf2、NQO1、HO-1的Western blot組圖Fig.6 Western blot patterns of Nrf2,NQO1 and HO-1

    3 結(jié)論

    本研究通過測定兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化能力,并采用D-半乳糖致小鼠衰老后,用兩種生育酚酯衍生物進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果表明,兩種生育酚酯衍生物具有較好的體外、體內(nèi)抗氧化效果,能調(diào)節(jié)衰老小鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α含量的升高,能使衰老小鼠的AST、ALT活力有所降低,有利于肝功能的修復(fù);與衰老模型組相比,兩種生育酚酯衍生物干預(yù)后,小鼠NQO1、HO-1與Nrf2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量增強(qiáng),說明生育酚酯衍生物通過上調(diào)NQO1、HO-1、Nrf2的表達(dá)水平發(fā)揮其抗氧化作用,且DL-α-生育酚醋酸酯效果優(yōu)于D-α-生育酚醋酸酯。綜上所述,兩種生育酚酯衍生物具有較強(qiáng)的抗氧化能力,并能通過提升Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量緩解衰老。

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