灘羊肉成熟過程中糖酵解與保水性之間的關系

王金霞，劉吉娟，羅瑞明，李 榮，陳雪妍，張 倩，胡麗筠

（寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏 銀川 750000）

灘羊是廣泛分布于寧夏、甘肅、陜西等地的區(qū)域性優(yōu)質品種家畜，其肉質細嫩、無膻味、營養(yǎng)豐富、脂肪分布均勻，備受消費者喜愛，具有重要的經濟及食用價值。目前，關于灘羊肉的研究主要集中于通過宰前控制對灘羊肉品質形成進行影響[1-2]以及通過控制宰后因素對灘羊肉品質進行影響。

當外力作用于肉制品肌肉時，仍可以保持水分和補充水分的能力稱為肉的保水性[3]。目前，關于宰后肉品保水性影響的研究主要集中于：AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK）活性變化影響糖酵解相關酶活性，從而影響肉品的保水性；不同的貯藏、解凍方式造成肌原纖維解離，從而影響肉品的保水性；宰后胴體關鍵結構骨架蛋白質的氧化、變性、降解引起肌纖維結構發(fā)生斷裂、損傷、肌原纖維小片化等，進而導致肉的保水性下降。朱立賢等[4]研究了宰后牛背最長肌AMPK活性、保水性和糖酵解經不同的溫度處理后的變化情況，結果發(fā)現(xiàn)AMPK通過調控丙酮酸激酶活性調節(jié)糖酵解的速率，導致貯藏損失發(fā)生改變，最終影響肉品的持水力。李天翔等[5]研究了4 種解凍方式下鰹魚魚肉蛋白質和組胺的含量變化，結果表明冷藏庫解凍較好地保持了肌原纖維蛋白的結構和功能特性，肉品保水性較好。以上研究結果表明，動物屠宰后肌肉所發(fā)生的生化變化對保水性具有重要影響。

灘羊屠宰后機體內氧氣供應中斷，組織主要依靠糖酵解途徑維持機體的正常生命活動，當糖酵解相關酶失活或肌糖原耗盡時，糖酵解進程則會受到阻礙，從而無法正常進行。因此，糖酵解對肉品質變化有重要影響。本實驗以灘羊背最長肌為研究對象，通過測定其在4 ℃成熟8 d過程中糖酵解的變化對保水性的影響，并對其進行相關性分析，以期闡明灘羊肉成熟過程中糖酵解程度與保水性的關系，為后續(xù)揭示糖酵解調控保水性的機制奠定基礎，并為冷卻灘羊肉貯藏期間肉品質量控制技術研發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用灘羊背最長肌取自寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司，選取胴體質量相近的6 月齡公灘羊9 只，宰前遵循動物管理規(guī)定，屠宰后立即用滅菌刀取下右側背最長肌，剔除可見脂肪與結締組織后，置于聚乙稀薄膜內，用錫紙包裝后置于帶有編號的保鮮袋中，貯存在4 ℃條件下，在成熟0、1、2、3、4、8 d時分別檢測相應指標。

磷酸氫二鈉、氯化鎂、乙二胺四乙酸、氯化鉀（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）北京索萊寶科技有限公司；鈣蛋白酶-1、ATP、葡萄糖、糖原、乳酸、乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶酶聯(lián)免疫吸附測定試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SJ-3F便攜式pH計 上海德圖儀器國際貿易有限公司；TG16W型離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DZKW-C型電子恒溫水浴鍋 滄州新三思試驗儀器有限公司；352型酶標儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；NM120低場脈沖核磁共振分析儀蘇州（上海）紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集0、1、2、3、4、8 d的樣品各200 g，用于測定pH值、滴水損失率及貯藏損失率；采集不同成熟期間的樣品各20 g，迅速置于液氮中放置2 h后轉移至-80 ℃冰箱中保存，用于其他指標測定。

1.3.2 pH值測定

剔除樣品可見脂肪與結締組織，使用便攜式pH計測定成熟期間肌肉pH值。

1.3.3 保水性指標測定

1.3.3.1 滴水損失率

參照左惠心[6]的方法并略作修改。將約50 g的樣品準確稱質量，記為m1，用繩子懸掛在密閉自封袋中，確保樣品與自封袋不接觸，置于4 ℃冰箱中，待成熟0、1、2、3、4、8 d后取出，用濾紙擦干表面水分后稱質量，記為m2。滴水損失率按式（1）計算：

