秦川牛宰后成熟期間BSG對(duì)MAPK信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡的影響

蘇曉鳳，李亞蕾，羅瑞明

（寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

動(dòng)物剛被屠宰放血后，線粒體仍有一定活性，但隨著氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的終止，細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡體系被打破，活性氧大量累積，必然造成肌細(xì)胞的損傷、凋亡[1]。基礎(chǔ)免疫球蛋白（basigin，BSG）是一種線粒體損傷蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，參與許多生理過程。研究表明，BSG可以通過激活細(xì)胞漿內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路增強(qiáng)激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達(dá)[2]。在細(xì)胞膜上，BSG是促進(jìn)細(xì)胞單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的協(xié)同分子。而單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)將胞內(nèi)糖酵解過程生成的乳酸快速轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，從而保持糖酵解的持續(xù)進(jìn)行以及維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。由于單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增加，細(xì)胞外的微環(huán)境中乳酸含量明顯增高，進(jìn)而刺激了透明質(zhì)酸的合成。而透明質(zhì)酸的增加也會(huì)激活MAPK信號(hào)通路和PI-3K/AKT信號(hào)通路等，進(jìn)而在缺血缺氧狀態(tài)及治療腫瘤疾病中充分發(fā)揮作用[3]。

BSG蛋白通過幾種不同的信號(hào)通路發(fā)揮作用，這些信號(hào)通路往往具有細(xì)胞特異性，其中包括MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，RAF蛋白、RAS蛋白、ERK蛋白都是該通路中的關(guān)鍵因子。Boulos等[4]研究發(fā)現(xiàn)，BSG通過MAPK途徑發(fā)揮作用，激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2信號(hào)。BSG激活了子宮成纖維細(xì)胞中的ERK1/2信號(hào)通路，致使MMPs的相對(duì)表達(dá)量增加；使用siRNA敲除BSG表達(dá)可顯著降低ERK信號(hào)傳導(dǎo)[5]。衣霉素作為N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可通過作用于BSG的N端結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)去糖基化。通過抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊使其生物學(xué)活性降低，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

盡管BSG基因在一些實(shí)體腫瘤中調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用已受到人們關(guān)注，但其在宰后貯藏過程肌細(xì)胞凋亡中的作用鮮見研究。因此本研究以秦川牛背上的最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，采用4D-非標(biāo)記定量（4D-label free quantification，4D-LFQ）組學(xué)方法分析在4 ℃條件下不同貯藏期秦川牛肉蛋白質(zhì)水平的變化，結(jié)合京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析明確BSG所參與的通路，另外通過BSG抑制劑衣霉素作用于秦川牛背最長(zhǎng)肌，評(píng)估衣霉素對(duì)MAPK信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用發(fā)育良好、體態(tài)健康的24 月齡秦川公牛。對(duì)樣品采集所用到的刀具、鑷子以及其他工具進(jìn)行高壓滅菌。按照商業(yè)化屠宰法對(duì)秦川黃牛進(jìn)行宰殺，取其背最長(zhǎng)肌，將每頭牛的背最長(zhǎng)肌平均分成3 份，總共9 個(gè)肉樣，每個(gè)肉樣切分成約120 g。將其用聚乙烯膜密封，并在4 ℃條件下冷藏不同時(shí)間。

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)R-250、衣霉素 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ARAF兔克隆抗體北京索萊寶科技有限公司；ERK1兔克隆抗體、KRAS＋HRAS＋NRAS兔克隆抗體、MEK1/2兔隆抗體、GAPDH鼠克隆抗體、生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G（H＋L）美國(guó)Abclonal公司。

1.2 儀器與設(shè)備

-80 ℃冰箱、MK3型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；MiniVac Alpha冷凍離心機(jī) 美國(guó)Scan Speed公司；高速冷凍研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；5200型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將樣品分成空白組和衣霉素組。對(duì)衣霉素組注射濃度為20 μmol/L的衣霉素溶液，同時(shí)對(duì)空白組注射等劑量的生理鹽水。用鋁箔包裹后放入4 ℃條件下的冰箱中冷藏。貯藏0、2、4、6、8 d后，將空白組和衣霉素組的樣品取出置于液氮2 h，取出將其放入-80 ℃冰箱中進(jìn)行保存，作為測(cè)定MAPK通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)含量與細(xì)胞凋亡率的樣品。

