5 種氧化型減菌劑對(duì)羅非魚(yú)片品質(zhì)及蛋白質(zhì)的影響

閆玉紅，黃 卉，李來(lái)好，郝淑賢，陳勝軍，岑劍偉，吳燕燕，魏 涯，相 歡

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300）

羅非魚(yú)（Oreochromis nilotica）是我國(guó)主要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，以?xún)隽_非魚(yú)片出口銷(xiāo)售為主，鮮活銷(xiāo)售為輔[1]，若產(chǎn)品的初始菌落過(guò)高，在貯藏中易加速產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，因此加工過(guò)程中的減菌化處理顯得尤為重要[2]。常用的減菌劑有H2O2溶液、NaClO溶液、ClO2溶液、臭氧水和微酸性電解水等，多為氧化型減菌劑，減菌處理的同時(shí)還存在魚(yú)肉氧化的問(wèn)題[3]。

目前對(duì)減菌化處理的研究多集中在減菌效果及減菌劑對(duì)產(chǎn)品感官、色澤和脂肪氧化等方面的影響[1,4-6]，蛋白質(zhì)是鮮羅非魚(yú)片中最主要的組成成分，肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是肌肉組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占蛋白質(zhì)總量的50%～70%[4]，蛋白質(zhì)的氧化會(huì)對(duì)魚(yú)片的感官品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。鐘智豪[7]使用臭氧和二氧化氯對(duì)草魚(yú)進(jìn)行減菌處理，研究表明其蛋白質(zhì)氧化程度高于對(duì)照組；趙永強(qiáng)[8]、李文協(xié)[9]分別用臭氧水漂洗羅非魚(yú)片和鲅魚(yú)魚(yú)糜，均得出臭氧等能促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)生化特性改變的結(jié)論。雖然已有關(guān)于減菌劑對(duì)魚(yú)肉蛋白影響的研究，但多種減菌劑對(duì)蛋白質(zhì)氧化的比較研究鮮有報(bào)道。本研究在考察各減菌劑減菌效果的同時(shí)，測(cè)定魚(yú)片質(zhì)構(gòu)特性、色澤和MP氧化等指標(biāo)的變化情況，闡釋氧化型減菌劑對(duì)魚(yú)肉蛋白質(zhì)的影響；從微觀角度揭示羅非魚(yú)片減菌后品質(zhì)變化的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羅非魚(yú)（500±50）g 廣州華潤(rùn)萬(wàn)家超市。

三羥甲基氨基甲烷（分析純）酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；蛋白定量、羰基、巰基測(cè)試盒南京建成生物工程研究所；NuPAGETMBis-Tris預(yù)制膠（12%）、NuPAGETMMOPS十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）電泳緩沖液（20×）英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）上樣緩沖液、考馬斯亮藍(lán)染色液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；CR-400色彩色差 日本柯尼卡美能達(dá)控股公司；Sunrise-basic吸光酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；QTS-25質(zhì)構(gòu)儀美國(guó)CNS Farnel公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Mini Gel Tank蛋白電泳槽 美國(guó)Invitrogen公司；基礎(chǔ)電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；微酸性電解水實(shí)驗(yàn)機(jī)煙臺(tái)方心水處理設(shè)備有限公司；CFS 500臭氧水一體機(jī)北京山美水美環(huán)保高科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將鮮活羅非魚(yú)擊暈后宰殺、去皮，取背部肌肉，切成大小均勻的魚(yú)片（10.0 cm×4.0 cm×0.5 cm），清洗干凈，備用。

1.3.2 羅非魚(yú)片的減菌處理

用H2O2溶液、ClO2溶液、NaClO溶液、臭氧水和微酸性電解水對(duì)羅非魚(yú)片進(jìn)行減菌處理，質(zhì)量濃度和處理時(shí)間參考岑劍偉[1]、王萍[10]等的研究，以料液比1∶5浸泡羅非魚(yú)片，對(duì)照組用無(wú)菌水浸泡5 min，各處理組作3 個(gè)平行[1]，取平均值。減菌劑的質(zhì)量濃度和處理時(shí)間水平如表1所示。

