生物鐘基因Bmal1、Per2在血液腫瘤細胞株Raji、Hut-78、OCI-LY8及HL-60中的晝夜表達規(guī)律

張永卓 王 叨 劉煒青 劉玉峰 李 白 蘇淑芳

在生命過程中,從分子、細胞到機體、群體各個層次上的活動都有顯著的生物節(jié)律現(xiàn)象,并受控于生物鐘基因[1]。生物鐘基因調控生物節(jié)律的機制及其相關疾病的研究已成為當前生物醫(yī)學的新興領域和研究熱點[2]。Bmal1和Per2是生物鐘體系的核心鐘基因,現(xiàn)已研究證實Bmal1[3]和Per2[4]在多種腫瘤細胞內呈現(xiàn)節(jié)律性表達,二者在體外環(huán)境下培養(yǎng)的血液腫瘤細胞內表達節(jié)律如何,相關的研究報道鮮見。本研究以淋巴系及髓系白血病細胞株,即人伯基特淋巴瘤Raji細胞株,人皮膚T細胞淋巴瘤Hut-78細胞株,彌漫大B細胞淋巴瘤OCI-LY8細胞株,髓系白血病HL-60細胞株等為研究對象,通過RT-PCR法對生物鐘基因Bmal1和Per2 mRNA進行實時定量檢測,觀察其在血液腫瘤細胞中是否存在晝夜節(jié)律波動,為根據血液腫瘤細胞自身生物節(jié)律采取時辰療法強化療效提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Raji細胞、Hut-78細胞、OCI-LY8細胞由鄭州大學第一附屬醫(yī)院張毅教授惠贈,HL-60細胞由鄭州大學第一附屬醫(yī)院岳保紅教授惠贈;1640培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司);精制胎牛血清(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);TRIZOL(上海生工生物工程有限公司);RNA逆轉錄試劑盒(美國Omega公司);熒光定量PCR試劑盒(美國Omega公司);核酸分析儀、Realtime PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與節(jié)律誘導 參照Hiroaki Taniguchi的血清休克方法誘導細胞生物節(jié)律[5]。4種細胞系分別接種于含10%胎牛血清的RIPA1640培養(yǎng)基,并在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),間隔2～3天換液。細胞生長穩(wěn)定時(對數(shù)期內)更換含0.5%胎牛血清的RIPA1640培養(yǎng)基進行饑餓培養(yǎng)2天,饑餓培養(yǎng)后更換培養(yǎng)基為50%胎牛血清的PIRA1640培養(yǎng)基培養(yǎng)進行血清休克誘導同步節(jié)律的產生,并將此時刻記為ZT0,2小時后更換無血清培養(yǎng)基。按照時間順序,將ZT0時刻后4小時計為ZT4,8小時后計為ZT8,以此類推。

1.2.2 目的基因及內參引物 從NCBI數(shù)據庫中查找人Bmal1、Per2的DNA序列,應用Premier 5.0軟件設計引物,由上海生工生物工程有限公司合成引物序列。設計如下:Bmal1:上游5'-ACTGTGCTAAGGATGGCTGTTC、下游5'-TGGTTTGTAGTTTGCTTCTGTG;Per2:上游5'-AACTGCCCCTGGACTAAGAAAT、下游5'-GTTTGACCCGCTTGGACTT;內參β-actin:上游5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG、下游5'-ACTGTGCTAAGGATGGCTGTTC。

1.2.3 總RNA的提取 參照Trizol試劑盒說明操作,在ZT(0、4、8、12、16、20、24)時間點分別提取各細胞株的總RNA,紫外分光光度計在A260 nm、A280 nm處測定RNA濃度及純度,-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 RT-PCR擴增反應 參照RNA逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄,獲取cDNA,進行PCR擴增。PCR反應條件: 96 ℃ 2 min,95 ℃變性3 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán),60 ℃延伸5 min。反應結束后,由PE 5700軟件分析結果,自動計算定量數(shù)值。將目的基因的Ct值與內參基因Ct值的差值△Ct反映各基因mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 生物鐘基因Bmal1、Per2在不同時間點的轉錄水平

血清休克法節(jié)律誘導后,24小時內不同時間點檢測到Bmal1 mRNA在OCI-LY8、Hut-78、HL-60細胞株中轉錄水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而在Raji細胞中的轉錄差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Per2 mRNA在Raji、OCI-LY8、Hut-78、HL-60細胞株中24小時內不同時間點的轉錄水平均存在差異,且均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1、表2。