1.3.3.2 貯藏損失率

參照Cardoso等[7]的方法并略作修改。將約50 g的樣品準確稱質量，記為m3，裝入自封袋中密閉，置于4 ℃的冰箱中貯藏，待成熟0、1、2、3、4、8 d后取出，用濾紙擦干表面水分后稱質量，記為m4。貯藏損失率按式（2）計算：

1.3.3.3 離心損失率

參考Zhang等[8]的方法并稍作修改。將成熟0、1、2、3、4、8 d樣品分別切成4 cm×1 cm×0.5 cm的長條形，準確稱質量，記為m5，置于10 mL離心管中于4 ℃、4 000×g離心15 min，將離心管中的樣品倒出并用濾紙擦干表面水分，稱質量并記為m6。離心損失率按式（3）計算：

1.3.3.4 水分分布測定

參考孫文彬等[9]的方法并略作修改。設置儀器溫度為32 ℃，預熱30 min后使用。測定前使用標樣的自由感應衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）進行校準，F(xiàn)ID的參數為SF＝18、TW＝1 000、NS＝1、SW＝100、DRG1＝2、RFD＝0.05、TD＝1 024、RG1＝20。將樣品沿肌纖維方向切割成1 cm×1 cm×2 cm的肉條，稱質量后放入核磁共振測定專用試管底部進行測定，樣品測定所用CPMG的參數為SF＝18、SW＝200、TW＝3 000、TE＝0.251、NECH＝5 000、NS＝8、P2＝33、DRG1＝3、RFD＝0.2、RG1＝20。

1.3.4 鈣蛋白酶-1活性測定

取適量肌肉于預冷后的PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）中清洗去除血液，稱取1 g樣品剪碎后，加入10 倍體積PBS（0.01 mol/L、pH 7.4），置于勻漿器中，在0 ℃、65 Hz條件下勻漿60 s。將所得液體5 000×g離心10 min，取其上清液進行檢測。鈣蛋白酶-1活性測定按照鈣蛋白酶-1 ELISA檢測試劑盒的要求進行，使用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度。

1.3.5 肌原纖維小片化指數（myofibril fragmentation index，MFI）測定

參考Ilian等[10]的方法并略作修改。取稱取0.5 g樣品，加入10 倍體積的緩沖液（0.02 mol/L磷酸氫二鈉、0.001 mol/L氯化鎂、乙二胺四乙酸0.001 mol/L、0.1 mol/L氯化鉀，pH 7.1），在0 ℃、65 Hz條件下勻漿30 s，4 ℃、3 000×g離心15 min，倒掉上清液，取沉淀重復上述操作1 次。向最終沉淀中加入5 mL上述緩沖液重懸3 min，懸濁液用200 目尼龍篩網過濾，得到肌原纖維蛋白溶液。用BCA法在540 nm波長處測定肌原纖維蛋白吸光度，將得到的數值乘以200即為MFI。

1.3.6 糖酵解指標測定

樣品處理同1.3.4節(jié)，實驗操作按照ATP、葡萄糖、糖原、乳酸、乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶ELISA檢測試劑盒的要求進行，使用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 宰后灘羊成熟期間pH值變化

糖酵解可以產生丙酮酸和ATP，ATP發(fā)生水解生成H＋，隨著糖酵解的進行H＋大量堆積，導致肌肉pH值下降，因此，宰后肌肉的糖酵解水平可以決定肉的pH值。由圖1可知，宰后0～4 d pH值顯著降低（P＜0.05），并在4 d時降至最低（5.63），4 d后pH值顯著升高（P＜0.05），并于8 d時升高至5.75。Tao Yingmei[11]及姬琛[12]等的研究表明，宰后成熟期間灘羊pH值變化范圍為5.4～6.3，本實驗研究結果符合這一規(guī)律。宰后成熟期間，肌肉pH值的變化顯著影響機體內代謝酶的活性，對于肉品的色澤、保水性、嫩度和風味前體物質等具有重要影響[13]。宰后成熟早期，AMPK活性的升高導致糖酵解相關酶活性發(fā)生改變，促進了糖酵解代謝進程，而機體產生的乳酸無法通過三羧酸循環(huán)系統(tǒng)排出體外，只能堆積在肌肉組織中，所以導致肌肉pH值的下降[14]。宰后成熟后期，機體進行一系列分解代謝，逐漸消耗了堆積在肌肉組織中的酸性物質，因此肌肉pH值開始上升[15]。