1.3.2 4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量

參照張杏亞等[6]的方法提取蛋白質(zhì)、篩選空白組0、4、8 d的BSG并測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量。參照羅輝等[7]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索、生物信息學(xué)分析、篩選差異蛋白質(zhì)。并利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)BSG及相關(guān)差異蛋白作KEGG分析。

1.3.3 Western Blotting法檢測(cè)MAPK通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)的含量

1.3.3.1 總蛋白提取

取出制備好的組織樣品放入2 mL研磨管中，向每管中倒入勻漿液（樣品與裂解液質(zhì)量比1∶10）和3 mm鋼珠，于高速冷凍研磨儀內(nèi)勻漿，其中溫度設(shè)置為-20 ℃，時(shí)間設(shè)置為60 s，重復(fù)研磨4 次，使組織碾碎。將研磨好的樣品取出來，4 ℃的冰箱里裂解30 min，在12 000 r/min條件下離心10 min，離心結(jié)束后將上清液倒出，移到新的離心管內(nèi)，貯存于-20 ℃。

1.3.3.2 樣品測(cè)定

使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定所提取的牛背最長(zhǎng)肌總蛋白濃度。取出2 μL待測(cè)蛋白樣品，添加裂解液至16 μL，取2 μL稀釋后的蛋白溶液于孔中，并補(bǔ)充裂解液至20 μL，再加入200 μL BCA工作液混合，在37 ℃放置30 min，以0號(hào)孔為對(duì)照，測(cè)定樣品在562 nm波長(zhǎng)處的OD值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量（μg），并計(jì)算蛋白質(zhì)量濃度。

各樣品組取50 μL，以體積比4∶1添加5×Loading buffer，于熱循環(huán)儀中95 ℃、15 min混勻，-80 ℃保存。待積層膠凝固后，用清水洗凈待測(cè)樣品組的積層膠，進(jìn)行電泳。上樣量30 μL（5 μg/μL），電壓調(diào)至100 V，電泳約0.5 h，待指示條帶接觸到分離膠界面后，再將電壓調(diào)至180 V，繼續(xù)電泳，約90 min后，待指示條帶到達(dá)膠的底部，電泳結(jié)束。在100 V、200 mA條件下電泳，轉(zhuǎn)膜1～2 h。將PVDF膜取出，置于孵育盒內(nèi)，在室溫條件下振蕩封閉2 h。去除封閉液，用含吐溫-20的Tris緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）略微清洗，將其擦干并剪切出所需的PVDF薄膜。

加入相應(yīng)的一抗于密封盒內(nèi)，于4 ℃進(jìn)行一夜的孵育培養(yǎng)；用TBST將PVDF膜洗滌5 min，共洗滌3 次。加入相應(yīng)的二抗，置于搖床在室溫下培育2～3 h。將PVDF膜用TBST清洗3 次，每次10 min左右。

將PVDF膜平鋪在曝光板上，滴加顯影液，反應(yīng)1 min，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀下進(jìn)行顯影，并依據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱，對(duì)曝光程度以及曝光時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。采用天能GIS機(jī)箱控制軟件V2.0對(duì)條帶進(jìn)行曝光掃描，分別測(cè)定牛背最長(zhǎng)肌ARAF、ERK1、KRAS＋HRAS＋NRAS、MEK1/2蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 秦川牛肉貯藏過程中caspase-3活力的測(cè)定

取200 mg的冷凍肉樣，在冷凍條件下，加入0.5 mL 100 mol/L Hepes（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% NP-40、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蔗糖、10 mol/L mDTT，pH 7.5）裂解液破碎勻漿，在-20 ℃條件下反復(fù)凍融3 次，再18 000×g離心30 min，取其上清液，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。反?yīng)液則由20 μL裂解物的上清液、0.2 mL反應(yīng)緩沖液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% CHAPS、100 mmol/L Hepes，pH 7.5）以及5 μL重建的熒光底物組成。caspase-3作用的底物為Ac-DEVD-AMC。將反應(yīng)溶液放入酶標(biāo)儀96 孔板中，37 ℃孵育1 h，激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm，測(cè)其熒光強(qiáng)度。酶活性以1 min時(shí)1 mg肉樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 28統(tǒng)計(jì)軟件，通過ANOVA單因素方差分析法、Duncan多重比較對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，明確數(shù)據(jù)之間的差異顯著性（P＜0.05）。并采用Origin 2021軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)作圖。結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.1.1 BSG的篩選及表達(dá)量的變化