1.3.3 菌落總數(shù)的測(cè)定

參照GB/T 4789.2—2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[11]進(jìn)行。通過(guò)減菌實(shí)驗(yàn)獲得最佳減菌處理結(jié)果后，進(jìn)一步針對(duì)最佳條件下的魚(yú)肉樣品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)特性、色澤、蛋白質(zhì)氧化等指標(biāo)的檢測(cè)分析。減菌率按式（1）計(jì)算：

1.3.4 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

參考熊雅雯等[12]的方法，并適當(dāng)修改。采用QTS-25質(zhì)構(gòu)儀對(duì)不同減菌處理下的魚(yú)片進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定，每組取魚(yú)片3 片，如圖1所示，沿魚(yú)片對(duì)角線(xiàn)在背部均勻選取5 個(gè)位置進(jìn)行測(cè)試，取平均值。

圖1 羅非魚(yú)片質(zhì)構(gòu)測(cè)試點(diǎn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the texture test points of tilapia fillets

1.3.5 色澤的測(cè)定

參考趙敏等[13]的方法，并適當(dāng)修改。白肉色澤測(cè)定背中部，紅肉色澤測(cè)定背部主脊部位，室溫下使用色差計(jì)測(cè)定不同減菌處理下魚(yú)片的L*、a*、b*值。

1.3.6 MP的提取和含量測(cè)定

MP的提取參考Pazos等[14]的方法并適當(dāng)修改，采用Bradford法測(cè)定MP含量。

1.3.7 羰基、巰基和疏水性的測(cè)定

巰基、羰基含量利用總巰基含量、羰基含量測(cè)定試劑盒測(cè)定。

疏水性測(cè)定參考Lv Mingchun等[15]的方法，并適當(dāng)修改。用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）將MP稀釋至1 mg/mL，取200 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液與1 mL MP混勻，1 mL緩沖液作為空白，渦旋振蕩10 min，4 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液稀釋10 倍，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以溴酚藍(lán)結(jié)合量表征疏水性，按式（2）計(jì)算：

1.3.8 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

參考Shi Jing等[16]的方法，并適當(dāng)修改。用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）將MP稀釋至1 mg/mL，濾膜過(guò)濾。以緩沖液作為空白，利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，激發(fā)波長(zhǎng)295 nm、發(fā)射波長(zhǎng)300～400 nm、波長(zhǎng)掃描范圍300～500 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.9 圓二色光譜測(cè)定

參考李可等[17]的方法，并適當(dāng)修改。用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）將MP稀釋至0.5 mg/mL，取適量于1 mm比色皿并放入樣品池內(nèi)。圓二色光譜儀參數(shù)：響應(yīng)時(shí)間0.5 s、掃描范圍190～260 nm、掃描步階1 nm、縫寬1 nm，摩爾橢圓率表示圓二色性，CDNN軟件計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.10 SDS-PAGE分析

參考Pan Chuang等[18]的方法，并適當(dāng)修改。MP與SDS-PAGE上樣緩沖液（5×）按3∶2（V/V）混合，沸水浴5 min，上樣量為10 μg，使用12% SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠，電泳電壓120 V，電泳時(shí)間約1 h。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 26軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過(guò)Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同減菌處理對(duì)鮮羅非魚(yú)片菌落總數(shù)的影響