圖1 宰后灘羊成熟期間pH值的變化Fig.1 Changes in pH of Tan sheep meat during postmortem aging

劉秋鳳等[16]的研究表明，pH值的下降一方面影響肌原纖維蛋白降解酶活性，另一方面還影響蛋白質與水分的結合度，當pH值達到蛋白質的等電點時，蛋白質發(fā)生變性，肌纖維空間結構逐漸減小，導致不易流動水轉化為自由水并流失，引起灘羊肉保水性下降；當pH值偏離蛋白質等電點時，造成肌動球蛋白解離，肌原纖維空間結構逐漸擴大，細胞外的水分重新滲入，引起灘羊肉保水性上升[17]。因此，宰后成熟過程中肌肉pH值通過改變蛋白質等電點引起肌原纖維空間結構發(fā)生變化，進而對保水性產生重要的影響。

2.2 宰后灘羊成熟期間保水性指標變化

由圖2可知，隨成熟時間的延長，灘羊背最長肌的滴水損失率、貯藏損失率及離心損失率均呈先增大后減小的趨勢（P＜0.05），并在4 d時達到最大值，分別為7.42%、5.14%與5.24%。左惠心[6]以牦牛背最長肌為研究對象，探究了成熟過程中的高保水性組和低保水性組滴水損失情況，結果發(fā)現(xiàn)高、低保水性組滴水損失均呈先上升后下降的趨勢。?？颂m[18]以牦牛背最長肌為研究對象，探究了冷鮮牦牛肉貯藏損失情況，結果表明宰后成熟期間貯藏損失呈先增大后減小趨勢。馬旭華[19]以秦川牛背最長肌為研究對象，探究了成熟期間離心損失的變化規(guī)律，結果發(fā)現(xiàn)隨著成熟時間的延長離心損失率呈先增大后減小的趨勢。本研究結果與以上研究結果相符。

圖2 宰后灘羊成熟期間保水性指標的變化Fig.2 Changes in water retention indexes of Tan sheep meat during postmortem aging

滴水損失、貯藏損失與離心損失越高，肉的保水性越差。肌肉中的水分主要有3 種存在形式，即自由水、結合水、不易流動水。宰后成熟初期，鈣蛋白酶的水解作用導致肌肉組織結構的完整性遭到破壞[20]，存在于細胞間隙的自由水在重力作用下流失。隨成熟時間的延長，pH值的下降、肌原纖維蛋白的解離以及肌細胞的收縮，導致肌原纖維與肌原纖維之間、肌原纖維和肌膜之間形成滴水通道，引起不易流動水向自由水轉換，并在重力作用下造成滴水、貯藏及離心損失的升高，最終導致宰后成熟期間灘羊肉保水性變差[12]。宰后成熟后期肌肉解僵成熟，大多數自由水和不易流動水均已損失，pH值偏離蛋白質的等電點，導致蛋白質對水的吸附能力增強，引起細胞外的水分重新滲入組織內，滴水損失貯藏損失和離心損失逐漸減少。

2.3 宰后灘羊成熟期間水分分布的變化

宰后灘羊肉成熟過程中的橫向弛豫時間分布如圖3所示，不同成熟時間灘羊肉的橫向弛豫時間T2圖譜中均出現(xiàn)3 個特征峰，在0.1～10 ms（T21）范圍內出現(xiàn)第1個峰，在10～100 ms（T22）范圍內出現(xiàn)最大峰，在100～1 000 ms（T23）出現(xiàn)第3個峰，此峰的弛豫時間最長。各峰所占的峰面積、峰比例均不同，其中T22占據的峰面積最大、峰比例最高，可以反映出灘羊肉中存在不同狀態(tài)的水，且水分大多以不易流動水的形式存在。

圖3 宰后灘羊成熟期間橫向弛豫時間分布圖Fig.3 T2 distribution of Tan sheep meat during postmortem aging

宰后灘羊肉成熟過程中弛豫時間T2的變化如圖4所示，隨成熟時間延長，橫向弛豫時間T21總體無明顯變化，這可能是因為結合水緊密地附著在蛋白質等大分子的極性基團上，并不隨成熟過程流失[21]。T22總體呈顯著下降趨勢（P＜0.05），這可能是因為隨成熟時間延長，肌纖維的結構被破壞，肌肉不斷收縮產生壓力，在壓力的作用下，肌肉中自由度較高的不易流動水逐漸流失，而自由度較低的不易流動水仍被束縛在肌原纖維中[22]。T23總體呈顯著下降趨勢（P＜0.05），這是由于自由水在成熟期間最先流失。