表1 Bmal1 mRNA在血液腫瘤細胞中各時間點的轉錄水平變化

表2 Per2 mRNA在血液腫瘤細胞株中各時間點的轉錄水平變化

2.2 應用余弦分析軟件及CronoLab軟件進行余弦方程擬合

對目的基因mRNA表達具有明顯差異的組別,分別以時間(h)為橫坐標,以鐘基因的△Ct值為縱坐標,應用ChronoLab軟件獲取△Ct值波動的節(jié)律性參數(shù),并以方程F(t)=M+Acos(ωt+φ)進行余弦函數(shù)擬合,做出△Ct值的余弦節(jié)律波動圖(Bmal1見圖1,Per2見圖2)。通過余弦函數(shù)可知,OCI-LY8的Bmal1基因轉錄水平大致以24 h為波動周期,其峰時和谷時分別是ZT0和ZT12,Per2基因的轉錄水平大致以16 h為波動周期,其峰時和谷時分別是ZT12和ZT4;Hut-78細胞的Bmal1基因轉錄水平大致以8 h為波動周期,其峰時和谷時分別是ZT4和ZT8,Per2基因的轉錄水平大致以24 h為波動周期,其峰時和谷時分別是ZT12和ZT0;HL-60細胞Bmal1基因的轉錄水平大致以16 h為波動周期,其峰值時段和谷值時段分別位于ZT0和ZT8,Per2基因的轉錄水平大致以24 h為波動周期,其峰值時段和谷值時段分別位于ZT8和ZT20;Raji細胞Per2基因的轉錄水平大致以24 h為波動周期,其峰時和谷時分別是ZT12和ZT0。

圖1 Bmal1mRNA在OCI-LY8、Hut-78、HL-60細胞株中的晝夜表達節(jié)律

圖2 Per2 mRNA在Raji、OCI-LY8、Hut-78、HL-60細胞株中的晝夜表達節(jié)律

3 討論

隨著生物科學技術的發(fā)展,在90年代末和21世紀初,一批控制著生物節(jié)律的基因被相繼發(fā)現(xiàn),并命名為生物鐘基因,其中,哺乳動物中具有代表性的生物鐘基因有per、bmal、tim、clock基因等[6]。近年有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與生物鐘基因的關系非常密切[7]。鐘基因具有調控細胞周期控制基因,抑制原癌基因,調控DNA損傷修復基因等作用[8],而鐘基因的失活將導致上述基因失去周期節(jié)律性控制而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9]。

目前研究顯示,腫瘤細胞擁有與宿主不同的生物鐘節(jié)律表達[10],所以在節(jié)律中樞視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)的調節(jié)下,表現(xiàn)出了和宿主正常細胞所不一樣的細胞代謝生長節(jié)律特點。流行病學調查顯示生物鐘節(jié)律的紊亂與腫瘤的發(fā)病率有較大的相關性[11]。研究并揭示腫瘤細胞內生物鐘基因的表達規(guī)律,有利于我們更好地理解腫瘤的發(fā)病機制,并利用腫瘤細胞的生物鐘節(jié)律,為時辰治療提供理論數(shù)據。

近年來研究報道核心生物鐘基因Bmal1與Per2與多種腫瘤的發(fā)生密切相關[12]。目前國內外尚未見有關Bmal1和Per2在血液系統(tǒng)腫瘤細胞內表達規(guī)律的研究報道。本研究以4種血液腫瘤細胞株為研究對象,通過RT-PCR法定時檢測Bmal1 mRNA和Per2 mRNA 24小時內的轉錄水平變化,以揭示Bmal1與Per2在不同血液腫瘤細胞中的表達規(guī)律。由于體外培養(yǎng)條件下腫瘤細胞內生物基因轉錄水平較低且晝夜波動現(xiàn)象不明顯,為了進行體外培養(yǎng)條件下細胞內生物鐘基因表達規(guī)律的研究,需對細胞節(jié)律進行統(tǒng)一誘導。本研究采用血清休克法誘導Bmal1 mRNA及Per2 mRNA節(jié)律表達,經RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Per2在4種細胞內均呈節(jié)律性表達,Bmal1僅在OCI-LY8、Hut-78、HL-60細胞內呈節(jié)律性表達,多數(shù)表現(xiàn)為超日節(jié)律(<20 h),Raji細胞內Bmal1表達水平未見明顯周期性變化。進一步對比分析發(fā)現(xiàn),不同細胞來源的腫瘤細胞具有不同的表達周期規(guī)律。

早在1985年,William Hrushesky等就報道過腫瘤細胞對抗癌藥物具有一定的時間敏感性,表現(xiàn)為腫瘤細胞在某一時間內對抗癌藥物相對敏感,而另一時間則相對不敏感[13]。因此,以生物節(jié)律理論為基礎的時辰治療可以增加化療藥物療效、減輕藥物相關的毒副作用,是一種新的腫瘤治療策略,并已在臨床試驗中取得顯著的療效[14]。本研究充分揭示了調控生物節(jié)律的核心鐘基因Bmal1和Per2在4種不同血液腫瘤細胞中的表達節(jié)律,進一步研究在不同鐘基因表達量的時間點上細胞對藥物的不同敏感性,可為個體化治療及不同時點用藥提供理論基礎。