利用4D-LFQ組學(xué)方法對(duì)宰后牛肉蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化進(jìn)行了研究和分析，并利用MaxQuant軟件對(duì)獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢索，共得1 149 個(gè)蛋白質(zhì)，從中篩選出BSG，其表達(dá)變化見表1。BSG表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。在0～4 d，BSG表達(dá)量呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05）。宰后0 d的BSG表達(dá)量為0.824，宰后4 d的BSG表達(dá)量為1.146。此時(shí)，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，牛肌細(xì)胞的線粒體損傷水平也逐漸提升，肉嫩度得到改善。宰后8 d的BSG表達(dá)量為0.971，與第4天相比，BSG表達(dá)量降低；此時(shí)隨著肉質(zhì)的進(jìn)一步成熟，牛的肌細(xì)胞線粒體損傷水平也降低，使得嫩度下降。結(jié)果表明，BSG作為一種線粒體損傷蛋白，其表達(dá)量與細(xì)胞損傷程度成正比，對(duì)肌肉結(jié)構(gòu)蛋白降解程度起到正向調(diào)控作用。

表1 秦川牛宰后貯藏期間BSG表達(dá)量的變化Table 1 Change in BSG concentration of Qinchuan cattle muscle during storage

2.1.2 差異蛋白質(zhì)的篩選

設(shè)置差異倍數(shù)為1.2且P＜0.05，共篩選鑒定出120 個(gè)差異豐富的蛋白質(zhì)。其中4 d與0 d鑒定出38 個(gè)差異表達(dá)蛋白，8 d與0 d鑒定出73 個(gè)差異表達(dá)蛋白，8 d與4 d鑒定出42 個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。通過UniProt軟件對(duì)所篩差異蛋白進(jìn)行檢索，利用功能特性篩出與BSG相關(guān)的差異蛋白，將此類蛋白質(zhì)與BSG表達(dá)量作相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示。這些蛋白質(zhì)與BSG的表達(dá)均顯著相關(guān)。

表2 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏0、4、8 d與BSG相關(guān)差異蛋白對(duì)比Table 2 Comparison of BSG-related differentially expressed proteins in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle stored for 0,4,and 8 days

2.1.3 KEGG分析

對(duì)BSG及其差異蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果如表3所示。顯著注釋于氧化磷酸化通路、鈣信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路。其中，在呼吸鏈電子傳遞復(fù)合物產(chǎn)生質(zhì)子梯度的情況下線粒體ATP合酶復(fù)合體亞基δ（ATP5F1D）使ADP生成ATP。NADH脫氫酶1α亞復(fù)合物亞基6（NDUFA6）是線粒體膜呼吸鏈NADH脫氫酶復(fù)合物I的輔助亞基，一般不參加催化作用，復(fù)合物I在將電子從NADH轉(zhuǎn)移到呼吸鏈過程中起一定效果。ATP5F1A、ATP5F1B則位于線粒體內(nèi)膜上，是氧化磷酸化結(jié)構(gòu)蛋白的核心[8]。NDUFA6主要是參與線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的組裝和氧化還原過程。肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶3（ATP2A3）是一種鎂依賴性酶，催化ATP的水解與鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)。線粒體內(nèi)膜的氧化磷酸化是ATP的主要來源[9]。以上結(jié)果表明，BSG參與了秦川牛肉宰后貯藏期間能量物質(zhì)代謝與線粒體損傷，并對(duì)MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)起到重要作用[10]。

表3 與BSG表達(dá)相關(guān)差異蛋白KEGG富集分析Table 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed proteins related to BSG expression