H2O2溶液殺菌機(jī)理是利用活性氧，破壞微生物體內(nèi)組織，達(dá)到殺滅微生物的目的[5]。由圖2a可知，使用質(zhì)量濃度為500、1 000、1 500 mg/L的H2O2溶液處理羅非魚(yú)片，減菌率隨著溶液質(zhì)量濃度增加而顯著提高（P＜0.05），在500～1 000 mg/mL之間，減菌率增長(zhǎng)迅速，處理時(shí)間0～5 min組減菌速率明顯高于5～8 min組。原因可能有兩方面：一是魚(yú)片初始菌落數(shù)較大，前期殺菌速率較快，后期菌落總數(shù)基本穩(wěn)定；一是H2O2溶液穩(wěn)定性較低，受光照、放置時(shí)間等影響，分解為水和氧氣，導(dǎo)致溶液質(zhì)量濃度略有下降[6]。不同質(zhì)量濃度的減菌溶液處理羅非魚(yú)片，減菌率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和質(zhì)量濃度的增大而增加，如圖2a、3a所示，羅非魚(yú)片在質(zhì)量濃度1 500 mg/L溶液中浸泡處理8 min，處理當(dāng)天減菌率達(dá)到80.1%，4 ℃真空包裝貯存3 d的羅非魚(yú)片減菌率依然保持80%以上。石紅等[19]用1.27 g/L H2O2溶液浸泡染菌的蝦仁2 min，減菌率可達(dá)89.66%。孫繼英等[20]用0.7 g/L H2O2溶液處理魷魚(yú)6 min，減菌率可達(dá)97 %，比本實(shí)驗(yàn)減菌率略高，說(shuō)明H2O2溶液能有效殺菌，減菌率與原料及初始菌落有關(guān)。

圖2 5 種減菌劑對(duì)羅非魚(yú)片處理當(dāng)天的減菌效果Fig.2 Effect of five decontaminants on reducing bacterial load on tilapia fillets on the day of treatment

圖3 5 種減菌劑對(duì)羅非魚(yú)片處理后4 ℃真空包裝貯存3 d的減菌效果Fig.3 Effect of five decontaminants on reducing bacterial load on tilapia fillets stored in vacuum at 4 ℃ for 3 days after treatment

ClO2溶液能氧化定位細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，改變細(xì)胞膜的通透性，引起內(nèi)容物外泄、細(xì)胞代謝紊亂，進(jìn)而殺滅微生物[21]。由圖2b可知，用質(zhì)量濃度為100、150、200 mg/L ClO2溶液處理羅非魚(yú)片，100～150 mg/mL處理0～10 min減菌率變化顯著，150～200 mg/mL、10～15 min的處理?xiàng)l件下減菌率增長(zhǎng)緩慢，由此可知，ClO2溶液一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)減菌率提升加快，但超出此范圍，減菌率趨于穩(wěn)定。原因可能是ClO2對(duì)光敏感，在光照下極易分解，浸泡后期溶液濃度下降[22]。如圖2b、3b所示，羅非魚(yú)片在質(zhì)量濃度200 mg/L溶液中浸泡處理10 min，處理當(dāng)天減菌率達(dá)到81.3%，4 ℃真空包裝貯存3 d減菌率依舊能夠保持80%以上。王萍等[10]用200 mg/L ClO2處理20 min軍曹魚(yú)片，減菌率達(dá)83%，與本實(shí)驗(yàn)減菌率接近。

NaClO溶液殺菌主要通過(guò)次氯酸分子作用、新生氧的氧化作用和氯化作用，破壞細(xì)胞內(nèi)核酸和酶的結(jié)構(gòu)，引起糖代謝失調(diào)，進(jìn)而殺滅微生物[23]。由圖2c可知，用質(zhì)量濃度為100、150、200 mg/L的NaClO溶液處理羅非魚(yú)片，處理時(shí)間在0～10 min減菌率變化顯著，在10～15 min內(nèi)減菌變化不明顯，可能是NaClO溶液具有光敏性，見(jiàn)光后會(huì)迅速分解[24]。如圖2c、3c所示，魚(yú)片在質(zhì)量濃度200 mg/L溶液中浸泡處理10 min，減菌率達(dá)到80.9%，4 ℃真空包裝貯存3 d減菌率依舊能夠保持80%以上。何麗等[25]用300 mg/L NaClO溶液浸泡處理草魚(yú)魚(yú)腩5 min后減菌率達(dá)83%，本實(shí)驗(yàn)減菌率與其接近。

