沉默miR-572經(jīng)鐵死亡在腎癌細(xì)胞凋亡、索拉非尼耐藥中的作用機(jī)制

潘亮 暢雅學(xué) 段萬(wàn)里 鄧騫

腎癌是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤性疾病,占成人惡性腫瘤的2%～3%,此病患者主要癥狀包括血尿、腰痛和腹部包塊等,對(duì)患者日常生活造成一定影響[1-2]。miRNAs是近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)之一,是一種長(zhǎng)度21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼基因,在人類基因組中可以序列特殊性方式調(diào)節(jié)30%～60%蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[3]。鐵死亡的出現(xiàn)與疾病的發(fā)生、發(fā)展及嚴(yán)重程度具有緊密的聯(lián)系,在多種疾病的進(jìn)展中均會(huì)起到一定的調(diào)控作用。研究表明,鐵死亡能夠作為困擾全球健康的腎癌抑制靶點(diǎn),為其治療方式及患者預(yù)后的改善情況開辟新的研究方向[4]。索拉非尼是治療腎癌的有效藥物治療,但因過(guò)度用于臨床且服藥周期較長(zhǎng),一些患者在使用過(guò)程中出現(xiàn)耐藥,導(dǎo)致療效不顯著,如何很好的改善索拉非尼耐藥是一個(gè)亟需解決的問(wèn)題[5]。本文主要探究miR-572經(jīng)鐵死亡在腎癌細(xì)胞凋亡、索拉非尼耐藥中的作用,對(duì)改善腎癌患者治療效果及預(yù)后具有重要意義,報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人腎癌細(xì)胞系786-0購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑:miR-572過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、miR-572 siRNA由廣州威佳科技有限公司合成;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司(貨號(hào):ZQ-100);p53抗體、SAT1抗體購(gòu)于上?？泼羯锟萍加邢薰?貨號(hào):bsm-33058M、bs-17244R)。(3)主要儀器:光學(xué)顯微鏡購(gòu)于北京億誠(chéng)恒達(dá)科技有限公司(貨號(hào):Contour Elite);熒光定量PCR儀購(gòu)于武漢益普生物科技有限公司(貨號(hào):CG-05)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將腎癌細(xì)胞放置于含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)、1%谷氨酰肽的DMEM培養(yǎng)基中并放置于含5% CO237℃細(xì)胞培養(yǎng)箱溫箱中,根據(jù)其生長(zhǎng)情況2～3 d傳代或換液1次,當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí),使用胰蛋白酶消化傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞,將其分為空白組(不做處理)、過(guò)表達(dá)組(腎癌細(xì)胞+miR-572過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)、沉默組(腎癌細(xì)胞+miR-572 siRNA)3組,每組2個(gè)復(fù)孔且分別加入100 μL 1×105個(gè)/mL細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液,當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),在空白組、過(guò)表達(dá)組、沉默組分別加入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液做空白處理,miR-572 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、Lipofectamine 2000試劑行過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染,miR-572 siRNA、Lipofectamine 2000試劑行沉默轉(zhuǎn)染。

1.2.3 miR-572表達(dá)量:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-572表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)步驟:腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功,Trizol法提取細(xì)胞中總RNA,應(yīng)用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,GAPDH為內(nèi)參,提取細(xì)胞總RNA。miR-572引物序列:miR-572上游引物:5’-GTCCGCTCGGCGGTGGCCCA-3’,miR-572下游引物:5’-UGGGCCACCGCCGAGCGGAC-3’,設(shè)計(jì)引物反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 5 min:94℃ 20 s,56℃ 20 s;72℃ 1 min,40個(gè)循環(huán),2-ΔΔCt計(jì)算miR-572表達(dá)量。