2.2 秦川牛背最長(zhǎng)肌MAPK通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)情況

2.2.1 秦川牛背最長(zhǎng)肌ARAF蛋白表達(dá)情況

采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)法比較秦川牛宰后貯藏過程中空白組和衣霉素組ARAF蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組與衣霉素組的ARAF蛋白相對(duì)表達(dá)量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在貯藏0～4 d時(shí)，空白組與衣霉素組的ARAF蛋白表達(dá)水平顯著升高。在第4天時(shí)，兩組肉樣的ARAF的蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。在貯藏4～8 d時(shí)，空白組與衣霉素組的ARAF表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì)。另外，在貯藏第0、2、4、6、8天時(shí)，衣霉素組的ARAF蛋白相對(duì)量均明顯降低（P＜0.05）。說明在用衣霉素抑制BSG后，ARAF蛋白表達(dá)明顯減少。

圖1 秦川牛背最長(zhǎng)肌ARAF蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of ARAF protein in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

2.2.2 秦川牛背最長(zhǎng)肌ERK1蛋白表達(dá)情況

如圖2所示，在貯藏期0～4 d時(shí)，空白組與衣霉素組ERK1蛋白的表達(dá)水平顯著升高。而在貯藏期4～8 d，空白組ERK1蛋白的相對(duì)表達(dá)量呈先下降后升高的趨勢(shì)，在第8天，ERK1蛋白的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值。宰后秦川牛肉在貯藏第0、2、4、6、8天時(shí)，衣霉素組ERK1的表達(dá)水平相較于空白組均明顯下降。說明在使用衣霉素抑制BSG后，ERK1蛋白表達(dá)明顯減少[11]。

圖2 秦川牛背最長(zhǎng)肌ERK1蛋白表達(dá)情況Fig.2 ERK1 protein expression in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

2.2.3 秦川牛背最長(zhǎng)肌KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白表達(dá)情況

RAS是一種GTP結(jié)合蛋白，具有激活MAPK信號(hào)通路的作用[12]。其主要包括KRAS、HRAS及NRAS 3 種亞型。如圖3所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組與衣霉素組的KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白的相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。在0～4 d時(shí)，空白組與衣霉素組的KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯升高。在第4天時(shí)，兩組的蛋白水平達(dá)到最高。在貯藏期4～8 d時(shí)，空白組與衣霉素組的蛋白表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì)。另外，在貯藏期間衣霉素組的KRAS＋HRAS＋NRAS相對(duì)表達(dá)量相較于空白組均明顯下降。說明在使用衣霉素抑制BSG后，KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白表達(dá)明顯減少。

圖3 秦川牛背最長(zhǎng)肌KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expression of KRAS+HRAS+NRAS proteins in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

2.3 秦川牛肉貯藏過程中caspase-3活力的變化情況

細(xì)胞凋亡是一種通過激活依賴能量的細(xì)胞內(nèi)死亡程序而導(dǎo)致多基因協(xié)調(diào)控制細(xì)胞自發(fā)、有序的死亡方式[13]。細(xì)胞一般在缺氧缺血狀態(tài)時(shí)會(huì)誘發(fā)其凋亡，這與畜禽屠宰后肌細(xì)胞所處狀態(tài)類似[14]。caspase-3蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡水平密切相關(guān)，其在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[15-18]。凋亡因子Cyt-c的釋放最終影響caspase-3的活性，激活線粒體凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19-20]。如圖4所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組與衣霉素組的caspase-3活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)。衣霉素組的caspase-3活力相較于空白組均明顯上升，表明在使用衣霉素抑制BSG后，caspase-3活力明顯增加。由此說明通過沉默BSG基因的表達(dá)后，細(xì)胞的凋亡率顯著增高。Intasai等[21]通過封閉單核細(xì)胞系U937的BSG蛋白質(zhì)表達(dá)后，細(xì)胞凋亡增加，說明BSG參與部分細(xì)胞凋亡路徑的調(diào)節(jié)，其凋亡機(jī)制與激活caspase相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致。

圖4 秦川牛宰后caspase-3活力變化Fig.4 Change of caspase-3 activity in Qinchuan cattle muscle after slaughter