臭氧水中具有較高反應(yīng)活性的自由基，氧化破壞微生物的細(xì)胞器和DNA、RNA等重要組成部分，菌體細(xì)胞失去活力，微生物進(jìn)而裂解死亡[26]。由圖2d可知，用質(zhì)量濃度為3、7、9 mg/L的臭氧水處理羅非魚(yú)片，后期減菌速率明顯低于前期，原因可能是臭氧極易揮發(fā)，溶液質(zhì)量濃度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低[27]。如圖2d、3d所示，魚(yú)片在質(zhì)量濃度9 mg/L溶液中浸泡處理10 min，減菌率達(dá)到81.7%，4 ℃真空包裝貯存3 d減菌率依舊能夠保持80%以上。鐘智豪[7]在質(zhì)量濃度為7 mg/L的臭氧水中流動(dòng)浸泡草魚(yú)片10 min，減菌率達(dá)68.28%，減菌率比本實(shí)驗(yàn)低，有可能是臭氧濃度偏低造成的。

微酸性電解水是近年來(lái)新興的綠色殺菌技術(shù)，主要通過(guò)無(wú)隔膜的電解裝置將稀鹽酸溶液電解獲得，其中次氯酸為主要?dú)⒕煞諿28]，有效氯質(zhì)量濃度、pH 5.0～6.5和氧化還原電位是影響其殺菌效果的主要因素，三者共同作用通過(guò)攻擊微生物細(xì)胞的多個(gè)靶點(diǎn)達(dá)到殺菌目的[29]。由圖2e可知，用質(zhì)量濃度為20、30、40 mg/L的微酸性電解水處理羅非魚(yú)片，處理時(shí)間為0～10 min減菌率變化非常顯著，在10～20 min內(nèi)減菌變化不明顯，可能是10 min處理對(duì)細(xì)菌的殺菌效率已達(dá)到比較高的水平，菌落總數(shù)基本穩(wěn)定；也可能是微酸性電解水具有不穩(wěn)定性，曝光放置一段時(shí)間逐漸還原為普通水[29]。如圖2e、3e所示，魚(yú)片在質(zhì)量濃度30 mg/L溶液中浸泡處理20 min，減菌率達(dá)到80.21%，在質(zhì)量濃度40 mg/L溶液中浸泡處理15 min，處理當(dāng)天減菌率達(dá)到81.78%，4 ℃真空包裝貯存3 d減菌率依舊能夠保持80%以上，通過(guò)感官評(píng)價(jià)及質(zhì)構(gòu)分析得到魚(yú)片在質(zhì)量濃度30 mg/L的微酸性電解水中處理20 min品質(zhì)較好。于福田[30]研究表明在35 mg/L的微酸性電解水中以料液比1∶6浸泡羅非魚(yú)片22 min，減菌率可達(dá)到81.59%，本實(shí)驗(yàn)減菌率與其相似。

5 種減菌劑的減菌率達(dá)到80%的條件分別為1 500 mg/L H2O2溶液浸泡8 min；200 mg/L ClO2溶液浸泡10 min；200 mg/L NaClO溶液浸泡10 min；9 mg/L臭氧水浸泡10 min；30 mg/L微酸性電解水浸泡20 min。在此條件下減菌能力穩(wěn)定，能保持菌落總數(shù)的相對(duì)穩(wěn)定，可進(jìn)一步研究減菌處理當(dāng)天對(duì)魚(yú)片質(zhì)構(gòu)、色澤和肌肉蛋白質(zhì)的影響。

2.2 不同減菌處理對(duì)鮮羅非魚(yú)片質(zhì)構(gòu)的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，處理組的硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠著性和咀嚼性都顯著增加（P＜0.05），其中對(duì)質(zhì)構(gòu)特性影響最關(guān)鍵的指標(biāo)：硬度變化最明顯，變化幅度由大到小依次是NaClO溶液＞ClO2溶液＞臭氧水＞微酸性電解水＞H2O2溶液，原因可能是減菌處理使MP氧化，魚(yú)肉表面的蛋白質(zhì)變性失水，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生交聯(lián)聚集，造成咀嚼性和硬度的增加；各實(shí)驗(yàn)組浸泡時(shí)間并不相同，浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)質(zhì)構(gòu)影響較大，于福田[30]研究發(fā)現(xiàn)微酸性電解水浸泡羅非魚(yú)片20 min內(nèi)，硬度變化不明顯，超過(guò)20 min，硬度開(kāi)始下降明顯。趙永強(qiáng)[8]、顏明月[31]研究表明臭氧水處理羅非魚(yú)片的硬度均高于對(duì)照組。劉慧[32]研究表明使用微酸性電解水處理羅非魚(yú)片當(dāng)天魚(yú)肉硬度增大，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，其他指標(biāo)稍有上升，但是變化幅度較小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用減菌劑處理魚(yú)肉會(huì)導(dǎo)致魚(yú)肉在處理當(dāng)天硬度上升。