圖4 宰后灘羊成熟期間橫向弛豫時間T2的變化Fig.4 Changes in transverse relaxation time T2 of Tan sheep meat during postmortem aging

2.4 宰后灘羊成熟期間鈣蛋白酶-1活性的變化

由圖5可知，灘羊在宰后成熟過程中，鈣蛋白酶-1活性呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢（P＜0.05），這與杜曼婷等[23]的研究結果一致。灘羊宰后鈣蛋白酶-1活性隨成熟時間延長而下降，說明鈣蛋白酶-1的活性結構在成熟過程中逐漸喪失。這可能是因為宰后成熟過程中，機體內主要進行糖酵解反應，pH值的快速下降導致鈣蛋白酶-1自溶后激活其活性，催化肌原纖維蛋白降解[24]。鈣蛋白酶-1為水解肌原纖維的蛋白質，大量研究表明鈣蛋白酶-1參與肌原纖維裝配過程。Huff-Lonergan等[25]研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶系統(tǒng)會引起肌纖維蛋白不斷降解，造成肌原纖維小片化，導致細胞纖維之間形成滴水損失通道，引起大部分不易流動水轉換為自由水，在重力作用下不斷流失，最終對灘羊肉的保水性造成影響。

圖5 宰后灘羊成熟期間鈣蛋白酶-1活性的變化Fig.5 Changes in calpain-1 activity of Tan sheep meat during postmortem aging

2.5 宰后灘羊成熟期間MFI的變化

由圖6可知，MFI在宰后0～4 d內迅速從111.93上升至165.93（P＜0.05），但宰后4～8 d灘羊的MFI隨成熟時間的延長并未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。這可能是因為宰后成熟初期鈣蛋白酶-1的水解作用導致肌肉組織Z線結構崩塌、肌鈣蛋白T消失、肌動蛋白和結蛋白降解，進而造成肌原纖維小片化[26]，成熟后期由于鈣蛋白酶活性持續(xù)下降、不斷降解，肌肉組織結構不再發(fā)生改變，因此MFI并未發(fā)生顯著變化。Delgado[27]和Veiseth[28]等的研究結果均表明羊肉的MFI上升主要發(fā)生在宰后初期，之后的上升速率和幅度并不明顯，這與本實驗研究結果相似。灘羊超過90%的MFI增加量發(fā)生在宰后成熟的4 d內，即0～4 d內灘羊肌纖維蛋白降解程度較高，肌纖維結構遭到嚴重破壞，導致細胞纖維之間形成滴水損失通道，引起大部分不易流動水轉換為自由水，在重力作用下不斷流失，最終對灘羊肉的保水性造成影響。

圖6 宰后灘羊成熟期間MFI的變化Fig.6 Changes in MFI of Tan sheep meat during postmortem aging

2.6 宰后灘羊成熟期間糖酵解指標變化

糖酵解是宰后肌肉細胞能量的主要來源。由圖7A可知，宰后0～8 d灘羊背最長肌中ATP含量顯著下降（P＜0.05）。這可能是因為灘羊宰后成熟期間為保證細胞各項生命活動正常進行，ATP被快速消耗，雖然ATP和ADP時刻不停地發(fā)生相互轉化，但這僅能緩解短期內的能量缺乏[29]，糖酵解可以產生丙酮酸和ATP，但ATP發(fā)生水解可以生成H＋，糖酵解的不斷進行會導致H＋大量堆積，最終導致肌肉pH值下降[30]。因此，ATP水平在宰后成熟期間呈持續(xù)降低趨勢。如圖7B所示，隨著成熟時間的延長糖原含量呈持續(xù)下降趨勢（P＜0.05），這是因為灘羊宰后機體內氧氣供應中斷，主要依靠糖酵解途徑分解糖原提供機體所需能量，本實驗研究結果與田甲春等[31]的研究結果一致。如圖7C所示，宰后0～4 d葡萄糖含量顯著升高（P＜0.05），并在4 d時達到最高（209.19 pg/mL），肌肉組織在宰后初期通過糖酵解將糖原轉化為葡萄糖以維持能量供應。宰后4～8 d葡萄糖含量顯著下降（P＜0.05），這是因為機體宰后受缺氧、缺血的刺激，加快了糖酵解進程，導致糖原含量不足，為維持組織內能量供應，進一步消耗了組織中有限的能源物質葡萄糖。本實驗中灘羊背最長肌葡萄糖含量變化規(guī)律與Bai Yuqiang等[32]的研究結果一致。如圖7D、E所示，宰后成熟期間，乳酸含量呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），3 d時乳酸濃度達到最大，為11.89 μmol/mL；丙酮酸激酶活性呈顯著下降的趨勢（P＜0.05），在8 d時降至最低，為0 d時的58%，這與高永芳等[33]的研究結果相似。丙酮酸可以在乳酸脫氫酶的催化下進一步生成乳酸，最終造成乳酸的積累，成熟后期，糖酵解速率由于能源物質供應不足而逐漸減緩，導致乳酸含量開始不斷下降[34]。如圖7F所示，宰成熟期間乳酸脫氫酶活性呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），這可能是因為宰后初期AMPK活性的升高，提高了糖酵解過程中乳酸脫氫酶的活性，成熟后期pH值的下降則抑制了乳酸脫氫酶的活性，這與李澤[35]的研究結果一致。乳酸生成的過程可將還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）再生為NAD＋，NAD＋可進一步被還原為NADH。該過程是糖酵解過程中唯一的氧化反應，而糖酵解的維持需要糖原和NAD＋的再生[36]。因此，糖原含量、乳酸含量可以反映宰后肌肉糖酵解的程度，影響肉質性狀。