3 討論

BSG是一種高度糖基化的跨膜蛋白，BSG通過MAPK途徑發(fā)揮作用，可以激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2信號(hào)。衣霉素則可通過作用于蛋白質(zhì)的N端結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)去糖基化。通過抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊使其生物學(xué)活性受到抑制，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[22-23]。動(dòng)物宰后肌細(xì)胞所處的缺氧缺血環(huán)境、肌肉pH值的變化、肌細(xì)胞內(nèi)外空間的變化都表明宰后肌細(xì)胞發(fā)生凋亡過程的理論可能性，也有相關(guān)研究表明宰后肌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象確實(shí)存在[24-25]。動(dòng)物死后肉的嫩化是一個(gè)涉及多種蛋白水解酶的復(fù)雜生物化學(xué)過程，凋亡引起的細(xì)胞死亡是此過程的一種新機(jī)制。細(xì)胞凋亡是肌細(xì)胞損傷機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它可以通過激活信號(hào)通路啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)死亡蛋白系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序化死亡[26]。MAPK家族是一類重要的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)胞處于損傷狀態(tài)時(shí)，p38 MAPK應(yīng)急信號(hào)途徑被快速啟動(dòng)，進(jìn)而激活c-Jun氨基未端激酶信號(hào)通路，調(diào)控ERK信號(hào)通路水平，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等一系列的生理過程[27]。在細(xì)胞損傷中ERK也起著較為重要的作用。

在衣霉素組中，ARAF、ERK1、KRAS＋HRAS＋NRAS的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)，這與于甜樂[28]的研究結(jié)果一致，由此表明，這3 種蛋白質(zhì)相對(duì)水平的下降，阻礙了MAPK家族信號(hào)通路系統(tǒng)的激活，使信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi)的過程受阻，多種轉(zhuǎn)錄因子不表達(dá)或表達(dá)較少，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在宰后肌細(xì)胞損傷過程中，BSG通過失活MAPK信號(hào)通路引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，從而致使細(xì)胞凋亡。在抑制BSG的表達(dá)后，相比于空白組，衣霉素組的caspase-3的相對(duì)表達(dá)量明顯上升，證明細(xì)胞凋亡是細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)。Baba等[29]發(fā)現(xiàn)BSG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與糖酵解代謝的不協(xié)調(diào)有關(guān)，Kuang Yehong等[30]發(fā)現(xiàn)抑制耐藥性腫瘤細(xì)胞的BSG表達(dá)可以引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，這與X連鎖凋亡抑制蛋白密切相關(guān)。BSG抑制劑通過失活MAPK信號(hào)通路使BSG蛋白下調(diào)，從而阻斷肌細(xì)胞的能量來源，誘導(dǎo)肌細(xì)胞凋亡。因此，BSG可能通過阻止肌細(xì)胞的能量供應(yīng)誘導(dǎo)活性氧生成，使線粒體外膜受損，導(dǎo)致Cyt-C釋放，從而啟動(dòng)caspase家族信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

利用4D-LFQ組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)宰后隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，秦川牛肉中BSG含量先上升后下降，BSG及其差異蛋白質(zhì)顯著注釋于氧化磷酸化通路、鈣信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路，說明BSG通過MAPK途徑發(fā)揮作用。通過向秦川牛肉的背最長(zhǎng)肌中注射BSG抑制劑的方法，有效干擾了BSG蛋白質(zhì)的表達(dá)。另外采用蛋白質(zhì)免疫印跡法測(cè)定秦川牛肉在貯藏過程中MAPK通路相關(guān)蛋白質(zhì)ARAF、ERK1以及KRAS＋HRAS＋NRAS的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)衣霉素組的MAPK通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)，說明BSG抑制劑使MAPK信號(hào)通路失活。這為研究BSG對(duì)MAPK信號(hào)通路影響奠定了良好的基礎(chǔ)。另外，在抑制BSG表達(dá)后，相比于空白組，衣霉素組的caspase-3的活力明顯上升，說明細(xì)胞凋亡是細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)，BSG參與宰后肌細(xì)胞凋亡路徑的調(diào)節(jié)，其凋亡機(jī)制與激活caspase相關(guān)。衣霉素通過作用于BSG的N端結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)發(fā)生去糖基化作用。通過細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的未折疊反應(yīng)使其生物活性受到抑制，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。即BSG可能通過阻斷肌細(xì)胞的能量來源，誘導(dǎo)活性氧生成，使得線粒體外膜受損，導(dǎo)致Cyt-C釋放，從而激活caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。