表2 不同減菌條件對(duì)羅非魚(yú)片質(zhì)構(gòu)的影響Table 2 Effects of different decontaminants on the texture of tilapia fillets

2.3 不同減菌處理對(duì)鮮羅非魚(yú)片色澤的影響

2.3.1 對(duì)白肉色澤的影響

如表3所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)減菌處理后魚(yú)片白肉的L*值和b*值增大、a*值下降，其中L*值變化最顯著（P＜0.05），這說(shuō)明減菌劑處理存在漂白情況。L*值變化幅度由大到小依次為微酸性電解水溶液＞ClO2溶液＞臭氧水＞NaClO溶液＞H2O2溶液，原因可能是氧化型減菌劑能夠氧化發(fā)色團(tuán)，生成不含發(fā)色團(tuán)或者不吸收可見(jiàn)光的發(fā)色團(tuán)的物質(zhì)[33]；各實(shí)驗(yàn)組浸泡時(shí)間并不相同，浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)色澤影響較大，微酸性電解水浸泡20 min，漂白效果最明顯，L*值最高。楊運(yùn)懿[34]用雙氧水浸泡白鰱魚(yú)糜能夠提高凝膠的白度；鐘智豪[7]在研究草魚(yú)減菌過(guò)程中發(fā)現(xiàn)臭氧組和二氧化氯組白度優(yōu)于對(duì)照組；劉慧[32]在研究微酸性電解水對(duì)草魚(yú)殺菌效果的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，處理組的白度值顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相似。

表3 不同減菌條件對(duì)羅非魚(yú)片白肉色澤的影響Table 3 Effects of different decontaminants on the color of white meat in tilapia fillets

2.3.2 對(duì)紅肉色澤的影響

如表4所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)減菌處理后脊部紅肉魚(yú)片的L*值增大，a*和b*值下降，其a*值變化最顯著（P＜0.05），變化幅度由大到小依次為臭氧水＞ClO2溶液＞NaClO溶液＞微酸性電解水＞H2O2溶液，主要原因是ClO2溶液、NaClO溶液以及微酸性電解水中的氯不穩(wěn)定，容易得到2 個(gè)電子變成-1價(jià)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；臭氧水、H2O2溶液分解釋放出氧，具有較強(qiáng)的氧化性，增加了魚(yú)肉表面的氧分壓，使肌紅蛋白、血紅蛋白以及其他一些呈色蛋白變性，生成其他衍生物，改變魚(yú)肉色澤[34-35]。李杉等[36]采用幾種減菌劑對(duì)羅非魚(yú)背部主脊部位進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)a*值都有不同程度的下降。李蓓蓓等[37]研究表明ClO2處理鱸魚(yú)魚(yú)肉和魚(yú)鰓a*值均下降，王萍等[10]研究表明使用多種減菌劑處理后軍曹魚(yú)片的a*值均低于對(duì)照組，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

表4 不同減菌條件對(duì)羅非魚(yú)片紅肉色澤的影響Table 4 Effects of different decontaminants on the color of red meat in tilapia fillets

2.4 可溶性MP含量、羰基、巰基、疏水性的變化

由表5可知，羅非魚(yú)肉經(jīng)減菌處理后MP和總巰基含量下降，表面疏水性和羰基含量上升。與對(duì)照組對(duì)比，處理組的MP質(zhì)量濃度變化明顯（P＜0.05），可能是氧化作用導(dǎo)致組織微觀結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白。MP質(zhì)量濃度從大到小依次為對(duì)照組＞H2O2溶液＞臭氧水＞ClO2溶液＞NaClO溶液＞微酸性電解水溶液，可以看出羅非魚(yú)肉在30 mg/mL微酸性電解水處理20 min時(shí)，MP質(zhì)量濃度變化最明顯，與對(duì)照組相比下降了12.8%。