1.2.4 腎癌細(xì)胞凋亡:采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎癌細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)48 h,收集腎癌細(xì)胞,PBS洗滌2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL,70%冷乙醇固定,4℃過(guò)夜,PBS洗滌3次,再離心,去掉上清液及乙醇,并用Annexin V-FITC室溫避光條件孵育15 min,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.2.5 腎癌細(xì)胞索拉非尼耐藥:以人腎癌細(xì)胞系786-0為誘導(dǎo)對(duì)象,索拉非尼為誘導(dǎo)藥物,索拉非尼起始濃度為2.5 μmol/L,在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,待786-0細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80 %并且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí),換成1 %雙抗、10 %胎牛血清,2.5 μmol/L索拉非尼的1640培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),開始耐藥篩選。每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋瓶底約90 %左右時(shí)按1∶2進(jìn)行傳代并凍存細(xì)胞以備使用。2.5 μmol/L索拉非尼作用細(xì)胞傳代大約15代左右并且細(xì)胞能夠在該濃度藥物作用下穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代后,增加藥物濃度至5 μmol/L繼續(xù)篩選。每次在同一藥物濃度下作用細(xì)胞大約傳代15代左右穩(wěn)定后增加藥物濃度,采用低濃度梯度法,分別以2.5、5、7.5、10 μmol/L的濃度梯度培養(yǎng)細(xì)胞,每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)72 h后,再加入CCK8試劑(10 μL/孔),培養(yǎng)1 h后,以空白組為對(duì)照,測(cè)定每組OD450值,以藥物濃度為橫軸,OD450值為縱軸,繪制濃度-效應(yīng)曲線,確定半數(shù)抑制濃度(IC50),實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次;用固定的索拉非尼濃度(4.91 μmol/L)處理每組細(xì)胞,CCK8法檢測(cè)索拉非尼對(duì)腎癌細(xì)胞IC50值(IC502),采用IC501/IC502結(jié)果判定腎癌細(xì)胞索拉非尼耐藥,其中值越大則說(shuō)明能力越強(qiáng)。

1.2.6 p53-SAT1-ALOX15信號(hào)通路蛋白表達(dá)量:采用Western blot法檢測(cè)p53-SAT1-ALOX15信號(hào)通路蛋白表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)步驟:使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量,120℃,10 min,電泳凝膠分離,將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到PVDF膜上,溫室封閉2 h,加一抗,4℃下室溫孵育過(guò)夜,漂洗3次,15 min/次,加二抗,1 h室溫孵育,反復(fù)漂洗3次,15 min/次,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 3組miR-572表達(dá)量比較 沉默組miR-572表達(dá)量低于空白組,過(guò)表達(dá)組miR-572表達(dá)量高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);沉默組miR-572表達(dá)量低于過(guò)表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組miR-572表達(dá)量比較

2.2 3組腎癌細(xì)胞凋亡比較 沉默組24 h、48 h腎癌細(xì)胞凋亡率高于空白組,過(guò)表達(dá)組24 h、48 h腎癌細(xì)胞凋亡率低于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);沉默組24 h、48 h腎癌細(xì)胞凋亡率高于過(guò)表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 腎癌細(xì)胞流式細(xì)胞凋亡圖

表2 3組腎癌細(xì)胞凋亡比較

2.3 3組腎癌細(xì)胞IC50相對(duì)值比較 沉默組IC50相對(duì)值低于空白組,過(guò)表達(dá)組IC50相對(duì)值高于空白組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);沉默組IC50相對(duì)值低于過(guò)表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組腎癌細(xì)胞IC50相對(duì)值比較

2.4 3組p53-SAT1-ALOX15信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較 沉默組p53、SAT1、ALOX15蛋白表達(dá)量高于空白組,過(guò)表達(dá)組p53、SAT1、ALOX15蛋白表達(dá)量低于空白組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);沉默組p53、SAT1、ALOX15蛋白表達(dá)量高于過(guò)表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4,圖2。