圖7 宰后灘羊成熟期間糖酵解指標的變化Fig.7 Changes in glycolytic indexes of Tan sheep meat during postmortem aging

2.7 宰后灘羊成熟期間糖酵解程度與保水性的相關性分析

通過Pearson法算出糖酵解與保水性的相關性系數，如圖8所示，pH值與滴水損失呈極顯著負相關（P＜0.01），與貯藏損失、離心損失呈顯著負相關（P＜0.05），而與T22、T23均呈顯著正相關（P＜0.05）；AT P 含量與滴水損失、離心損失呈顯著負相關（P＜0.05），與貯藏損失呈極顯著負相關（P＜0.01），與T21、T22、T23均呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01）；糖原與滴水損失呈顯著負相關（P＜0.05），與貯藏損失、離心損失呈極顯著負相關（P＜0.01），與T21、T22、T23均呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01）；乳酸含量與滴水損失呈高度顯著正相關（P＜0.001），與貯藏損失、離心損失呈極顯著正相關（P＜0.01），而與T21、T22、T23均無相關性；T23與滴水損失、貯藏損失和離心損失均呈顯著負相關（P＜0.05）。

圖8 宰后灘羊成熟期間糖酵解程度與保水性的相關性Fig.8 Correlation between glycolysis and water-holding capacity of Tan sheep meat during postmortem aging

相關性分析結果表明，灘羊肉宰后成熟過程中ATP含量的迅速降低可能加快了糖酵解進程，從而促進了糖原的消耗，引起乳酸的蓄積并降低肌肉pH值，導致蛋白質對水的吸附能力降低，同時，肌肉pH值的降低使鈣蛋白酶-1活力持續(xù)下降，促使肌原纖維不斷收縮，使不易流動水向自由水轉化，導致肌肉中的水分在重力作用下不斷流失，引起灘羊肉滴水損失率、貯藏損失率與離心損失率升高。綜上所述，灘羊宰后糖酵解可能通過影響結構蛋白對水分吸附、酶的活性及水分狀態(tài)的轉化從而影響保水性。

3 結論

灘羊肉4 ℃成熟過程中，其背最長肌的滴水損失、貯藏損失呈先增大后減小的趨勢；ATP、糖原含量持續(xù)下降；葡萄糖、乳酸含量呈上升后下降趨勢；乳酸脫氫酶活性呈先增大后減小的趨勢；丙酮酸激酶活性呈持續(xù)下降趨勢。灘羊肉宰后糖酵解過程迅速被激活，為保證細胞各項生命活動正常進行，能量物質被快速消耗，引起糖酵解過程中的相關酶活性及代謝物含量發(fā)生改變，從而導致H＋的不斷蓄積，使得肌肉pH值發(fā)生改變，一方面，肌肉pH值的降低使鈣蛋白酶-1活力持續(xù)下降，使得細胞纖維之間形成滴水損失通道，肌肉中的水分在重力作用下通過滴水損失通道不斷流失，引起灘羊肉滴水損失率、貯藏損失率與離心損失率發(fā)生改變。另一方面肌肉pH值的變化使得蛋白質對水的吸附能力不斷發(fā)生改變，最終影響宰后灘羊肉的保水性。