表5 不同減菌條件對(duì)羅非魚(yú)片MP含量、羰基、巰基、疏水性的影響Table 5 Effects of different detontaminants on MP content and carbonyl and sulfhydryl group contents and hydrophobicity of MP in tilapia fillets

蛋白質(zhì)的部分側(cè)鏈氨基酸易氧化成羰基衍生物，因此，羰基含量可作為衡量蛋白質(zhì)氧化程度的敏感指標(biāo)[38]。減菌處理組與對(duì)照組相比，羅非魚(yú)片MP羰基含量顯著增加（P＜0.05），羰基含量從大到小依次為NaClO溶液＞微酸性電解水溶液＞H2O2溶液＞臭氧水＞ClO2溶液＞對(duì)照組。這可能是減菌劑氧化攻擊蛋白質(zhì)，形成新的以碳為中心的自由基，引發(fā)蛋白質(zhì)自由基鏈反應(yīng)，產(chǎn)生了大量的羰基[39]。

巰基是魚(yú)肉蛋白中最具活性的功能基團(tuán)。蛋白質(zhì)氧化可使巰基轉(zhuǎn)化成二硫鍵，故巰基含量可以反映蛋白質(zhì)氧化程度[40]。減菌處理對(duì)羅非魚(yú)肉蛋白的巰基有顯著影響（P＜0.05），減菌劑處理組總巰基含量低于空白對(duì)照組，總巰基含量從大到小依次為對(duì)照組＞ClO2溶液＞臭氧水＞H2O2溶液＞NaClO溶液＞微酸性電解水溶液。原因可能是減菌處理后游離巰基被氧化，導(dǎo)致游離巰基含量降低；也可能是氧化導(dǎo)致蛋白聚集體的形成，部分巰基被覆蓋，檢測(cè)到的游離巰基數(shù)量減少[41]。

蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致肽鏈斷裂，氨基酸疏水基團(tuán)暴露，表面疏水性與氧化程度成正比[42]，因此疏水性可以反映蛋白質(zhì)氧化程度。減菌處理對(duì)羅非魚(yú)肉蛋白的疏水性有顯著影響（P＜0.05），疏水性從大到小依次為NaClO溶液＞微酸性電解水溶液＞臭氧水＞ClO2溶液＞H2O2溶液＞對(duì)照組。這可能是部分氨基酸的結(jié)構(gòu)在減菌劑處理過(guò)程中被氧化，疏水性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面，加快溴酚藍(lán)與蛋白質(zhì)的結(jié)合，使表面疏水性增加[43-44]。

2.5 內(nèi)源熒光光譜分析

內(nèi)源熒光光譜通過(guò)反映蛋白質(zhì)中色氨酸等熒光基團(tuán)的氧化程度及所處環(huán)境的變化，以表征氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的影響[45]。如圖4所示，295 nm激發(fā)波長(zhǎng)下MP在334 nm波長(zhǎng)處具有最高的熒光強(qiáng)度，不同減菌處理后的蛋白熒光強(qiáng)度有不同程度的降低，與初始值相比，臭氧水、H2O2溶液、ClO2溶液、NaClO溶液、微酸性電解水處理組熒光強(qiáng)度比初始值分別下降了8.54%、13.37%、14.61%、19.44%、34.76%。強(qiáng)度下降原因是魚(yú)肉在減菌處理中MP結(jié)構(gòu)因氧化作用逐漸展開(kāi)，側(cè)鏈熒光氨基酸的氧化暴露[16]。最大熒光位置出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，說(shuō)明減菌處理后被包埋的色氨酸殘基處在更加極性的環(huán)境[46]，蛋白內(nèi)部疏水性氨基酸暴露在表面，疏水性增加，與上述疏水性結(jié)論一致。

圖4 不同減菌處理對(duì)羅非魚(yú)片MP熒光光譜的影響Fig.4 Effects of different decontaminant treatments on the fluorescence spectrum of MP in tilapia fillets