圖2 p53-SAT1-ALOX15信號(hào)通路蛋白WB圖

表4 3組p53-SAT1-ALOX15信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

3 討論

據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),腎癌多發(fā)于50～70歲人群,近年來(lái),我國(guó)此病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì),城市地區(qū)發(fā)病率高于農(nóng)村地區(qū),男性多于女性,男女患者比例約為2∶1[6-7]。目前臨床上對(duì)于腎癌的病因尚未明確,認(rèn)為此病的發(fā)生可能與遺傳、吸煙、肥胖、高血壓等因素密切相關(guān)[8]。眾多研究顯示,miRNAs對(duì)多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為具有調(diào)控作用,進(jìn)而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9]。李玖玲等[10]研究顯示,miR-299-3p在腎癌中可通過(guò)調(diào)控腎癌細(xì)胞EMT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量,進(jìn)而對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等產(chǎn)生影響。miR-572在近年來(lái)被證實(shí)與多種癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明,miR-572在腎癌中呈高表達(dá),可能通過(guò)參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等,有望成為腎癌預(yù)后的一種標(biāo)志物[11-12]。本研究表明,miR-572表達(dá)異常與腎癌細(xì)胞凋亡、索拉非尼耐藥密切相關(guān),有望成為腎癌早期診斷及術(shù)后檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn),對(duì)腎癌的診斷和治療及預(yù)后具有重要意義。

臨床研究顯示,惡性腫瘤細(xì)胞可通過(guò)凋亡這種無(wú)害的方式被清除,進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起抑制作用[13-14]。本文采用miR-572過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、miR-572 siRNA對(duì)腎癌細(xì)胞分別過(guò)表達(dá)和沉默其表達(dá),進(jìn)而研究miR-572對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,沉默miR-572可有效促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡,為揭示腎癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的理論依據(jù);但本研究并未涉及miR-572對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等方面的探究,存在一定局限性。索拉非尼一方面可通過(guò)作用多種信號(hào)通路,對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵調(diào)控作用;另一方面則通過(guò)阻斷新生腫瘤血管形成,阻滯腫瘤發(fā)展[15]。鮑一等[16]認(rèn)為,索拉非尼耐藥是由基因改變引起的,研究表明CXCR4與索拉非尼耐藥呈線性相關(guān)。本研究采用IC50相對(duì)值檢測(cè)各組腎癌細(xì)胞索拉非尼耐藥,結(jié)果表明沉默miR-572可有效降低IC50相對(duì)值,進(jìn)而降低索拉非尼耐藥,提高腎癌細(xì)胞靶向治療的效果;但本研究并未對(duì)miR-572在索拉非尼耐藥中的具體機(jī)制進(jìn)行探究,存在一定局限性。

鐵死亡是一種新的以鐵依賴性的過(guò)氧化物集聚為特征的程序性細(xì)胞死亡方式,亦是區(qū)別于典型的凋亡和其他程序性死亡的新型系細(xì)胞死亡模式,目前已成為生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[17]。p53-SAT1-ALOX15信號(hào)通路中p53是目前已知的重要抑癌基因,可介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、衰老、凋亡等,近年來(lái)研究表明,p53在細(xì)胞代謝、氧化反應(yīng)和鐵營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞死亡中具有新作用[18]。p53在腫瘤細(xì)胞鐵死亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高,可減少胱氨酸攝取、GSH合成,抑制對(duì)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4活性,最終誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡[19]。有研究顯示,SAT1是一種限速酶,由多胺分解代謝產(chǎn)生,其是p53的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn),若其表達(dá)上調(diào)則可誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化,細(xì)胞在活性氧誘導(dǎo)的應(yīng)激下發(fā)生鐵下垂,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞鐵死亡產(chǎn)生調(diào)控作用[20-21]。鐵死亡在疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療中的臨床意義已逐漸顯現(xiàn),本研究表明,沉默miR-572可能通過(guò)上調(diào)p53、SAT1、ALOX15蛋白表達(dá)量,激活p53-SAT1-ALOX15信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡,阻滯腎癌發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述,本研究表明,沉默miR-572可能通過(guò)上調(diào)p53、SAT1、ALOX15蛋白表達(dá)量,激活p53-SAT1-ALOX15信號(hào)通路,進(jìn)而激活鐵死亡,促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡,抑制索拉非尼耐藥,有望成為腎癌治療潛在新靶點(diǎn)。