2.6 圓二色光譜分析

由圖5可知，MP在208 nm和222 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)峰，是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[47]，摩爾橢圓度的絕對(duì)值與α-螺旋含量呈正比。與對(duì)照組相比，減菌處理后MP的橢圓度絕對(duì)值明顯減小，尤其是微酸性電解水處理的變化最明顯，表明α-螺旋含量最低。如圖6所示，處理組MP二級(jí)結(jié)構(gòu)性能均有所下降，α-螺旋相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)，β-折疊相對(duì)含量呈上升趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量略有下降，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量略有增加，與對(duì)照組相比，臭氧水、H2O2溶液、ClO2溶液、NaClO溶液、微酸性電解水處理組α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量比初始值分別下降了4.74%、6.84%、7.89%、11.58%、16.84%。這說(shuō)明氧化對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，α-螺旋轉(zhuǎn)化成的β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)從有序向無(wú)序轉(zhuǎn)變[48]。

圖6 不同減菌處理對(duì)羅非魚(yú)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig 6 Effects of different decontaminant treatments on the secondary structure of MP in tilapia fillets

2.7 SDS-PAGE分析

MP中包含肌球蛋白重鏈（200、100 kDa）、肌動(dòng)蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（35 kDa）以及肌球蛋白輕鏈（16～25 kDa）等成分[49]。羅非魚(yú)片經(jīng)過(guò)不同氧化型減菌劑處理后，MP的降解情況如圖7所示，經(jīng)過(guò)NaClO溶液、臭氧水和微酸性電解水減菌處理后，肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈都發(fā)生了不同程度的降解，其中微酸性電解水處理組蛋白條帶變化最明顯，這可能是氧化作用導(dǎo)致肽鏈斷裂，蛋白質(zhì)降解和其他小分子化合物降解[50]。H2O2處理組和ClO2處理組的肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白條帶強(qiáng)度增強(qiáng)，這可能是減菌處理產(chǎn)生的氧化條件導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)改變，蛋白質(zhì)可能發(fā)生交聯(lián)，產(chǎn)生高分子質(zhì)量化合物，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集[51]。

圖7 不同減菌處理下羅非魚(yú)片MP的SDS-PAGE圖譜Fig.7 SDS-PAGE profiles of MP in tilapia fillets subjected to different decontaminant treatments

3 結(jié)論

本研究對(duì)比了5 種氧化型減菌劑對(duì)羅非魚(yú)片的減菌效果，減菌率達(dá)80%的減菌條件為：1 500 mg/L H2O2溶液浸泡8 min，減菌率達(dá)到80.1%；200 mg/L ClO2溶液浸泡10 min，減菌率達(dá)到81.3%；200 mg/L NaClO溶液浸泡10 min，減菌率達(dá)到80.9%；9 mg/L臭氧水浸泡10 min，減菌率達(dá)到81.7%；30 mg/L微酸性電解水浸泡20 min，減菌率達(dá)到80.21%。在此條件下對(duì)色澤、質(zhì)構(gòu)特性、蛋白氧化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，氧化型減菌處理后魚(yú)肉MP發(fā)生不同程度的氧化，魚(yú)片硬度增大；L*值增大，a*值減?。籑P質(zhì)量濃度、總巰基含量均下降，羰基含量升高，表面疏水性基團(tuán)數(shù)量增加；α-螺旋轉(zhuǎn)化更為舒展的β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；熒光氨基酸氧化和暴露，MP發(fā)生不同程度的降解。在減菌率都達(dá)到80%的條件下，5 種減菌劑的氧化能力中微酸性電解水最強(qiáng)，其次是NaClO溶液。蛋白結(jié)構(gòu)和功能性的改變會(huì)嚴(yán)重影響?hù)~(yú)類(lèi)制品的品質(zhì)特性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和加工性能，工廠通常采用減菌劑殺菌后封裝保存，殘留的氧化型減菌劑會(huì)造成持續(xù)性氧化，因此，從提升產(chǎn)品品質(zhì)上考慮，未來(lái)可尋找合適的抗氧化劑減輕后續(xù)氧化型減菌劑對(duì)魚(yú)肉蛋白產(chǎn)生的影響。